Sử dụng kỹ thuật EIA chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh ở bò sữa

52(4): 110 -114 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 110 SỬ DỤNG KỸ THUẬT EIA CHẨN ĐOÁN NGUYÊN NHÂN CHẬM SINH Ở BÒ SỮA Nguyễn Mạnh Hà ( Trường ĐH Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên) I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay tình trạng chậm sinh trên đàn bò sữa nuôi ở nước ta là khá phổ biến. Một trong những nguyên nhân được xác định là do rối loạn chức năng buồng trứng, biểu hiện chủ yếu ở các trạng thái như: buồng trứng kém phát triển, tồn lưu thể vàng, u nang buồng trứng Việc chẩn đoán, phát hiện các triệu chứng trên ở bò bằng các phương pháp thông thường hiện nay gặp rất nhiều khó khăn bởi các lý do: không tận mắt nhìn thấy buồng trứng, chưa có nhiều kinh nghiệm khi sờ khám buồng trứng, các thao tác khám vất vả dễ gây tổn thương. Để khắc phục hạn chế trên, hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật EIA phân tích hàm lượng progesterone (P4) trong sữa hoặc huyết thanh. Trên cơ sở xác định nồng độ progesterone có thể cho biết trạng thái của buồng trứng cũng như tình trạng hoạt động sinh dục của cơ thể bò sữa. Phương pháp này có ưu điểm nhanh, chính xác và không gây tổn thương tới cơ thể bò. Để có thêm cơ sở khoa học giúp cho công tác chẩn đoán trạng thái hoạt động sinh dục của bò sữa ở nước ta được kịp thời và chính xác, đề tài tiến hành phân tích xác định nồng độ progesterone trong cơ thể bò sữa nuôi tại một số huyện ngoại thành Hà Nội bằng kỹ thuật EIA. Đây là hướng nghiên cứu còn khá mới mẻ đối với chăn nuôi gia súc ở nước ta hiện nay. II. PHƢƠNG PHÁP - Vật liệu: Mẫu sữa (đối với bò sinh sản bình thường) và mẫu máu (đối với bò chậm sinh) của bò lai hướng sữa nuôi tại một số khu vực ngoại thành Hà Nội + Đối với bò sinh sản bình thường: lấy mẫu sữa của 5 bò để phân tích. Mẫu đầu tiên lấy vào ngày bò động dục (ngày 0), mẫu tiếp theo lấy vào các ngày 3; 6; 9; 12; 15 và 21 của chu kỳ động dục. Sữa được lấy vào buổi sáng sớm, ly tâm 3000 vòng/phút để yên 15 phút chắt lấy phần sữa không bơ ở phía trên để phân tích. + Đối với bò chậm sinh (không có biểu hiện động dục): lấy mẫu máu của 30 bò để phân tích. Máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi, cho vào trong ống nghiệm (mỗi con lấy khoảng 10 ml). Để ống nghiệm nằm im, hơi nghiêng theo phương thẳng đứng. Đợi cho phần máu đông chìm xuống phía dưới đáy ống nghiệm, phần huyết thanh màu vàng nổi lên phía trên, chắt huyết thanh ra một ống nghiệm khác sau đó đưa về phòng thí nghiệm để phân tích. *Phƣơng pháp định lƣợng hàm lƣợng progesteron Sử dụng phương pháp ELISA với kỹ thuật EIA- Progesterone của Viện Chăn nuôi quốc gia (2003)[4] để phân tích. - Các chỉ tiêu theo dõi + Đối với bò sinh sản bình thường: xác định hàm lượng progesterone ở ngày động dục (ngày 0) và các ngày sau động dục: ngày 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21 + Đối với bò chậm sinh: xác đinh hàm lượng progesterone ở ngày lấy mẫu bất kỳ (ngày 0) và các ngày lấy mẫu tiếp theo: ngày 7; 14; 21. - Địa điểm tiến hành: Các phân tích mẫu sữa và huyết thanh được tiến hành tại Bộ môn sinh sản và thụ tinh nhân tạo, Viện Chăn nuôi quốc gia III. KẾT QUẢ 1. Kết quả phân tích hàm lƣợng progesterone trong chu kỳ động dục bình thƣờng của bò Theo dõi hàm lượng progesterone trên 5 bò có chu kỳ động dục bình thường (sau đẻ động dục trở lại trong khoảng 35-40 ngày) tại các thời điểm: ngày 0 (ngày động dục), ngày 3; 6; 9; 12; 15; 18 và 21 chúng tôi thu được kết quả ở bảng 1 Qua bảng 1 cho thấy hàm lượng progesterone ở 5 bò lấy mẫu phân tích biến đổi theo quy luật chung: đạt nồng độ thấp nhất ở ngày động dục (0,17 0,05 ng/ml) sau đó bắt đầu tăng cao từ ngày thứ 3 (0,60 0,07 ng/ml), đạt giá trị cao nhất ngày 15 (2,20 0,16 ng/ml) sau đó giảm dần đến ngày 21 (0,26 0,08 ng/ml). 