So sánh trình tự gen GmDREB1 của hai giống đậu tương địa phương Cúc Vàng Yên Sơn và Cúc Lông Phú Bình

Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 125 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB1 CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG CÚC VÀNG YÊN SƠN VÀ CÚC LÔNG PHÚ BÌNH Chu Hoàng Mậu1*, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2, Phạm Minh Duy2, Hoàng Văn Mạnh3 1* Đại học Thái Nguyên, 2 Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên, 3Viện Khoa học sự sống - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nhân tố phiên mã DREB là loại protein liên kết đƣợc tổng hợp đáp ứng tình trạng mất nƣớc, có thể tƣơng tác với yếu tố đáp ứng sự khử nƣớc có trình tự lặp lại C (DRE / CRT), chứa trong vùng promoter của nhiều gen cảm ứng với stress từ ngoại cảnh và do đó có thể kiểm soát sự biểu hiện của các gen này ở thực vật, làm tăng khả năng chịu hạn, chịu nhiệt độ thấp và chịu nồng độ muối cao. Yếu tố đáp ứng sự mất nƣớc (DRE) với trình tự lõi A / GCCGAC và yếu tố CRT đƣợc xác định là một nhân tố tác động cis quan trọng trong biểu hiện của nhóm gen chịu hạn, chịu lạnh và chịu muối. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả so sánh trình tự gen GmDREB1 của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng (Cúc Vàng Yên Sơn-CYS và Cúc lông Phú Bình-CPB) có khả năng chịu hạn khác nhau. Đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS dài 704 bp, còn đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CPB dài 705 bp. So sánh trình tự nucleotide cho thấy, hệ số tƣơng đồng về gen GmDREB1 của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu là 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng CYS và CPB là 98,2%. Cần tiếp tục nghiên cứu về gen GmDREB1 làm cơ sở cho việc xác định chỉ thị phân tử và thiết kế vector mang cấu trúc gen GmDREB1 nhằm phục vụ chuyển gen tạo cây đậu tƣơng có khả năng chịu hạn tốt. Từ khoá: đậu tương địa phương, chịu hạn, gen GmDREB1, Glycine max, nhân tố phiên mã. MỞ ĐẦU* Nhóm gen mã hoá các protein DREB-nhân tố tham gia quá trình phiên mã đƣợc cho rằng có liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và của đậu tƣơng nói riêng . Nhóm DREB có trình tƣ̣ cis : DRY, A/GCCGAC. Hai nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã DREB 1 và DREB 2 bám đặc hiệu vào trình tự DRY . Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn , mặn và lạnh. Năm 2004, Chen và đtg đã phân lập gen DREB1 ở đậu tƣơng từ mRNA và đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số AY802779, chiều dài của gen vùng mã hóa amino acid dài 705 bp [2]. Năm 2009, nhóm tác giả Charlson và đtg đã nghiên cứu phân lập gen DREB1 ở đậu tƣơng từ DNA tổng số có kích thƣớc 705 bp với mã số FJ965342 trên NCBI [1]. Năm 2010, Stolf-Moreira và đtg đã xác định mức độ biểu hiện của nhân tố phiên mã GmDREB1 của đậu tƣơng trong điều kiện hạn [7]. Trình tự gen GmDREB1 của giống đậu * Tel: 0913.383.289; Email: mauchdhtn@gmail.com tƣơng Xanh lơ - Ba bể (Bắc Kạn) với kích thƣớc 717 bp, vùng mã hóa amino acid dài 705 bp cũng đã đƣợc nhóm chúng tôi phân lập, xác định trình tự và đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế [4]. Với định hƣớng nghiên cứu tìm kiếm sự sai khác trong cấu trúc gen GmDREB1 ở các giống đậu tƣơng có khả năng chịu hạn khác nhau, trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả so sánh trình tự gen GmDREB1 của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng (Vàng Ngân Sơn-CYS và Cúc lông Phú Bình-CPB) có khả năng chịu hạn khác nhau. Đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS dài 704 bp, còn đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CPB dài 705 bp. So sánh trình tự nucleotide cho thấy, hệ số tƣơng đồng về gen GmDREB1 của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu là 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng CYS và CPB là 98,2%. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 126 Sƣ̉ dụng hạt của giống đậu tƣơng địa phƣơng Cúc Vàng Yên Sơn-Tuyên Quang (CYS) và Cúc lông Phú Bình-Thái Nguyên (CPB) do Viện nghiên cƣ́u Ngô Đan Phƣợng cung cấp năm 2009 làm vật liệu nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [ 4], nhân gen DREB 1 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi DREB 1soyF/DREB1soyR đƣợc thiết kế dƣ̣a trên trình tự củ a hai gen mang mã số AY 802779 và FJ 965342 trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI). Trình tự cặp mồi là: Tên mồi Trình tự mồi DREB1soyF 5’ GGA TCC ATG TTT ACC TTG AAT C 3’ DREB1soyR 5’ GAA TTC TTA AAT TGA GAA ATT CCA 3’ Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0% trong đệm TAE 1X với sƣ̣ có mặt của marker chuẩn , nhuộm bản gel trong ethydium bromide và soi dƣới ánh đèn cƣ̣c tím. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch (thôi gel) bằng bộ kít AccuPrep PCR Purification (Bioneer-Hàn Quốc). Sản phẩm sau khi tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α. Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng clony-PCR, plasmid đƣợc tách bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid mini Extraction. Trình tự nucleotide của gen GmDREB1 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tƣ̣ động tại Viện Công nghệ sinh học. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide đƣợc xƣ̉ lí bằng phần mềm BioEdit, DNAstar. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhằm xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu hạn, chúng tôi lựa chọn 2 giống đậu tƣơng địa phƣơng đã đƣợc đánh giá khả năng chịu hạn: Cúc Vàng Yên Sơn (chịu hạn tốt với chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 13574,77) và giống Cúc lông Phú Bình (chịu hạn kém với chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 5704,44) [4] để nghiên cứu phân lập và so sánh trình tự gen GmDREB1. Kết quả nhân gen DREB1 ở hai giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS và CPB Để phục vụ việc nhân gen DREB1, chúng tôi tách DNA tổng số từ hệ gen của hai giống đậu tƣơng nói trên. Kết quả tách DNA đạt chất lƣợng tốt, hàm lƣợng đủ để làm các nghiên cứu tiếp theo. Sau 30 chu kỳ phản ƣ́ng, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%. Kết quả điện di đã nhận đƣợc một đoạn DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 717 bp (hình 1), hàm lƣợng của sản phẩm PCR đủ lớn để thực hiện việc tách dòng gen DREB1. Độ dài của đoạn DNA vừa nhân đƣợc cũng phù hợp với lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB1 (M: marker 1 kb; 1. CYS; 2. CPB) Kết quả tách dòng gen DREB1 ở hai giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS và CPB Để xác định đƣợc trình tự gen GmDREB1, chúng tôi tiến hành tách dòng gen GmDREB1 của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu. Sản phẩm PCR thu nhận ở trên đƣợc tiếp tục tinh sạch và ghép nối vào vector tách ḍng pBT nhờ enzym nối T4 ligase. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong một giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh ampicillin (50µg/ml), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu đƣợc có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng. Chúng tôi lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin với nồng độ 50µg/ml, M 1 2 717 bp Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 127 tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370C, qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp. Sau đó kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzym giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả tách dòng gen GmDREB1 cho thấy, băng 2700 bp là băng của vector pBT còn băng 717 bp là băng của gen GmDREB1. Sản phẩm tách plasmid đúng kích thƣớc, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide. Để khẳng định chính xác băng 717 bp là gen GmDREB1 chúng tôi tiếp tục đọc trình tự gen này. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS và CPB Để xác định chính xác trình tự nucleotide của gen GmDREB1 đã đƣợc tách dòng, chúng tôi tiến hành gửi đọc trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer . Kết quả xác định trình tự đƣợc so sánh trên BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen GmDREB1 mà chúng tôi phân lập có độ tƣơng đồng cao (trên 90%) so với trình tự gen GmDREB1 trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen GmDREB1 của 2 mẫu nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác. Sau khi so sánh trình tự gen, chúng tôi nhận đƣợc đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở hai mẫu đậu tƣơng CYS và CPB có chiều dài lần lƣợt là 704 bp (CYS) và 705 bp (CPB). Để xác định sự khác biệt về trình tự nucleotide, chúng tôi tiến hành so sánh trình tƣ̣ nucleotide của gen GmDREB1 phân lập từ hai giống đậu t ƣơng CYS và CPB. Mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide đƣợc thể hiện ở hình 2. Hình 2. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng địa phƣơng CYS và CPB Khi so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS và CPB, chúng tôi nhận thấy trình tự nucleotide của hai mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với hệ số tƣơng đồng là 99,2%. Trình tự nucleotide của giống đậu tƣơng CYS và CPB Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 128 chỉ sai khác 5 vị trí lần lƣợt là 60, 627, 634, 678, 700 (bảng 1). Bảng 1. Vị trí khác biệt về trình tự nucleotide của gen GmDREB1 ở CYS và CPB 60 627 634 678 700 CPB T T G G A CYS C G C T - Đặc biệt, ở vị trí 700, giống CPB là nucleotide A còn giống CYS bị thiếu hụt mất nucleotide ở vị trí này nên kích thƣớc đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống CYS dài 704 bp, còn đoạn mã hóa của giống CPB dài 705 bp. Trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS với giống CPB đều dài 234 amino acid. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS với giống CPB cho kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3. Dựa trên dữ liệu về trình tự gen GmDREB1 của 5 mẫu ở trên, chúng tôi thiết lập sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của năm giống đậu tƣơng (hình 4). Kết quả cho thấy, 5 giống đậu tƣơng đƣợc chia thành 3 nhóm: nhóm 1 gồm 3 mẫu AY802779, FJ965342, FR822736; nhóm 2 chỉ có giống CPB; nhóm 3 chỉ có giống CYS. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn trong protein GmDREB1 của 5 mẫu trên cho thấy hệ số trƣơng đồng về amino acid trong protein GmDREB1 tƣơng đối cao (97% - 100%), trong đó CPB tƣơng đồng 100% so với FJ965342. Khi thiết lập hình cây, chúng tôi nhận đƣợc hình cây mô tả quan hệ di truyền của các mẫu có sự khác biệt với khi so sánh trình tự nucleotide (hình 5). Hình 3. So sánh trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở giống đậu tƣơng VNS và CPB Hình 4. Mối quan hệ di truyền của các giống đậu tƣơng dựa trên phân tích trình tự nucleotide của gen GmDREB1 Bảng 3. Hệ số tƣơng đồng về amino acid trong protein DREB1 của CPB, CYS, FJ965342, AY802779, FR822736 Nucleotide Substitutions (x100) 0 0.4 AY802779.seq FR822736.seq FJ965342.seq CPB.seq CYS.seq Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 129 CPB CYS FJ965342 AY802779 FR822736 CPB 100 98,2 100 99,5 98,7 CYS 100 98,2 97,8 97,0 FJ965342 100 99,5 98,7 AY802779 100 98,2 FR822736 100 Hình 5. Mối quan hệ di truyền của các giống đậu tƣơng dựa trên phân tích trình tự amino acid trong protein GmDREB1 Hình 5 cho thấy, 5 mẫu so sánh trình tự amino acid trong protein GmDREB1 chia thành 2 nhóm: nhóm 1 gồm 4 mẫu AY802779, FJ965342, FR822736, CPB; nhóm 2 chỉ có mẫu CYS. Sự khác biệt về trình tự nucleotide và trình tự amino acid nói trên là cơ sở để chúng tôi mở rộng nghiên cứu về gen GmDREB1 ở các giống đậu tƣơng có khả năng chịu hạn khác nhau nhằm xác định chỉ thị phân tử phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu tƣơng chịu hạn. KẾT LUẬN Đã khuếch đại, chọn dòng và đọc trình tự đƣợc gen GmDREB1 của hai giống đậu tƣơng CYS (chiều dài là 704 bp) và CPB (chiều dài là 705 bp). Độ tƣơng đồng giữa trình tự gen GmDREB1 của giống đậu tƣơng CYS và CPB là 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng CYS và CPB là 98,2%. Thiết lập đƣợc sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu với một số đậu tƣơng dựa trên các trình tự gen GmDREB1 và trình tự amino acid do gen GmDREB1 mã hoá trên Ngân hàng gen NCBI. LỜI CẢM ƠN: Công trình được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài thuộc Dự án TRIG. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Charlson D.V., Hu X., Okimoto B. và Purcell L.C. (2009), Glycine max cultivar Jackson drought responsive element binding. NCBI, Accession FJ965342, [2]. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G. (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of soybean. NCBI, Accession AY802779, [3]. Gawel N. J., Jarret R. L., 1991: Genomic DNA isolation. Weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn [4]. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Minh Hồng, Hoàng Văn Mạnh, 2011, Đặc điểm của gien DREB1 phân lập từ giống đậu tƣơng địa phƣơng Glycine max (L.) Merrill) Xanh lơ Ba Bể (Bắc Kạn), Tạp chí sinh học, 33(1): 74-79. [5]. Stolf-Moreira R, Medri ME, Neumaier N, Lemos NG, Brogin RL, Marcelino FC, de Oliveira MC, Farias JR, Abdelnoor RV, Nepomuceno AL., 2010: Genet Mol Res., 9(2):858-67. [6]. Nguyen, T.V.T., Chu, M.H., Hoang, M.V. and Nguyen, H.T.M. (2011), Glycine max cv. Xanhlo-Babe DREB1 gene for drought responsive. NCBI, Accession FR822736, . Nucleotide Substitutions (x100) 0 1.3 FR822736.pro CPB.pro AY802779.pro FJ965342.pro CYS.pro Chu Hoàng Mậu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/2: 125 - 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 130 SUMMARY COMPARE OF DREB1 GENE SEQUENCING FROM TWO VIETNAMESE LOCAL SOYBEAN CULTIVARS (CUC VANG YEN SON VÀ CUC LONG PHU BINH) Chu Hoang Mau 1* , Nguyen Vu Thanh Thanh 2 , Pham Minh Duy 2 , Hoang Van Manh 3 1Thai Nguyen University, 2College of Science - TNU, 3Institute of Life Science - TNU DREB transcription factor is a dehydration responsive element (DRE) binding protein. It can specifically interact with the dehydration-responsive element/C-repeat (DRE/CRT) cis-acting element contained in the promoter region of many stress-inducible genes, and can therefore control the expression of many stress- inducible genes in plant and increase strong tolerance to drought, low temperature and high salt. Dehydration responsive element (DRE) with the core sequence A/GCCGAC and similar elements CRT (C- repeat) were identified as an important cis-acting element in regulating gene expression under drought, high salt, and cold stresses. In this study, we present results amplification, cloning and sequencing of GmDREB1 gene from genome of vietnamese soybean cultivars (Cuc Long Phu Binh and Cuc Vang Yen Son). The PCR products containing the GmDREB1 fragments were cloned into pBT and sequenced. This gene is 717 bp. The gene sequences of these two varieties have similar high levels reached 99,2%, amino acid sequence of the protein encoded by two genes have similar levels reached 98,2%. When compared with the nucleotide sequencing of GmDREB1 gene of two soybean cultivars (Cuc long Phu Binh and Cuc Vang Yen Son) with three the soybean cultivars (AY802779, FJ965342, FR822736) showed the similarities of the five varieties ranged from 99,0% to 99,8%. Amino acid sequences of GmDREB1 of the the soybean cultivars ranged from 97,0% to 100%. Need further studies to designed vector carrying the GmDREB1 gene structure for creating transgenic soybeans drought-resistant. Key words: drought tolerance, GmDREB1 gene, Glycine max, local soybean, transcription factors * Tel: 0913.383.289; Email: mauchdhtn@gmail.com