Sinh học - Kiến thức ôn tập

Kiến thức ụn tập  Cấu trỳc phõn tử DNA  Cấu trỳc gen và hệ gen Thành phần cấu tạo của DNA- cỏc bazơ Purines Pyrimidines [structure of deoxyadenosine] Nucleoside Nucleotide Cỏch gọi tờn Purines adenine adenosine guanine guanosine Pyrimidines thymine thymidine cytosine cytidine +ribose uracil uridine Nucleoside Nucleotide Base +deoxyribose +phosphate • polynucleotide chain • 3’,5’-phosphodiester bond ii). Structure of the DNA double helixStructure of the DNApolynucleotide chain 5’ 3’ A-T base pair G-C base pair Chargaff’s rule: The content of A equals the content of T, and the content of G equals the content of C in double-stranded DNA from any species Hydrogen bonding of the bases HỆ GEN & GEN :CẤU TRÚC, TỔ CHỨC DNA của hệ gen được “đúng gúi” trong NST  Lượng DNA cú trong mỗi tế bào người cú thể dài 5.8 feet (2 m) nếu được kộo duỗi dài ra  Để cú thể nằm gọn trong cỏc tế bào nhỏ bộ, mỗi NST được đúng gúi ở nhiều cấp khỏc nhau.  Cỏc DNA được đúng gúi lại đươc gọi là thể nhiễm sắc (chromatin) Courtesy of Helmut Schiessel, Hỡnh. Thành phần cỏc hệ gen của eukaryotes, prokaryotes, và viruses. Cấu trỳc hệ gen ở Eukaryote Tổ chức hệ gen của người Hệ gen người 3000 Mb Gen và trỡnh tự liờn quan đến gen 900 Mb ADN mó húa 90 Mb ADN khụng mó húa 810Mb ADN lặp lại 420 Mb Trỡnh tự lặp lại duy nhất và cú bản sao thấp 1680 Mb Trỡnh tự ADN giữa cỏc gen 2100Mb Pseudo- gen Cỏc đoạn gen Intron, leader, trailer ADN lặp lại liền kề ADN lặp lại phõn bố rải rỏc ADN satellite Micro- satellite LTRs SINEs mini- satellite LINEs ADN transposonStrachan & Read,1996 Figure 8.13 Genomes 3 (â Garland Science 2007) Hệ gen lục lạp ở lỳa DNA  RNA  Protein  Function Học thuyết trung tõm:The Central Dogma Transcription Replication Translation Work Phõn loại Gene coding genes non-coding genes Messenger RNA Proteins Structural RNA Structural proteins Enzymes transfer RNA ribosomal RNA other RNA Chromosome (simplified) intergenic region Cấu trỳc gen ở sinh vật prokaryote • Trong bộ gen của prokaryote cỏc gen cú cấu trỳc tương đối đồng nhất, phần lớn cỏc gen mang mó di truyền, nhiều gen cựng hướng trao đổi chất tập hợp thành cỏc operon • Operon gồm nhiều cistron cú chung vựng điều khiển và vựng kết thỳc, mỗi cistron tương đương với một gen mó hoỏ protein ở sinh vật bậc cao • Trong một operon, quỏ trỡnh phiờn mó khởi đầu từ cistron thứ nhất đến cistron cuối cựng, khụng cú quỏ trỡnh gắn mũ và gắn đuụi polyA, phiờn mó đồng thời với dịch mó. Hiện tượng cỏc gen cựng hướng trao đổi chất hợp thành cỏc operon, tương đối phổ biến ở vi khuẩn, giỳp cho vi khuẩn thớch ứng nhanh với điều kiện mụi trường. Cấu trỳc tổng quỏt gen mó hoỏ protein ở Eukaryote Kớch thước và số lượng gen  Kớch thƣớc trung bỡnh của gen:  Vikhuẩn: 1100bp  Nấm men: 1200 bp  Giun: 5000 bp  Ngƣời: 27000 bp  Thực vật: 2-4000 bp  Khoảng cỏch trung bỡnh giữa cỏc gen  Vi khuẩn: 118bp  Nấm men: 700 bp  Ngƣời: overlap (trựng lấp) đến 1 Mb  Kớch thƣớc exon  Trung bỡnh 125 bp  Một số exon đặc biệt mó hoỏ protein: 1300-1400bp  Kớch thƣớc intron  