52(4): 110 - 114 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 111 Bảng 1. Hàm lượng progesterone trong chu kỳ động dục bình thường của bò lai hướng sữa Số TT bò Hàm lƣợng progesterone trong sữa (ng/ml) Ngày 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15 Ngày 18 Ngày 21 1 0,17 0,69 1,25 1,86 2,04 2,50 1,12 0,36 2 0,05 0,52 1,18 1,70 2,11 1,88 1,00 0,08 3 0,12 0,41 0,98 1,65 1,97 2,01 1,10 0,45 4 0,20 0,76 1,42 1,89 2,54 2,06 0,99 0,22 5 0,31 0,60 1,81 1,95 2,30 2,53 1,16 0,17 TB 0,17 0,05 0,60 0,07 1,33 0,16 1,81 0,09 2,19 0,12 2,20 0,16 1,07 0,04 0,26 0,08 Biến động về hàm lượng progesterone trong chu kỳ động dục của bò sinh sản bình thường được biểu thị bằng đồ thị ở hình 1 Hình 1. Đồ thị biểu diễn hàm lượng progesterone trong chu kỳ động dục của bò sinh sản bình thường Kết quả nghiên cứu trên bò sữa của Phan Văn Kiểm và cs (2003) [3] cho biết: hàm lượng progesterone vào ngày động dục (ngày 0) rất thấp đạt 0,15ng/ml, tăng lên ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 (0,58-1,24ng/ml), đạt cao nhất ngày thứ 12 đến 15 (2,41-2,43ng/ml) sau đó giảm nhanh từ ngày thứ 18 và đến ngày 21 còn 0,22ng/ml. Kết quả nghiên cứu của Hommeida và cs (2002) [6] ở bò cho thấy: ở ngày động dục (ngày 0) hàm lượng progesterone đạt 0,17ng/ml; ngày 6 đạt 1,10ng/ml; ngày 9 đạt 1,70ng/ml; ngày 12 đạt 2,30ng/ml; ngày 15 đạt 2,55ng/ml; ngày 18 giảm còn 1,26 ng/ml và ngày 21 còn 0,22ng/ml. 2. Kết quả phân tích hàm lƣợng progesterone ở bò cái chậm sinh Phân tích hàm lượng progesterone trong máu của 30 bò có biểu hiện chậm sinh tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau theo thứ tự: ngày đầu tiên lấy mẫu (ngày bất kỳ và coi là ngày 0), các mẫu tiếp theo được lấy sau đó vào các ngày thứ 7; 14 và 21 kết quả thể hiện ở bảng 2. Kết quả ở bảng 2 cho thấy: - Nhóm thứ nhất (có 11 bò) bao gồm những bò có hàm lượng progesterone luôn ở mức cao (trên 1 ng/ml) tại tất cả các thời điểm lấy mẫu, cụ thể ngày lấy mẫu đầu tiên (ngày 0) đạt giá trị 1,82 0,25 ng/ml; ngày thứ 7 đạt 1,80 0,22 ng/ml; ngày thứ 14 đạt 1,79 0,21 ng/ml và ngày 21 đạt 1,79 0,21 ng/ml. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 ngày 0 ngày 3 ngày 6 ngày 9 ngày 12 ngày 15 ngày 18 ngày 21 52(4): 110 - 114 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 112 Bảng 2. Hàm lượng progesterone ở bò cái chậm sinh Nhóm bò N (con) Hàm lƣợng progesteron (ng/ml) x xm Ngày 0 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21 Hàm lượng P4 cao 11 1,82 0,25 1,80 0,22 1,79 0,21 1,79 0,21 Hàm lượng P4 thấp 16 0,38 0,04 0,42 0,06 0,41 0,05 0,39 0,04 Hàm lượng P4 tăng dần 2 0,54 0,25 0,83 0,27 1,42 0,51 2,14 0,56 Hàm lượng P4 giảm dần 1 2,28 1,19 0,88 0,36 - Nhóm thứ hai (có 16 bò) gồm những bò có hàm lượng progesterone luôn ở mức thấp (dưới 1 ng/ml) tại tất cả các thời điểm lấy mẫu, cụ thể: ngày lấy mẫu đầu tiên (ngày 0) đạt 0,38 0,04 ng/ml; ngày thứ 7 đạt 0,42 0,06 ng/ml; ngày thứ 14 đạt 0,41 0,05 ng/ml và ngày thứ 21 đạt 0,39 0,04 ng/ml. - Nhóm thứ ba (có 2 bò) có hàm lượng progesterone trong máu tăng dần theo các ngày lấy mẫu, cụ thể: ngày lấy mẫu đầu tiên (ngày 0) đạt 0,54 0,25 ng/ml; ngày thứ 7 đạt 0,83 0,27 ng/ml; ngày thứ 14 đạt 1,42 0,51 ng/ml và ngày thứ 21 đạt 2,14 0,56 ng/ml. - Nhóm thứ tư (có 1 bò) có hàm lượng progesterone trong máu giảm dần, cụ thể: ngày lấy mẫu đầu tiên (ngày 0) đạt 2,28 ng/ml; ngày thứ 7 đạt 1,19 ng/ml; ngày thứ 14 đạt 0,88 ng/ml và ngày thứ 21 đạt 0,36 ng/ml. Theo Nguyễn Tấn Anh (1998) [1], nồng độ progesterone trong huyết tương chịu ảnh hưởng trực tiếp của sự hình thành và phát triển thể vàng. Theo Isobe (2002) [7], giới hạn lớn hơn 1 ng/ml về nồng độ prpogesterone trong huyết tương là mốc đánh dấu sự tồn tại và thực hiện chức năng chế tiết progesterone của thể vàng. Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi cho rằng: +11 bò có thể vàng hoạt động tiết progesterone với hàm lượng lớn hơn 1 ng/ml. Chúng tôi cho rằng đây là những bò có thể vàng tồn lưu. +16 bò có hàm lượng progesterone luôn thấp dưới 1 ng/ml, chúng tôi cho rằng đó là những bò buồng trứng không hoạt động + 3 bò có hàm lượng progesterone tăng hoặc giảm nên có một vấn đề như 2 trường hợp trên sau một thời gian thấy xuất hiện động dục, hình thành chu kỳ. Theo kết quả nghiên cứu của Phan Văn Kiểm và cs (2003) [3], nghiên cứu hàm lượng progesterone ở bò chậm sinh tại Ba Vì, trại bò Cầu Diễn, Phù Đổng thông báo: hàm lượng progesterone ở bò chậm sinh chia làm 2 nhóm: Một nhóm có hàm lượng progesterone luôn cao (trên 1 ng/ml) tương ứng vào các ngày lấy mẫu 0; 7. 14; 21 là 1,48 0,33 ng/ml; 1,62 0,45 ng/ml; 1,58 0,25 ng/ml và 1,51 0,43 ng/ml. Một nhóm có hàm lượng progesterone thấp (dưới 1 ng/ml) tương ứng vào các ngày lấy mẫu 0; 7; 14 và 21 là 0,08 0,05 ng/ml; 0,12 0,06 ng/ml; 0,16 0,05 ng/ml và 0,19 0,01 ng/ml. Để khẳng định thêm về các kết luận chúng tôi tiến hành kiểm tra buồng trứng qua trực tràng. 3. Kết quả kiểm tra buồng trứng qua trực tràng Nếu chỉ với phương pháp xác định hàm lượng progesterone chúng tôi chỉ phân biệt được 3 nhóm bò: một nhóm có thể vàng tồn lưu buồng trứng, một nhóm không có thể vàng hình thành và nhóm buồng trứng trở lại hoạt động bình thường theo chu kỳ. Song khi đã phát hiện ra được hàm lượng progesterone thấp thì việc xác định chính xác nguyên nhân của gây nên đã trở nên dễ dàng hơn thông qua việc kết hợp khám buồng trứng qua trực tràng. Kiểm tra buồng trứng qua trực tràng đối với 30 trường hợp chậm sinh chúng tôi nhận thấy có 19 bò có khối u buồng trứng (63,33%) và 11 bò buồng trứng kém hoạt động (36,67%). Kết quả được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả xác định tình trạng buồng trứng bằng khám qua trực tràng Biểu hiện của buồng trứng Số bò có biểu hiện (con) Tỷ lệ (%) Buồng trứng có khối u 19 63,33 Buồng trứng kém hoạt động 11 36,67 Nếu chỉ chẩn đoán bằng khám qua trực tràng thì kết quả chẩn đoán không đạt hiệu quả cao do khó phân biệt giữa 2 trường hợp u noãn nang và u 52(4): 110 - 114 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 113 thể vàng bởi cấu trúc bề mặt buồng trứng của 2 trường hợp này tương đối giống nhau. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức độ chính xác khi chẩn đoán u noãn nang bằng khám qua trực tràng chỉ đạt 65%-75%. Có tới 25% trường hợp bị chẩn đoán sai (Chung Anh Dũng, 2001) [2]. Với kỹ thuật EIA-progesterone việc chẩn đoán dựa trên mức độ biến động của progesterone sẽ nhanh và chính xác hơn. 3.4. Kết quả chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh bằng phân tích hàm lƣợng progesterone kết hợp khám buồng trứng qua trực tràng Hàm lượng progesterone và kết quả khám qua trực tràng ở bò chậm sinh được thể hiện ở bảng 4. Qua bảng 4 chúng tôi nhận thấy: - Có 11 bò khám qua trực tràng thấy có khối u khi phân tích cho thấy hàm lượng progesterone cao (trên 1 ng/ml) ở cả 4 thời điểm lấy mẫu, chúng tôi kết luận đây là những bò có thể vàng buồng trứng tồn lưu. - Có 8 bò thuộc nhóm có khối u khi khám qua trực tràng nhưng phân tích cho nồng độ progesterone thấp (dưới 1 ng/ml) ở các thời điểm lấy mẫu. Chúng tôi kết luận là bị u noãn nang. - Có 11 bò kiểm tra qua trực tràng thấy buồng trứng nhỏ, nhẵn và cứng. Phân tích cho kết quả về hàm lượng progesterone thấp (đều dưới 0,4 ng/ml) chúng tôi kết luận là những bò có buồng trứng kém hoạt động Theo kết quả nghiên cứu của Phan Văn Kiểm và cs (2003) [3] khi kiểm tra hàm lượng progesterone để chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh ở bò cho biết: những cá thể bò bị bệnh buồng trứng tồn lưu thể vàng hàm lượng progesterone đo được ở các ngày: ngày bất kỳ (ngày 0) là 1,48 0,33 ng/ml; ngày 7 là 1,62 0,45 ng/ml và ngày 14 là 1,58 0,23 ng/ml. Theo kết quả nghiên cứu của Van de Wied và cs (1982) [8] cho biết bò bị bệnh buồng trứng kém phát triển, u noãn nang có hàm lượng progesterone thấp, dao động trong khoảng từ 0,17-0,41ng/ml Theo Carol và cs (1990)[5] những bò bị u noãn có hàm lượng progesterone trong huyết tương đạt cao nhất là 0,47 ng/ml. Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả trên. IV. KẾT LUẬN - Sử dụng kỹ thuật EIA phân tích hàm lượng progesterone trong cơ thể bò sữa trong thí nghiệm đã bước đầu xác định được động thái progesterone trong cơ thể bò có chu kỳ sinh sản bình thường và bò chậm sinh: + Đối với bò có chu kỳ sinh sản bình thường (5 con) hàm lượng progesterone trong cơ thể biến đổi theo quy luật chung: đạt nồng độ thấp nhất ở ngày động dục (0,17 0,05 ng/ml) sau đó bắt đầu tăng cao từ ngày thứ 3 (0,60 0,07 ng/ml), đạt giá trị cao nhất ngày 15 (2,20 0,16 ng/ml) sau đó giảm dần đến ngày 21 (0,26 0,08 ng/ml). + Đối với bò chậm sinh: Nhóm bò (11 con) có hàm lượng progesterone luôn ở mức cao từ 1,79- 1,82 ng/ml tại tất cả các thời điểm lấy mẫu được xác định là những bò có thể vàng tồn lưu (hay u thể vàng). Nhóm bò (8 con) có hàm lượng progesterone luôn ở mức thấp nhưng thay thổi thất thường (từ 0,36- 0,45 ng/ml) tại các thời điểm lấy mẫu được xác định là những bò có u nang buồng trứng và nhóm bò (11 con) có hàm lượng progesterone luôn ở mức thấp và ổn định tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau là những bò có buồng trứng kém hoạt động. - Bằng kỹ thuật EIA khi phân tích hàm lượng progesterone đã phân biệt rõ được các trường hợp buồng trứng có khối u đó là: 11/19 con do thể vàng buồng trứng tồn lưu và 8/19 con do bị u nang buồng trứng. Đây là cơ sở khoa học giúp cho công tác điều trị đối với bò sữa chậm sinh. Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lượng progesterone và khám buồng trứng qua trực tràng ở bò chậm sinh Khám buồng trứng qua trực tràng N (con) Hàm lƣợng progesterone (ng/ml) Kết luận Nhóm bò Ngày 0 Ngày 7 Ngày 14 Ngày 21 Nhóm bò n (con) Buồng trứng có khối u 19 1,82 0,25 1,80 0,22 1,79 0,20 1,79 0,21 U thể vàng 11 0,36 0,05 0,45 0,03 0,43 0,06 0,41 0,04 U nang trứng 8 Buồng trứng kém hoạt động 11 0,39 0,04 0,40 0,04 0,38 0,03 0,38 0,03 BT kém phát triển 11 52(4): 110 - 114 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Duy Hoan (1998), Sinh lý sinh sản gia súc, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [2]. Chung Anh Dũng (2001), Sử dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ và một số biện pháp kỹ thuật nâng cao hiệu quả thụ tinh nhân tạo cho bò sữa, Luận án Tiến sĩ nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. [3]. Phan Văn Kiểm, Đào Đức Thà, Trịnh Quang Phong, Đỗ Hữu Hoan, Trịnh Văn Thân, Nguyễn Thị Hòa, Vũ Ngọc Hiệu, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa (2003), Kết quả nghiên cứu hàm lượng P4 ở bò lai hướng sữa bằng kỹ thuật miễn dịch enzym EIA, Báo cáo khoa học, Viện Chăn nuôi. [4].Viện Chăn nuôi (2003), Kỹ thuật EIA-Progesteron [5].Carrol.D.J; Pierson.R.A; Hauser. E.R (1990), Variability of ovarian structures and plasma P4-Profiles in dairy cows with ovarian cysts, Their ogendogy. No (34) [6].Homeida at all (2002), Progesteron levels and skim milk in cows which conceived and not conceived after al, Hiroshima Univ Journal [7]. Isobe.N (2002), Theory and application of Elisa, Hiroshima Univ Journal [8]. Van de Wiel.D.D.M; Kalis.C.H.J; Kamon Patana.M (1982), Milk P4 profiles during post-partum period, application of P4 enzym immuno assay in a developing country, Proc.Coord of research on beef production, schoonoord rearch Inst. 52(4): 3 - 12 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009 115 Summary Using EIA technique to diagnose the cause of less reproduction in dairy cows The research is implemented in dairy cows that are keeping in some suburb districts of Hanoi. Cows are collected milk sample (for the cows have a normal estrous cycle) or blood sample (for the cows less reproduction or anestrous cycle) in oder to analyse and determine the progesterone concentration. Through the concentration of progesterone we are able to diagnose clearly and quickly the reproductive status of those cows: For the cows has normal estrous cycle: the progesterone concentration fluctuate in an interval from 0,17 0,05 ng/ml (day 0 or day of estrous cycle) and increasing to 0,60 0,07 ng/ml (3 days affter) and obtaine the highest value at 2,20 0,16 ng/ml (15 days affter ) and then reducing to 0,26 0,08 ng/ml (21 days affter). For the less repproduction cows, there are three catagories: Catagory 1: include 11 cows has luteal cyst with high progesterone concentration in an interval from 1,79-1,82 ng/ml at all times sample collection. Category 2: include 8 cows has ovary cyst with low progesterone concentration in an interval from 0,38-0,45 ng/ml but not stable at all times sample collection. Category 3: include 11 cows has inactive ovary with low progesterone concentration in an interval from 0,38-0,40 ng/ml and stable at all time sample collection. The ovary cyst of less reproduction cows was determined clearly by using EIA technicque in order to analyse progesterone concentration: 11/19 cows cause by luteal cyst and 8/19 cows cause by ovary cyst.