Sự sai khác về trình tự nucleotide trong gen cystatin ở một số dõng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo của giống lạc L18

Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 133 SỰ SAI KHÁC VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE TRONG GEN CYSTATIN Ở MỘT SỐ DÕNG LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CỦA GIỐNG LẠC L18 Phạm Tuấn Oanh1, Vũ Thị Thu Thuỷ1, Nguyễn Thị Tâm1, Chu Hoàng Mậu2* 1Trường ĐH Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, 2Đại học Thái Nguyên TÓM TẮT Phytocystatin (PhyCYSs) là chất ức chế cysteine proteinase ở thực vật. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytocystatin có liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật dƣới tác động bất lợi của các nhân tố môi trƣờng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự của gen cystatin đƣợc tách từ lá non của hai dòng lạc RM46 và R44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc của giống lạc L18 (Arachis hypogaea L.). Gen cystatin của dòng RM46 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hƣởng của chiếu xạ kết hợp xử lý mất nƣớc) và dòng R44 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc) đều có 461 nucleotide, chứa 2 exon và 1 intron. Vùng mã hóa của gen cystatin gồm 279 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide dài 98 amino acid. Có 11 vị trí nucleotide sai khác trong gen cystatin của dòng RM46 và R44 với giống gốc L18 và các trình tự của lạc đã công bố trên GenBank. Dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hƣởng của chiếu xạ kết hợp chịu xử lý mất nƣớc (RM46) có 9 vị trí sai khác so với giống gốc và có quan hệ di truyền gần hơn với giống chịu hạn tốt. Dòng R44 có hai vị trí nucleotide sai khác so với giống gốc, đồng thời sai khác 1 amino acid trên chuỗi polypeptide, tuy nhiên chƣa xác định đƣợc sự sai khác này với khả năng chống chịu hạn. Gen cystatin của RM46 và R44 là thành viên của nhóm I của phân họ phytocystatin. Từ khóa: Cây lạc, gen cystatin, mất nước, mô sẹo, phytocystatin. MỞ ĐẦU* Lạc (Arachis hypogaea L.) là loại cây trồng họ đậu, có giá trị dinh dƣỡng cao, đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam. Trồng cây lạc vừa mang lại hiệu quả kinh tế, đồng thời có khả năng thâm canh, cải tạo đất. Ở Việt Nam, năng suất và sản lƣợng lạc không ổn định. Một trong những nguyên nhân chính ảnh hƣởng đến vấn đề này là sự biến đổi khí hậu toàn cầu theo xu hƣớng xa mạc hóa, gây hạn hán kéo dài ở nhiều nơi. Do đó, vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc những giống lạc có năng suất, chất lƣợng tốt và có khả năng chịu hạn, thích hợp với điều kiện thổ nhƣỡng và khí hậu ở nƣớc ta [2]. Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma đƣợc ứng dụng có hiệu quả trong chọn tạo các giống cây trồng. Tế bào nuôi cấy in vitro có tỷ lệ biến dị cao (10-5 – 10-8), đa dạng về kiểu gen và kiểu hình. Do đó, có thể tiến hành chọn lọc những dòng tế bào khác nhau và nghiên cứu ảnh hƣởng của các tác nhân bất lợi lên thực vật ở các mức độ khác nhau (gen, tế bào, mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập cây hoàn chỉnh). Tính ƣu việt của kỹ thuật này đã đƣợc khẳng định trên cây lúa [1]. Đối với cây lạc, theo * Tel: 0913383289; Email: mauchdhtn@gmail.com hƣớng chọn dòng chịu hạn nhóm tác giả Vũ Thị Thu Thủy (2009, 2011) đã xử lý mô sẹo bằng cách gây mất nƣớc và chiếu xạ kết hợp với gây mất nƣớc chọn đƣợc một số dòng cây xanh từ giống lạc L18. Các dòng lạc chọn lọc đƣợc trồng và đánh giá qua nhiều thế hệ, kết quả đánh giá đã tuyển chọn và phân loại các dòng theo nhóm có triển vọng về năng suất, chất lƣợng hạt và có khả năng chống chịu hạn [5]. Phytocystatin (PhyCYSs) là chất ức chế cysteine proteinase ở thực vật. Gần đây, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phytocystatin có liên quan đến khả năng chống chịu của thực vật dƣới tác động bất lợi của các nhân tố môi trƣờng, giúp cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh [7], [12], [18]. Công bố đầu tiên về cystatin có nguồn gốc thực vật là cystatin của lúa (Oryzacystatin-I) [6] và cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về phân lập, biểu hiện gen cystatin đƣợc công bố ở thực vật một và hai lá mầm: ngô [12]; đậu tƣơng [19]; đậu xanh [9]; lạc [14], [15], [16], [17]. Để tiếp tục hƣớng nghiên cứu chọn lọc các dòng cây lạc mang các tính trạng mong muốn, chúng tôi tiến hành phân lập và so sánh trình tự gen cystatin của hai dòng lạc RM46 và R44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc và xử lý chiếu xạ của giống lạc L18. Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 134 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Giống lạc L18 có nguồn gốc từ Trung Quốc, do Trung tâm Nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây lƣơng thực và cây thực phẩm thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam nhập nội năm 2004. Giống L18 có năng suất cao, chịu thâm canh, có khả năng kháng sâu, nhƣng chịu hạn kém. Dòng lạc R44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý mất nƣớc liên tục trong 9 giờ. Dòng lạc RM46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ 2 krad kết hợp với xử lý mất nƣớc liên tục trong 9 giờ. Hai dòng lạc RM46 và R44 có nguồn gốc từ mô sẹo của giống L18 chịu mất nƣớc ở thế hệ thứ Năm. Phương pháp - Tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg (1991) [8] có cải tiến. - Gen cystatin đƣợc phân lập bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, Cys Ara F/Cys Ara R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen cystatin lạc (Arachis hypogaea L.) đƣợc tác giả Yan và đtg (2004) công bố tại Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số AY722693 [17]. Mồi đƣợc tổng hợp tại hãng Invitrogen. CysAraF 5’ATGGCAGCAGTGGGTGCA 3’ CysAraR 5’ TTAAGCATTGGAGCCATCAC 3’ Thành phần phản ứng PCR nhân gen cystatin gồm: PCR master mix 12,5μl; DNA templet (50ng/μl) 2 μl; CysAra F (10pmol/μl ) 2 μl; CysAra R (10pmol/μl ) 2 μl; Nƣớc khử ion 6,5 μl. Hỗn hợp đƣợc thực hiện với 30 chu kỳ phản ứng, các giai đoạn gồm 94°C/3 phút; 94°C/30 giây; 56°C/1 phút; 72°C/1 phút; 72°C/10 phút và sản phẩm đƣợc lƣu giữ ở 4°C. - Tách dòng gen: Tách dòng gen theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell (2001) [13]. - Trình tự của gen cystatin đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyner (Applied Biosystem) tại Viện Công nghệ sinh học. Kết quả đọc trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm Lasergene và BioEdit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhân gen cystatin Lá non cây lạc đƣợc sử dụng để tách chiết DNA tổng số với CTAB. Sau khi tách chiết DNA tổng số đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và đo độ sạch trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm/ 280nm. Kết quả nhận đƣợc DNA tổng số có chất lƣợng tốt, hàm lƣợng đủ lớn đảm bảo tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Sản phẩm PCR nhân gen cystatin với cặp mồi CysAra F và CysAra R từ DNA tổng số đƣợc phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả ở hình 1 cho thấy, gen đƣợc nhân là 1 đoạn DNA có kích thƣớc phân tử khoảng gần 500bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen cystatin của giống lạc L18 mà tác giả Vũ Thị Thu Thủy đã phân lập và công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế với mã số FN811133 [14]. Vì vậy, chúng tôi cho rằng gen cystatin của hai dòng lạc RM46, R44 đã đƣợc nhân bản. Để khẳng định điều này, chúng tôi tiến hành tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của hai dòng lạc này và so sánh với các trình tự gen cystatin cây lạc đã đƣợc công bố. Hình 1. Kết quả nhân gen cystatin của dòng RM46 và R44 Kết quả tách dòng gen cystatin Sản phẩm PCR của gen cystatin đƣợc tinh sạch theo bộ Kit AccuPrep PCR Purification của hãng Bioneer. Gen tinh sạch đƣợc gắn 461 bp RM46 R44 M 250 bp 500 bp Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 135 vào vector tách dòng pTZ57R/T, biến nạp vào tế bào khả biến của chủng E.coli DH5α bằng cách sốc nhiệt. Nhân dòng trên môi trƣờng LB lỏng, sau đó cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicilin 100 mg/ml, X-gal 40 mg/ml và IPTG 100 μM. Ủ đĩa petri trong 16 giờ ở 37°C. Kết quả thu đƣợc cả khuẩn lạc xanh và trắng trên môi trƣờng LB đặc. Tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn đều trên môi trƣờng cấy chuyển sang môi trƣờng LB lỏng (10g peptone + 5g yeast extract + 10g NaCl + nƣớc cất vừa đủ 1 lit) có bổ sung ampicilin nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Lựa chọn một số dòng vi khuẩn tái tổ hợp để kiểm tra bằng phản ứng colony- PCR. Sản phẩm colony-PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 2). Hình 2. Kết quả colony – PCR gen cystatin của dòng RM46 và R44 Hình 3. Kết quả cắt plasmid bằng EcoRI và BamHI Kết quả ở hình 2 cho thấy gen cystatin của hai dòng lạc có kích thƣớc đúng nhƣ dự tính. DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc tách bằng bộ kit của hãng BIONEER (AccuPrep™ Plasmid Mini Extraction Kit). Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng phản ứng cắt với 2 enzyme là EcoRI và BamHI. Kết quả thể hiện ở hình 3 cho thấy, sản phẩm phân cắt thành 2 băng DNA tƣơng ứng với phần vector dài 2886 bp và đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp. Nhƣ vậy có thể kết luận là chúng tôi đã tách chiết đƣợc plasmid tái tổ hợp có chứa gen cystatin. Kết quả xác định trình tự gen cystatin Trình tự của gen cystatin đƣợc xác định từ plasmid trên máy đọc trình tự nucleotide tự động. Xử lý kết quả thu đƣợc bằng phần mềm Lasergene nhận đƣợc gen cystatin của hai dòng lạc có kích thƣớc 461 bp. Gen cystatin của lạc gồm 2 exon và 1 intron, đoạn exon 1 gồm 102 nucleotide bắt đầu từ vị trí 1 đến 102 và đoạn exon 2 có 195 nucleotide, từ vị trí 267 đến 461; đoạn intron ở giữa có 164 nucleotide, từ vị trí 103 đến 266. So sánh trình tự nucleotide của 2 gen cystatin phân lập đƣợc với 3 trình tự nucleotide của gen cystatin lạc đã công bố trên GenBank, kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 4. 461 bp 2886 bp 500 bp 250bp 500 bp M RM46 R44 M RM46 R44 Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 136 10 20 30 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A R44 A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A FN811133 A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A FR691053 A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A FR745399 A T G G C A G C A G T G G G T G C A C C T C G C G A A G T A 40 50 60 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G C T G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T R44 G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T FN811133 G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T FR691053 G C T G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T FR745399 G C C G G A A A C G A G A A C A G C C T C G A G A T C G A T 70 80 90 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A A C A C R44 A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T C G A T G A A C A C FN811133 A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T C G A T G A A C A C FR691053 A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A A C A C FR745399 A G T C T T G C T C G C T T T G C T G T T G A T G A C A C A 100 110 120 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T T G R44 A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T A C FN811133 A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T A C FR691053 A A C A A G A A A C A G G T T T C T T T C T C T C T C T T G FR745399 A C A A G A A A C A G G G T T T C T T T C T C T C T C T A G 130 140 150 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 C G A A G A T C G C T T T C G C T T T G G T T T T G G T T C R44 C G A T C A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C FN811133 C G A T C A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C FR691053 C G A A G A T C G C T T T C G C T T T G G T T T T G G T T C FR745399 C G A A G A T C G C T T T G G C T C T G G T T T T G G T T C 160 170 180 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G T T T T G T G T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C R44 G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C FN811133 G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C FR691053 G T T T T G T G T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C FR745399 G T T T T G T A T G A T T G A T C A T G A T T A G T G T T C 190 200 210 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G R44 G A T T T T G A T T T A A T C T T A A A A T A A T T T G G G FN811133 G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G FR691053 G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G FR745399 G A T T T T G A T T T A A T T T T A A A A T A A T T T G G G Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 137 220 230 240 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C R44 T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C FN811133 T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C FR691053 T G G T T G T T T T G G A T T T T T A T C T A A T G T G A C FR745399 T T G T T G T C T T G G A T T T T T A T C T A A T G T A A C 250 260 270 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G R44 G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G FN811133 G A A T T A A A T T G G G A A T G A T G A T G C A G A A T G FR691053 G A A T T A A A T T G G G A A T G A T C A T G C A G A A T G FR745399 G A A T T A A A T T G G G A A T G A T C A T G C A G A A T G 280 290 300 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G R44 G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G FN811133 G C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G FR691053 C C C T T C T T G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G FR745399 C C C T T C T C G A G T T T A A G A G G G T T A T A A G T G 310 320 330 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C R44 C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C FN811133 C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C FR691053 C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C C T T G C FR745399 C T A A G C A G C A A G T T G T T G C T G G G A C T T T G C 340 350 360 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G R44 A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G A G G T G FN811133 A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G FR691053 A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G FR745399 A C C A C A T C A C T T T G G A G G C A G C A A G T G G T G 380 390 370 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T R44 A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T FN811133 A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T FR691053 A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T T T FR745399 A T A G T A A G A A T G T T T A T G A A G C C A A G G T G T 400 410 420 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G R44 G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G FN811133 G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G FR691053 G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G FR745399 G G G A A A A G C C A T G G A T G A A C T T C A A G G A G G Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 138 430 440 450 ------------------+-------------------+-------------------+- RM46 T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T R44 T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T FN811133 T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T FR691053 T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T FR745399 T T C A G G A G T T C A A G C T T G C T G G T G A T G G C T 460 ------------------+--- RM46 C C A A T G C T T A A R44 C C A A T G C T T A A FN811133 C C A A T G C T T A A FR691053 C C A A T G C T T A A FR745399 C C A A T G C T T A A Hình 4. So sánh trình tự nucleotide của gen cystatin phân lập từ dòng lạc RM46 và R44 với trình tự gen cystatin lạc trên GenBank Kết quả nghiên cứu trên hình 4 so sánh trình tự đầy đủ của gen cystatin dòng RM46 và R44 với 3 trình tự gen cystatin lạc. Trong đó, mã số FN811133 là trình tự gen cystatin của giống lạc L18 [14], FR691053 là trình tự gen cystatin của giống lạc L23 [16] và FR745399 của dòng lạc RM48 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô của giống lạc L18 [15]. Các vị trí đóng khung trong hình 3 thể hiện sự sai khác của các nucleotide trên gen cystatin của hai dòng lạc nghiên cứu và các trình tự đã công bố. Tổng số vị trí sai khác về trình tự nucleotide của hai dòng RM46 và R44 so với giống gốc L18 là 11, trong đó 3 vị trí nằm trong exon và 8 vị trí nằm trong intron. Dòng RM46 có 9 vị trí sai khác, 2 vị trí nằm trong exon và 7 vị trí nằm trong intron. Dòng R44 có 2 vị trí sai khác, thuộc vùng intron có 1 vị trí và 1 vị trí nằm trong exon. Trình tự gen cystatin của hai giống đậu xanh khác nhau về khả năng chịu hạn đều có kích thƣớc 1115 nucleotide, kết quả so sánh nhận đƣợc sự sai khác ở 3 vị trí nằm trong intron, không có sự sai khác ở exon [3]. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen cystatin xuất hiện nhiều hơn ở các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý so với giống gốc, mức độ xử lý khác nhau làm xuất hiện số lƣợng đột biến khác nhau. Sự sai khác nằm ở cả intron và exon [4]. Kết quả nghiên cứu chứng tỏ mô sẹo chịu xử lý có sự gia tăng về tần số đột biến so với giống gốc. Trên cơ sở sự sai khác về nucleotide của gen cystatin chúng tôi thiết lập mối quan hệ di truyền về gen cystatin cây lạc. Kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 1 và hình 5. Bảng 1 cho thấy, độ tƣơng đồng về gen cystatin của hai dòng lạc với các trình tự đã công bố dao động từ 95,2% đến 99,6%, độ sai khác từ 0,4% đến 4,9%. Gen cystatin của dòng RM46 có độ sai khác so với giống gốc L18 là 2,0%. Gen cystatin của dòng R44 sai khác so với giống L18 là 0,4%. Bảng 1. Độ tƣơng đồng và độ sai khác của trình tự gen cystatin dòng lạc RM46 và R44 với trình tự gen cystatin công bố trên Genbank Độ tƣơng đồng Độ sai khác 1. RM46 2. R44 3. FN811133 4. FR691053 5. FR745399 Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 139 Hình 5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của dòng lạc RM46 và R44 với 3 trình tự gen cystatin đã công bố trên GenBank Sơ đồ ở hình 4 cho thấy gen cystatin của lạc phân thành 2 nhóm chính. Nhóm I gồm 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 1 gồm dòng RM46 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp xử lý mất nƣớc) và gen đã công bố với mã số FR691053 (giống L23, giống có khả năng chịu hạn cao). Nhóm phụ 2 là dòng R44 và gen mã số FN811133 (giống lạc L18). Nhóm II chỉ có dòng RM48 (mã số FR745399). Dòng RM46 biến đổi tạo quan hệ gần với giống có khả năng chịu hạn cao (L23) là gợi ý để chúng tôi nghiên cứu mối quan hệ của gen cystatin với khả năng chịu hạn ở cây lạc. Gen cystatin phân lập đƣợc có sự thay đổi vị trí nucleotide ở exon là lý do để chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid của protein cystatin của dòng RM46 và R44 với 4 trình tự acid amin đã công bố trên GenBank, kết quả thể hiện ở hình 6. 10 20 30 ------------------+-------------------+------------------- +- RM46 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H R44 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H AY722693 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H FR745399 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D D T FN811133 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H FR691053 M A A V G A P R E V A G N E N S L E I D S L A R F A V D E H 40 50 60 ------------------+-------------------+------------------- +- RM46 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L R44 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L AY722693 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FR745399 T R N R N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FN811133 N K K Q N G L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L FR691053 N K K Q N A L L E F K R V I S A K Q Q V V A G T L H H I T L 70 80 90 ------------------+-------------------+------------------- +- RM46 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K R44 E A A R G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K AY722693 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FR745399 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FN811133 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K FR691053 E A A S G D S K N V Y E A K V W E K P W M N F K E V Q E F K ------------------ RM46 L A G D G S N A R44 L A G D G S N A Nucleotide Substitutions (x100) 0 2.4 2 RM46 FR691053 R44 FN811133 FR745399 Phạm Tuấn Oanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 133 - 141 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 140 AY722693 L A G D G S N A FR745399 L A G D G S N A FN811133 L A G D G S N A FR691053 L A G D G S N A Hình 6. So sánh trình tự amino acid của dòng lạc RM46 và R44 với 4 trình tự công bố trên GenBank Trình tự amino acid thu đƣợc của các dòng lạc gồm 98 amino acid, có vùng bảo thủ L 22 A 23 R 24 F 25 A 26 V 27 và Q 49 V 50 V 51 A 52 G 52 . Dòng RM46 có hai vị trí sai khác nằm trong exon nhƣng không làm sai khác trình tự amino acid. Dòng R44 có 1 sai khác amino acid ở vị trí 64 (Serine64 đƣợc thay bằng Arginine 64), tuy nhiên chƣa tìm thấy mối liên hệ nào của sự sai khác amino acid với khả năng chịu hạn. Đối chiếu với kết quả công bố của Marcia và đtg (2008) [10] và Martinez và đtg (2008) [11] chúng tôi đã xác định gen cystatin phân lập đƣợc từ dòng RM46 và R44 thuộc nhóm I trong phân họ cystatin thực vật (phytocystatin). KẾT LUẬN Trình tự nucleotide của gen cystatin của dòng lạc RM46 và R44 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc của giống lạc L18 có sự sai khác so với giống gốc. Có 11 vị trí nucleotide sai khác, trong đó dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hƣởng của chiếu xạ kết hợp xử lý mất nƣớc (RM46) có 9 vị trí khác biệt so với giống gốc và có quan hệ di truyền gần hơn với giống chịu hạn tốt. Dòng R44 có 2 vị trí nucleotide sai khác với giống gốc, đồng thời có sự sai khác 1 amino acid trên phân tử protein. Độ sai khác của hai dòng lạc so với giống gốc từ 0,4% đến 2,0% . TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, (1998),Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở lúa, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr. 1 – 57, 154 – 165 [2]. Đƣờng Hồng Dật, (2007), Cây lạc và biện pháp thâm canh nâng cao hiệu qủa sản xuất. Nxb Thanh Hóa, 5 – 80. [3]. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Thu Trang, (2008), "So sánh trình tự gien cystatin ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)". Tạp chí Sinh học. [4]. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), "Nghiên cứu đặc điểm trình tự gien cystatin của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ và xử lý mất nƣớc". Tạp chí Sinh học, 33(1), 86-95 [5]. Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, (2011), "Chọn lọc dòng biến dị chịu mất nƣớc và chiếu xạ ở cây lạc". Tạp chí Công nghệ Sinh học, 93, 349-356. [6]. Abe K., Emori Y., Kondo H., Suzuki K., Arai K., (1993), Acession J03469, Rice cysteine proteinase inhibitor (oryzacystatin), complete cds, NCBI GenBank. [7]. Diop NN, Kidric M, Repellin A, Gareil M, d'Arcy-Lameta A, Pham Thi AT, Zuily-Fodil Y, (2004), "A multicystatin is induced by drought-stress in cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp.] leaves". FEBS Lett., 577(3):545-550. [8]. Gawel ADN Jarret., (1991): Genomic DNA Isolation [9]. tm/dna.htm. [10]. Kang S. J., Kim M.C., Yoo D. W. and Park K.S., (2002), Acession AF454396, Identification of cystatin in mungbean (Vigna radiata ). Genbank. [11]. Marcia M. P., Andreia C. T. Z., Guilherme L., Giancarlo P., Rogerio M., (2008), "Molecular evolution and diversification of plant cysteine proteinase inhibitors: New insights after the poplar genome", Molecular Phylogenentics and Evolution, 49: 355 – 349 [12]. Martinez M., Diaz-Mendoza M., Carrillo L., Diaz I., (2007), "Cacboxyl terminal extended phytocystatins are bifunctional inhibitors of papain and legumain cystein proteinase", FEBS Lett., 581: 2914- 2918. [13]. Massonneau A, Condamine P, Wisniewski J- P, Zivy M, Rogowsky PM., (2005) "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought", Biochim Biophys Acta, 1729:186–199. [14]. Sambrook J., Russell D. W., 2001: Molecular cloning: A laboratory manual 3 rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. [15]. Vu T. T. T., Nguyen T. V. T., Chu M. H. and Nguyen T. T., (2010), Accession FN811133, Arachis hypogaea cystatin gene 1, exon 1-2, GenBank. [16]. Vu,T.T.T., Nguyen,T.T., Chu,M.H. and Nguyen,T.T.V, (2010), Accession FR745399.1, Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L18, GenBank. [17]. Vu,T.T.T., Chu,M.H., Nguyen,T.T.V. and Nguyen,T.T, (2010), Accession FR691053.1, Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L23, GenBank. [18]. Yan Y., Wang L., Huang S., (2004), Accession AY722693, Arachis hypogaea cysteine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 141 [19]. proteinase inhibitor mRNA, complete cds, EMBL GenBank, . [20]. Zhang X, Liu S, Takano T., (2008), Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana, AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt, drought, oxidation and cold tolerance, Plant Mol Biol 68:131–143 [21]. Zhao,Y., Botella,M.A., Subramanian,L., Niu,X., Nielsen,S.S., Bressan,R.A. and Hasegawa,P.M., (2003), Accesion U51854, Glycine max cysteine proteinase inhibitor mRNA, partial cds, AMBL GenBank. SUMMARY DIFFERENCE OF NUCLEOTIDE SEQUENCE OF CYSTATIN GENE OF SOME LINES DERIVED FROM CALLUS TREATED WITH DEHYDRATION OF L18 PEANUT CULTIVAR Pham Tuan Oanh 1 , Vu Thi Thu Thuy 1 , Nguyen Thi Tam 1 , Chu Hoang Mau 2* 1College of Education - TNU, 2Thai Nguyen University Phytocystatin (PhyCYSs) is cysteine proteinase inhibitors in plants. Recently, studies have also suggested that phytocystatin are involved in responding to abiotic environmental stress. In this study, we presented results of amplification, splitting line and sequencing of cystatin genes which were isolated from leaves of two lines RM46 and R44 which derived from callus treated with dehydration of L18 peanut cultivar (Arachis hypogaea L.). The results of isolation showed that cystatin genes of RM46 and R44 had both size 461 nucleotides. Cystatin genes of the two lines contained two exons and one intron. The coding region of genes cystatin of RM46 and R44 comprised about 279 nucleotides, encoded a polypeptide chain of 98 amino acids. There were 11 different nucleotide positions on cystatin genes of RM46, R44 with L18 peanut cutivar that had been published on GenBank. Lines derived from callus treated with irradiation and dehydration (RM46) had nine different positions on cystatin gene in comparison with L18 peanut cutivar and had genetic relationship close to high drought-resistant cultivar. There were two different positions on cystatin gene and a different amino acid on protein molecules of R44 in comparison with L18 peanut cultivar, but there was not identified relation between different amino acid and drought resistance. Cystatin gene of RM46 and R44 was a member of the group I of phytocystatin. Key words: Callus, cystatin gene, dehydration, peanut, phytocystatin. * Tel: 0913383289; Email: mauchdhtn@gmail.com