Rất biến động. Ở ngƣời cú thể > 5kb Sự biến động về kớch thước, số lượng gen  Gen cú độ biến động rất lớn về kớch thước và số lượng  Độ lớn của gen được quyết định chủ yếu bởi độ dài của cỏc đoạn intron  Động vật cú vỳ: 1-100kb  Dystrophin là gen lớn nhất đó biết: 2500 kb Cỏc gen cú độ lớn < 10 kb ở người Percentages describe exon content to the length of the gene Cỏc gen cú độ lớn < 100 kb ở người Cỏc gen cú độ lớn > 100 kb ở người So sỏnh cỏc gen mó hoỏ cú cựng chức năng ở sinh vật Sự tƣơng đồng của gen (orthologous genes) giữa ngƣời và cỏc nhúm sinh vật khỏc Chƣơng II. Cỏc kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của cỏc enzyme giới hạn  Giới thiệu cỏc vector nhõn dũng và kỹ thuật nhõn dũng gen  Cỏc phƣơng phỏp lai phõn tử (phƣơng phỏp tạo mẫu dũ, lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xỏc định trỡnh tự DNA  Phƣơng phỏp PCR  Cỏc kỹ thuật xỏc đinh tớnh đa hỡnh DNA (dựa trờn PCR, dựa trờn RELP)  Kỹ thuật tạo thƣ viện hệ gen và cDNA Enzym giới hạn (restriction enzymes-RE)  Khái niệm:là các enzyme có khả năng nhận dạng và cắt AND chỉ ở những vị trí đặc hiệu nhất định. EcoRI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Hind III 5’ AAGCTT 3’ 3’ TTCGAA 5’ Lịch sử phỏt hiện  1950s: một số dũng vi khuẩn cú khả năng chống lại sự xõm nhiễm của một số bacteriophages.  1962: phỏt hiện cỏc vi khuẩn này cú chứa hệ thống enzyme cú khả năng nhận biết và phỏ huỷ DNA của phage, đồng thời cú khả năngtự biến đổi DNA của bản thõn để trỏnh bị phỏ huỷ  1970, Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phỏt hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: cú khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoỏ DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ. Phân loại các RE  Loại I: Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotit  Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn.  Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó khoảng 20 nucleotide. Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II – EcoRI E = Escherichia Tờn genus co = coli Tờn species R = strain RY12 Tờn strain or serotype I = chữ số la mó = Thứ tự tỡm ra enzyme – HinDIII Haemophilus influenza serotype d 3rd enzyme Đặc điểm của trỡnh tự nhận biết: palindromes: (Đọc ngược đọc xuụi đều giống nhau) Hind III AAGCTT TTCGAA Pst 1 CTCGAG GAGCTC Bam H1 GGATCC CCTAGG Mỗi enzyme cắt giới hạn RE có khả năng nhận biết các trình tự đặc hiệu có từ 4-8 cặp nucleotide trên chuỗi AND. ở vị trí này các cặp base có cấu trúc đối xứng đặc biệt, đọc xuôi và ng-ợc theo chiều 5' đến 3' đều giống nhau gọi là cấu trúc palindron And E.T. saw waste DNA. Anne, I vote more cars race Rome to Vienna. Are poets a waste? Opera! Boston, O do not sob. Cigar? Toss it in a can, it is so tragic. Desserts, I stressed! Do not start at rats to nod. Reign at Tangier. Tần xuất cắt của RE  Nếu giả thiết trỡnh tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thỡ xác suất để một đoạn trỡnh tự đ-ợc nhận biết sẽ là 4n ( n là chiều dài (bp) của chuỗi đ-ợc nhận biết). Số nucleotit của đoạn nhận biết (n) xác suất xảy ra sự kiện phân cắt bởi RE 4 1/ 44= 1/256 5 1/ 45= 1/ 1024 6 1/ 46= 1/ 4096 8 1/ 48= 1/ 65.536 n 1/ 4n Cỏc kiểu cắt: Tạo đầu so le và đầu bằng 5’ overhangs 3’ overhangs blunt ends Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết EcoRI Escherichia coli GA-A-T-T - C C - T-T-A-AG EcoRV Escherichia coli G-A-TA-T-C C-T-AT-A-G TagI Thermus aquaticus TC-G-A A-G-CT HbaI Haemophilus baemoliticus GC-G-C C-G-CG DdeI Desulfovibrio desulfuricans CT-N-A-G G-A-N-TC MboII Moraxella bovis GA-A-G-A-(N)8  C-T-T- C-T-(N)7  Pst I Providencia stuarti C -T -G-C-AG GA-C- G-T- C Một số loại enzym giới hạn Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết MstII Microcoleus stuarti c-c  t-n-a-g-g g-g-a-n-t c-c NotI Nocardia otitidiscaviarum G-C  G-G-C-C-G-C C-G-C-C-G  G-C-G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens GG-A-T-C - C C - C-T-A-GG Hae III Haemophilus aegyptius G-GC-C C-CG-G HhaI Haemophilus haemolyticus G-G-CC CC -G-G Ứng dụng của RE  Tạo DNA tỏi tổ hợp  Lập bản đồ giới hạn Tạo DNA tỏi tổ hợp  ADN tỏi tổ hợp là cỏc ADN được tạo thành từ ớt nhất hai đoạn ADN cú nguồn gốc khỏc nhau thụng qua vi thao tỏc của con người Nếu nh- 2 (hay nhiều) ADN đều đ-ợc cắt bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt của các đoạn ADN đ-ợc tạo ra hoàn toàn khớp nhau (t-ơng ứng theo qui tắc bổ sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym ligase. Từ đây xuất hiện khả năng chắp nối các ADN có nguồn gốc khác nhau để tạo nên ADN tái tổ hợp Tạo phân tử DNA tái tổ hợp BẢN ĐỒ GIỚI HẠN  Là bản đồ thể hiện loại enzym giới hạn, số lượng và kớch thước cỏc đoạn DNA bị cắt bằng enzym giới hạn.  Một phõn tử khi sử dụng cỏc loại enzym khỏc nhau cú thể cho nhiều đoạn cắt khỏc nhau hỡnh thành nờn cỏc bản đồ giới hạn khỏc nhau.  Được sử dụng trong xỏc định nguồn gốc hoặc sự khỏc nhau giữa cỏc cỏ thể trong loài. PHƢƠNG PHÁP LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN  Tỏch chiết DNA mẫu nghiờn cứu và thực hiện PCR tạo ra một lượng DNA cần thiết.  Lựa chọn cỏc enzym giới hạn thớch hợp, xử lý enzym giới hạn cỏc mẫu trong điều kiện thớch hợp.  Điện di kết quả trờn gel agarose cựng với thang DNA chuẩn, tớnh toỏn kết quả và lập bản đồ. Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn ADN nghiên cứu (kích th-ớc 17kb). Kết quả cho 3 đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nh-ng ch-a rõ đoạn 3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi. Khi cắt sợi ADN nghiên cứu bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ enzym này chỉ có một điểm cắt trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym 1. Nh- vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi. VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN Chƣơng II. Cỏc kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của cỏc enzyme giới hạn  Giới thiệu cỏc vector nhõn dũng và kỹ thuật nhõn dũng gen  Cỏc phƣơng phỏp lai phõn tử (phƣơng phỏp tạo mẫu dũ, lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xỏc định trỡnh tự DNA  Phƣơng phỏp PCR  Cỏc kỹ thuật xỏc đinh tớnh đa hỡnh DNA (dựa trờn PCR, dựa trờn RELP)  Kỹ thuật tạo thƣ viện hệ gen và cDNA Nhõn dũng AND (DNA CLONING)  DNA cloning là kỹ thuật dựng để tỏi sản xuất cỏc đoạn DNA .  Hai cỏch: ▪ sử dụng tế bào chủ ▪ dựng PCR  Một vector là yờu cầu cần thiết để mang đoạn DNA mục tiờu vào trogn tế bào chủ Vector nhõn dũng  Vector là cỏc phõn tử được dựng để mang cỏc đoạn AND/gen đó được tỏch dũng  Trong thực tế, một đoạn ADN lạ khụng thể duy trỡ và nhõn bản trong tế bào chủ mới nếu như nú được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn ADN đơn độc.  Do enzym ADN polymerase làm nhiệm vụ tỏi bản ADN khụng thể khởi đầu quỏ trỡnh tỏi bản từ bất kỳ địa điểm nào trờn ADN mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tỏi bản” (origins of replication)Cỏc đoạn ADN (cỏc gen) muốn tỏi bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vectơ (cloning vectors). Vectơ nhõn dũng thực chất là một phõn tử ADN cú gốc tỏi bản và cú thể nhõn lờn trong tế bào chủ đó chọn. Loại vectors Plasmid-based Virus-based Chromosome-based Phage-based Eukaryotic virus- based YAC BAC MAC Hybrid (phagemid, cosmid etc) Plasmid là các phân tử ADN vòng có cấu trúc chuỗi xoắn kép và có thể tự nhân bản. Chúng có mặt trong vi khuẩn và nằm ngoài cũng nh- độc lập với nhiễm sắc thể của vi khuẩn Plasmids Nhóm Plasmit pBR  Các plasmit pBR đ-ợc xem là các vectơ nhân dòng thế hệ 1. Các plasmit này đ-ợc F. Boyer và đồng nghiệp thiết kế. “p" = plasmid "BR" là tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues "332" là số thứ tự. 4363bp Cấu trỳc vector pBR322 Nhóm Plasmit pUC  Đây là nhóm các plasmit đ-ợc phát triển từ nhóm plasmit pBR322.  Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % ADN) đ-ợc cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 đ-ợc giữ lại.  Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC đ-ợc phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS). Nhóm Plasmit pUC  Đây là nhóm các plasmit đ-ợc phát triển từ nhóm plasmit pBR322.  Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % ADN) đ-ợc cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 đ-ợc giữ lại.  Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC đ-ợc phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS). Stt Vectơ Khả năng chứa đoạn ADN(kb) 1. Plasmit <10kb 2. Bacteriophage 9-20kb 3. Cosmit 33-47kb 4. BAC 100-300kb 5. YAC 100-1000kb Bảng. Khả năng chốn đoạn ADN ngoại lai của một số vectơ nhõn dũng Tiêu chuẩn của một vector nhân dòng  Chỉ cú một địa điểm nhận biết cho một enzym hạn chế nào đú.  Nếu nhƣ số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gõy rối loạn cho sự nhõn dũng sau này. Một vectơ nhõn dũng sẽ càng cú ý nghĩa hơn nếu nhƣ nú cú thể đƣợc cắt nhờ nhiều loại enzym giới hạn và tất nhiờn ứng với mỗi loại enzym cũng chỉ cú một địa điểm nhận biết.  Phải cú một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc  thớ dụ nhƣ tớnh khỏng khỏng sinh, tớnh xỳc tỏc cho cỏc phản ứng tạo mầu. Điều này cần thiết để cú thể chọn lọc đƣợc cỏc tế bào đó đƣợc chuyển nạp, dựa trờn cơ sở khