Sự hiện diện và biểu hiện của gen ds-Red ở protocorm-like body chuyển gen của phong lan Dendrobium CV. Burana white - Nguyễn Hữu Hổ

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218 212 SỰ HIỆN DIỆN VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN Ds-Red Ở PROTOCORM-LIKE BODY CHUYỂN GEN CỦA PHONG LAN Dendrobium CV. BURANA WHITE Nguyễn Hữu Hổ1*, Huỳnh Nguyên Phát2, Lê Tấn Đức1, Trần Thị Ngọc Hà1, Nguyễn Hữu Tâm1,3 (1)Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)nguyenhuuho@itb.ac.vn (2)Đại học Khoa học tự nhiên, tp Hồ Chí Minh (3)Đại học Nebraska-Lincohn, Nebraska, Hoa Kỳ TÓM TẮT: Bốn dòng protocorm-like body (PLB) phong lan Dendrobium cv. Burana White mang gen mục tiêu Ds-Red tạo biểu hiện phát sáng đỏ đã được chọn tạo qua biến nạp bằng phương pháp bắn gen. PLB (để tối khoảng 3 tháng, có màu trắng), qua cắt nhỏ thành các cụm có kích thước 3-5 mm, được sử dụng như mô đích để bắn. Vi hạt vàng (0,9 m), bao bởi hỗn hợp plasmid (tỷ số Mol 3:1, theo thứ tự) giữa plasmid pITB-DsRED mang gen Ds-Red tạo phát sáng đỏ với plasmid pITB-BAR mang gen bar tạo tính kháng chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT), được bắn vào PLB bằng hệ thống BIO-RAD PDS-1000/He. Sau bắn gen 2 ngày, PLB được cấy chuyển qua nhiều chu kỳ chọn lọc trên môi trường Knudson C (với 1 mg/l BA) có chứa 1-3 mg/l PPT. Sự biểu hiện tạm thời của gen DsRed ở PLB (2 ngày sau bắn gen) đã được kiểm tra với kết quả dương tính. Sự hiện diện của các gen DsRed, bar đã được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với kết quả có sự hiện diện của các băng DNA tương ứng 350 bp và 500 bp. Biểu hiện phát sáng đỏ bền vững đã được kiểm tra, ghi nhận bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên/ánh sáng trắng và ghi nhận dưới ánh sáng vàng-xanh lục (yellow-green) (bước sóng khoảng 560 nm) qua quan sát PLB dưới kính hiển vi soi nổi gắn kính lọc đỏ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy protein DsRed là một chỉ thị thích hợp trong nghiên cứu biến nạp di truyền ở lan Dendrobium và hệ thống này có thể được sử dụng trong nghiên cứu cơ bản đặc biệt trong nghiên cứu thay đổi màu sắc hoa do sản phẩm của gen chuyển. Đây là kết quả nghiên cứu đầu tiên về biến nạp gen DsRed được thực hiện thành công trên lan Dendrobium đến giai đoạn tạo được PLB chuyển gen có khả năng phát ánh sáng đỏ rất mạnh. Từ khóa: Bắn gen, chuyển gen, Dendrobium, gen DsRed, phosphinothricin (PPT). MỞ ĐẦU Đến nay, các gen gfp, yfp, rfp thuộc nhóm gen mã hóa protein phát sáng (fluorencent protein gene) xanh lục, vàng, đỏ, theo thứ tự, từ sinh vật biển [2, 11, 12] đã được các nhà khoa học nghiên cứu trên nhiều khía cạnh như phân lập (isolation) và dòng hóa (cloning) gen; hợp nhất (integration) vào bộ gen sinh vật chủ qua biến nạp/tải nạp; biểu hiện (expression) và di truyền của gen ở thể biến nạp sang các thế hệ sau. Ở thực vật, gen phát sáng được nghiên cứu sử dụng để biến nạp phổ biến nhất là gen gfp và tiếp theo là gen rfp [2, 7]. Ngoài ra, còn có gen luc (từ động vật đom đóm) cũng đã được nghiên cứu biến nạp. Thuộc nhóm gen rfp, gen DsRed [phân lập từ bọt biển (marine sponge) Discosoma sp.] [5, 7] được xem như một gen chỉ thị (reporter) sống (vital) có tiềm năng lớn, đã được sử dụng nhiều trong nghiên cứu biến nạp di truyền trên động vật [6, 19, 20], thực vật [5, 7, 13, 14, 17, 18] và vi sinh vật [16]. Đối với nghiên cứu biến nạp di truyền ở thực vật, ngoài ưu điểm tương tự gen gfp là có thể quan sát sự phát sáng mà không cần hủy mẫu (non-destructive/non-invasive), gen DsRed còn có ưu điểm là tia sáng vàng- xanh lục dùng kích thích protein DsRED có khả năng xuyên thấu (penetration) mô sống tốt hơn tia UV và tia xanh lam dùng kích thích protein GFP; vì vậy, có thể dễ dàng ghi nhận ánh sáng đỏ hơn so với việc ghi nhận ánh sáng xanh lục phát ra từ mô chuyển gen gfp [12]. Ngoài ra, khi gen DsRed biểu hiện mạnh, có thể nhận thấy mô thực vật/động vật có màu hồng đỏ bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên [6, 13] và ưu điểm này, theo chúng tôi, có thể được khai thác trong nghiên cứu làm thay đổi màu sắc của mô thực vật có màu trắng, ví dụ mô cánh hoa, tương tự nghiên cứu tạo hoa cây trồng chứa protein GFP có khả năng phát sáng xanh lục (green fluorescent flower) [12]. Trên cơ sở ưu điểm và tiềm năng của gen Nguyen Huu Ho et al. 213 này như đã trình bày ở trên, trong công trình này, chúng tôi trình bày một số kết quả về nghiên cứu chuyển gen DsRed trước hết với tính chất là gen chỉ thị và hy vọng sản phẩm protein của gen này có thể sẽ tạo thay đổi ít nhiều màu sắc hoa của đối tượng phong lan thí nghiệm Dendrobium, từ trắng sang hồng. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Sử dụng giống phong lan thương mại Dendrobium cv. Burana White (có hoa màu trắng) được cung cấp bởi Vũ Ngọc Phượng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới. Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô Môi trường nuôi, nhân protocorm-like body (PLB) dùng chuyển gen (môi trường số 1) gồm Knudson C [9] có 1 mg/l BA và 10% (v/v) nước dừa; điều kiện nuôi cấy tối, nhiệt độ 25-28oC. Môi trường tạo vươn chồi từ PLB (môi trường số 2, với thành phần khoáng như trên) không chất điều hòa sinh trưởng, 10% (v/v) nước dừa; điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng khoảng 3.000 lux, nhiệt độ như trên. Quy trình chuyển gen Plasmid dùng chuyển gen Sử dụng hai loại plasmid pITB-DsRED mang gen DsRed có promoter CVMV (Cassava vein mosaic virus) và plasmid pITB-BAR mang gen bar (kháng chất trừ cỏ) có promoter CaMV35S do chúng tôi thiết kế. Hai loại plasmid này được phối hợp, theo thứ tự, với tỷ lệ Mol 3:1 để bọc vi hạt bắn. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA plasmid dùng bắn gen từ hai dòng vi khuẩn E. coli biến nạp mang hai loại plasmid nói trên được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn ở bộ kit của công ty QIAGIEN (QIAquick Gel Extraction Kit, 2011). Thiết bị bắn gen, điều kiện bắn gen Sử dụng hệ thống BIO-RAD Particle Delivery System 1000/He (BIO-RAD, Hoa Kỳ). Quy trình khử trùng vi hạt vàng và bọc plasmid DNA được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn của công ty BIO-RAD. Điều kiện bắn gen: các cụm PLB, qua cắt nhỏ kích thước khoảng 3-5 mm, được xếp khít nhau ở trung tâm đĩa petri (đường kính 6 cm) chứa môi trường số 1 và qua nuôi cấy 2 ngày trong tối; hạt vàng có kích thước 0,9 µm, khoảng cách bắn 6 cm, lực bắn 1.100 psi, lực hút chân không 27 in. Hg vac. Chọn lọc tế bào và tạo chồi chuyển gen Sau bắn gen 2 ngày, mô được cấy chuyển sang môi trường số 1 có bổ sung 1 mg/l phosphinothricin (PPT); thực hiện 1 chu kỳ chọn lọc (20 ngày). Sau đó, mô được cấy chuyển tiếp sang môi trường chọn lọc như trên nhưng có bổ sung 3 mg/l PPT liên tiếp 5 chu kỳ (20 ngày/chu kỳ). Điều kiện nuôi chọn lọc: tối (đối với 3 chu kỳ đầu), chiếu sáng với cường độ khoảng 3.000 lux (ở các chu kỳ tiếp theo), nhiệt độ 25-28oC. Tạo chồi chuyển gen từ PLB chuyển gen được thực hiện bằng môi trường số 2, có bổ sung 3 mg/l PPT; điều kiện nuôi: cường độ ánh sáng và nhiệt độ như trên. Phương pháp kiểm tra thể chuyển gen Sự có mặt của gen bar ở PLB chuyển gen được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR dùng cặp mồi đặc hiệu: BAR(F): 5’-GGTCTGCACCATCGT CAACC-3’, BAR(R): 5’-CCCTGCAGTTACT ATCAGATCTCG-3’; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ (94C: 1 phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 350 bp. Sự có mặt của gen DsRed được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (theo Rehbein & Bogerd, 2007) [15]: DsRED(F): 5’-ACAACACCGTGAAGCTGAA GGTGACCAAG-3’, DsRED(R): 5’-GGTG TAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTC-3’; chương trình nhiệt như đối với gen bar; khuếch đại đoạn DNA 500 bp. Sự biểu hiện tạm thời (2 ngày sau bắn gen) và bền vững của gen DsRed ở PLB được ghi nhận trong tối bằng cách chiếu ánh sáng vàng- xanh lục, độ dài sóng 560 nm [3], từ đèn cầm tay LED Spotlight (Hoa Kỳ) và quan sát mô dưới kính hiển vi soi nổi qua kính lọc đỏ. Chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số CANON 12 Mpixels. Sự biểu hiện bền vững của gen DsRed cũng được ghi nhận qua quan sát PLB bằng mắt thường dưới ánh sáng tự nhiên/ánh sáng đèn huỳnh quang trắng và quan sát PLB dưới kính hiển vi soi nổi. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218 214 Theo tài liệu, tương tự nghiên cứu chuyển gen dùng gen gfp, sau khi được kích thích, ánh sáng phát ra bởi protein gen chuyển có thể bị che khuất bởi diệp lục tố hiện diện trong mô. Vì vậy, trước khi thực hiện nghiên cứu chuyển gen, mô PLB được nuôi trong điều kiện tối khoảng 3 tháng để mô có màu trắng (etiolated) - diệp lục tố thoái hóa nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc ghi nhận biểu hiện phát sáng tạm thời; và tương tự, sau quá trình chọn lọc dài hạn mô PLB cũng được xử lý trong tối cũng trong khoảng thời lượng trên nhằm chuẩn bị cho khâu quan sát, ghi nhận biểu hiện phát sáng bền vững. Đến nay, trên thế giới chưa thấy tài liệu nào công bố có đề cập dùng PPT để chọn lọc trong nghiên cứu chuyển gen vào đối tượng phong lan Dendrobium. Vì vậy, thử nghiệm tính chống chịu tự nhiên đối với PPT (nồng độ từ 1-5 mg/l) đã được thực hiện. Kết quả cho thấy, 3 mg/l PPT là nồng độ gây chết toàn bộ mô PLB, được dùng để chọn lọc ở thí nghiệm chuyển gen. Số liệu cụ thể về ảnh hưởng của PPT trên tỷ lệ chết hoại (necrosis) của mô PLB sẽ được trình bày ở một công bố khác. Theo một số tài liệu đã được công bố, đối với ba giống lan Brassia, Cattleya và Doritaenopsis, nồng độ PPT dùng chọn lọc là 3 mg/l [8]; còn đối với giống lan Phalaenopsis, nồng độ PPT dùng chọn lọc có cao hơn, 5 mg/l [1]. Hình 1. Chọn lọc mô chuyển gen và kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển. a. Mô PLB dùng bắn gen; b. Mô PLB trên môi trường chọn lọc có 1 mg/l PPT; c. Cụm mô sống sót trên môi trường chọn lọc có 3 mg/l PPT; d. Sự biểu hiện tạm thời của gen DsRed (vị trí mũi tên); e. Kiểm tra PCR gen bar cho kết quả dương tính với đoạn DNA được khuếch đại 350 bp (vị trí mũi tên) (1: Thang DNA chuẩn 1 kb; 2. Đối chứng dương - plasmid; 3. Đối chứng âm - PLB không chuyển gen; 4, 5, 6, 7. Các dòng PLB chuyển gen); f. Kiểm tra PCR gen DsRed cho kết quả dương tính với đoạn DNA được khuếch đại 500 bp (vị trí mũi tên) (1. Thang DNA chuẩn 1 kb; 2. Đối chứng dương - plasmid; 3. Đối chứng âm - PLB không chuyển gen; 4. Đối chứng âm - nước cất; 5, 6, 7, 8. Các dòng PLB chuyển gen). Quá trình bố trí và triển khai thí nghiệm, đã không thu được dòng mô nào kháng PPT nếu sau bắn gen mô được cấy chuyển ngay sang môi trường có áp lực chọn lọc cao - 3 mg/l PPT (số liệu chưa công bố). Vì vậy, ở các thí nghiệm sau, chế độ chọn lọc PPT được áp dụng với nồng độ lần lượt từ thấp (1 mg/l) đến cao (3 mg/l). Theo chúng tôi, chế độ chọn lọc này tạo điều kiện cho tế bào chuyển gen có điều kiện thời gian tăng sinh giữa một số lượng lớn tế bào không được chuyển gen đang chết dần, có thể tạo ra các chất gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào chuyển gen. Ở chu kỳ chọn lọc 20 ngày trên môi trường có 1 mg/l nhận thấy, mô b d e f 1 2 3 4 5 6 7 1 mm c 1 2 3 4 5 6 7 8 a Nguyen Huu Ho et al. 215 PLB vẫn còn khả năng tăng sinh (hình 1b) nhưng ở giai đoạn chọn lọc tiếp theo dùng nồng độ 3 mg/l, nhận thấy, mô PLB chết nhiều và nhanh hơn. Việc nuôi chọn lọc theo thời gian tạo điều kiện cho các mô chuyển gen tăng dần sinh khối từ một số ít PLB kháng PPT hình thành ban đầu (hình 1c); chúng vẫn có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ PPT rất cao - 5 mg/l (số liệu cá nhân) và theo chúng tôi, chúng là các dòng PLB đã mang gen bar. Qua 6 chu kỳ chọn lọc (thời lượng khoảng 4 tháng), đã nhận được 4 dòng (independent event/line) PLB kháng 3 mg/l PPT (ký hiệu tên các dòng RDL1, RDL2, RDL3 và RDL4) trên tổng số khoảng 1.100 PLB đơn (single PLB) được bắn gen và chọn lọc; tần số chuyển gen trung bình là 0,36%. Hai ngày sau bắn gen, đồng thời với việc cấy chuyển chọn lọc, một số mô PLB được lấy ngẫu nhiên để kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của gen DsRed qua chiếu ánh sáng vàng-xanh lục kết hợp quan sát dưới kính hiển vi soi nổi gắn kính lọc đỏ. Kết quả cho thấy, trên bề mặt PLB có nhiều điểm sáng màu đỏ (hình 1d). Kiểm tra sự có mặt của hai gen bar và DsRed bằng kỹ thuật PCR đã cho kết quả dương tính (ở cả 4 dòng) qua ghi nhận được hai băng DNA mong đợi tương ứng là 350 bp và 500 bp (hình 1e, 1f) và như vậy, có sự đồng hợp nhất (co- integration) cả hai gen nói trên vào bộ gen cây lan. Không ghi nhận có dòng PLB nào chỉ mang gen chọn lọc bar mà không mang gen DsRed dù phương pháp chuyển gen dùng ở nghiên cứu này là phương pháp đồng biến nạp (co- transformation) trên cơ sở dùng kỹ thuật đồng bắn gen (co-bombardment). Hình 2. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng tự nhiên và ánh sáng đèn huỳnh quang trắng của PLB chuyển gen (chụp không dùng kính lọc đỏ). a. PLB đối chứng dưới ánh sáng tự nhiên; b, c. Hai dòng PLB có biểu hiện phát ánh sáng đỏ mạnh (dòng RDL1) và yếu hơn (dòng RDL3), theo thứ tự, dưới ánh sáng tự nhiên; d. Cận ảnh PLB đối chứng dưới ánh sáng đèn huỳnh quang trắng; e, f. Cận ảnh hai dòng PLB chuyển gen có biểu hiện phát ánh sáng đỏ mạnh (dòng RDL1) và yếu hơn (dòng RDL3), theo thứ tự, dưới ánh sáng đèn huỳnh quang trắng. Bốn dòng PLB chuyển gen được nhân lên, sinh khối của chúng được chia thành hai nhóm để ở ngoài sáng và trong tối. Sau nhiều tháng nuôi trong tối, điều thú vị là có thể ghi nhận được bằng mắt thường màu hồng/đỏ của quần thể PLB dưới ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang trắng (hình 2); trong tổng số 4 dòng chuyển gen ghi nhận có 1 dòng (RDL3) có biểu hiện màu yếu hơn 3 dòng còn lại (RDL1, RDL2 và RDL4). Bốn dòng mô PLB chuyển gen hiện đang được nuôi trong điều kiện sáng trên môi trường a b c d e f 2 mm 1 cm TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218 216 số 2 (Knudson C không chất điều hòa sinh trưởng + 10% nước dừa) để tạo điều kiện cho sự vươn chồi, hình thành cây hoàn chỉnh chuẩn bị cho giai đoạn trồng ở vườn ươm. Kích thích protein DsRed bằng ánh sáng vàng-xanh lục có chiều dài sóng đặc trưng cũng đã được tiến hành nhằm ghi nhận sự phát sáng của protein này. Kết quả cho thấy, ánh sáng kích thích (excitation) đã tạo hiệu ứng phát ánh sáng (emission) đỏ với đỉnh sóng chính (major peak) 583 nm [4] rất rõ rệt ở các dòng PLB chuyển gen nuôi trong điều kiện tối (hình 3a, 3b, 3c, 3d); bước đầu không thấy có sự khác biệt rõ về biểu hiện phát ánh sáng đỏ giữa một vài dòng PLB như đã ghi nhận dưới ánh sáng tự nhiên. Tuy nhiên, biểu hiện phát ánh sáng đỏ yếu hơn được ghi nhận đối với các dòng PLB chuyển gen được nuôi ngoài sáng do có chứa nhiều diệp lục tố (hình 3e, 3f); cũng nhận thấy biểu hiện phát sáng mạnh hơn ở phần gốc mỗi PLB đơn do phần gốc hàm chứa ít diệp lục tố hơn. Hình 3. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích thích (vàng-xanh lục) của PLB chuyển gen (bên trái mỗi ảnh nhỏ: PLB đối chứng; bên phải mỗi ảnh nhỏ: PLB chuyển gen; ảnh được chụp qua kính lọc đỏ). a, b, c, d. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích thích của 04 dòng PLB chuyển gen, theo thứ tự RDL1, RDL2, RDL4 và RDL3, nuôi trong điều kiện tối; e, f. Biểu hiện phát ánh sáng đỏ dưới ánh sáng kích thích của 02 dòng PLB chuyển gen, theo thứ tự RDL1 và RDL3, nuôi ở điều kiện chiếu sáng. Do ưu điểm vốn có nên thời gian gần đây, các nhà khoa học có khuynh hướng dùng gen chỉ thị DsRed trong nghiên cứu biến nạp gen trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, từ cây mô hình dùng nghiên cứu cơ bản đến cây trồng có giá trị kinh tế như cây đậu tương [13], cây Arabidopsis [14, 17, 18], Camelina sativa [10]. Việc dùng gen chỉ thị DsRed này đặc biệt có lợi vì có thể không cần dùng gen kháng chất kháng sinh hay gen chọn lọc khác khi nghiên cứu biến nạp di truyền trên cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng chìm hoa (floral dip method) vào dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; ở trường hợp này, có thể quan sát chọn ra hạt cây chuyển gen trong tổng số hạt thu hoạch chỉ bằng cách đơn giản là nhận diện sự phát ánh sáng đỏ của hạt [14, 18]. Theo xu thế này, việc nghiên cứu biến nạp gen phát sáng nói chung và gen DsRed nói riêng đã được triển khai tại Viện Sinh học Nhiệt đới và đã nhận được một số kết quả có ý nghĩa như đã trình bày. KẾT LUẬN Qua ứng dụng phương pháp đồng biến nạp/bắn gen để chuyển gen vào vật liệu PLB giống phong lan Dendrobium Burana White, đã nhận được 4 dòng PLB mang gen mục tiêu Ds- Red tạo protein phát ánh sáng đỏ cùng với gen chọn lọc bar tạo tính kháng chất trừ cỏ PPT. Các dòng này có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi trường có 3 mg/l PPT và cho c a b d e f 0,5 cm Nguyen Huu Ho et al. 217 kết quả dương tính qua kiểm tra PCR đối với hai gen DsRed và bar. Đã ghi nhận được biểu hiện phát ánh sáng đỏ rất mạnh khi mô PLB được phơi dưới ánh sáng kích thích vàng-xanh lục kết hợp dùng kính lọc đỏ ở thử nghiệm kiểm tra sự biểu hiện tạm thời và bền vững của gen DsRed. Cũng đã ghi nhận được bằng mắt thường biểu hiện sắc tố hồng/đỏ ở các dòng PLB chuyển gen dưới ánh sáng tự nhiên/ánh sáng đèn huỳnh quang trắng. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trên cơ sở sử dụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới và Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hóa sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên tp. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anzai H., Ishii Y., Shichinohe M., Katsumata K., Nojiri C., Morikawa H., Tanaka M., 1996. Transformation of Phalaenopsis by particle bombardment. Plant Tiss. Cult. Lett., 13(3): 265-272. 2. Berg R. H., Beachy R. N., 2008. Fluorescent Protein Applications in Plants, In: Sullivan K. F. (ed) Methods in Cell Biology, Elsevier Inc., pp. 153-177. 3. Buschmann C., Langsdorf G., Lichtenthaler H. K., 2000. Imaging of the blue, green, and red fluorescence emission of plants: An overview. Photosynthetica, 38(4): 483-491. 4. Cotlet M., Hofkens J., Habuchi S., Dirix G., Guyse M. V., Michiels J., Vanderleydens J., De Schryver F. C., 2001. Identification of different emitting species in the red fluorescent protein DsRed by means of ensemble and simple-molecule spectroscopy. PNAS, 98(25): 14398-14403. 5. Dietrich C., Maiss E., 2002. Red fluorescent protein DsRed from Discosoma sp. as a reporter protein in higher plants. Biotechniques, 32(2): 286-293. 6. Hong S. G., Kim M. K., Jang G., Oh H. J., Park J. E., Kang J. T., Koo O. J., Kim T., Kwon M. S., Koo B. C., Ra J. C., Kim D. Y., Ko C., Lee B. C., 2009. Generation of red fluorescent protein transgenic dogs. Genesis, 47(5): 314-322. 7. Jach G., Binot E., Ering S., Luxa K., Schell J., 2001. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (DsRed) as a reporter for plant gene expression. Plant J., 28(4): 483- 491. 8. Knapp J. E., Kausch A. P., Chandlee J. M., 2000. Transformation of three genera of orchid using the bar gene as a selectable marker. Plant Cell Rep., 19: 893-898. 9. Knudson L., 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seed. American Orchid Soc. Bull., 15: 214-217. 10. Lu C., Kang J., 2008. Generation of transgenic plants of a potential oilseed crop Camelina sativa by Agrobacterium- mediated transformation. Plant Cell Rep., 27(2): 273-278. 11. Matts M. V., Fradkov A. F., Labas Y. A., Savitsky A. P., Zaraisky A. G., Markelov M. L., Lukyanov S. A., 1999. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol., 17: 969-973. 12. Mercuri A., Sacchetti A., de Benedetti L., Schiva T., Alberti S., 2002. Green fluorescent flowers. Plant Science, 162: 647-654. 13. Nishizawa K., Kita Y., Kitayama M., Ishimoto M., 2006. A red fluorescent protein, Ds-Red2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Rep., 25(12): 1355-1361. 14. Pidkowich M. S., Nguyen H. T., Heilmann I., Ischebeck T., Shanklin J., 2007. Modulating seed -ketoacyl-acyl carrier protein synthase II level converts the composition of a temperate seed oil to that of a palm-like tropical oil. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(11): 4742-4747. 15. Rehbein H., Bogerd J., 2007. Identification of genetically modified Zebra fish (Danio rerio) by protein and DNA analysis. J. Consumer Protection and Food Safety, 2: 122-125. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 212-218 218 16. Rodrigues F., van Hemert M., Steensma H. Y., Côrte-Real M., Leao C., 2001. Red fluorescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 183(12): 3791-3794. 17. Stuitje A. R., Verbree E. C., van der Linden K. H., Mietkiewska E. M., Nap J. P., Kneppers T. J. A., 2003. Seed-expressed fluorescent proteins as a versatile tools for easy (co) transformation and high-throughput functional genomics in Arabidopsis. Plant Biotechnol. J., 1: 301-309. 18. Tam N., Shanklin J., 2009. Altering Arabidopsis oilseed composition by a combined antisense-hairpin RNAi gene suppression approach. J. Am. Oil Chem. Soc., 86: 41-49. 19. Vintersten K., Monetti C., Gertsenstein M., Zhang P., Laszlo L., Biechele S., Nagy A., 2004. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis, 40: 241-246. 20. Yin X. J., Lee H. S., Yu X. F., Choi E., Koo B. C., Kwon S., Lee Y. S., Cho S. J., Jin G. Z., Kim L. H., Shin H. D., Kim T., Kim N. H., Kong I. K., 2008. Generation of cloned transgenic cats expressing red fluorescence protein. Biol. Reprod., 78: 425-431. PRESENCE AND EXPRESSION OF THE Ds-Red GENE IN THE TRANSGENIC PROTOCORM-LIKE BODY OF THE Dendrobium CV. BURANA WHITE Nguyen Huu Ho1, Huynh Nguyen Phat2, Le Tan Duc1, Tran Thi Ngoc Ha1, Nguyen Huu Tam1,3 (1)Institute of Tropical Biology, VAST (2)Ho Chi Minh City University of Natural Sciences (3)University of Nebraska-Lincohn, Nebraska, USA SUMMARY Four transgenic lines of the Dendrobium cv. Burana White containing the target DsRed gene were obtained following the microprojectile bombardment. Protocorm-like bodies (PLBs, etiolated), cut into 3-5 mm in size, were used as target material for bombardment. Gold particles (0.9 µm) coated by the mixed plasmids (pITB-DsRED with DsRed gene along with the plasmid pITB-BAR with bar gene) (Molar ratio 3:1, respectively) were bombarded into PLBs by the BIO-RAD PDS-1000/He. After 2-day co-bombardment, PLBs were cultured on the Knudson C (1946) selection medium (1 mg/l of BA) with 1-3 mg/l of phosphinothricin (PPT) for several selection cycles. The transient expression of the DsRed gene (2 days after bombardment) was confirmed with a positive result. The PCR analysis of the DsRed, bar genes showed the expected DNA bands - 350 bp, 500 bp, respectively. For the detection of the DsRED fluorescence, the transgenic PLBs (etiolated and green) were illuminated with a hand-held LED spotlight (for yellow-green light - 560 nm wavelength) and photographed by the CANON digital camera in combination with a red filter. Furthermore, the expression of the DsRED protein in PLB was also readily identifiable under day light/white fluorescent lamp. These results indicate that DsRed is a suitable reporter for genetic transformation of Dendrobium and this system could be used in fundamental research, especially the change of flower color due to the biochemical product of the transgene. This is the first result on genetic transformation of Dendrobium with the DsRed gene for generating transgenic PLBs which can be excited for emitting strong red fluorescence. Keywords: Dendrobium, DsRed gene, microprojectile bombardment, phosphinothricin (PPT), gene- transformation. Ngày nhận bài: 21-6-2012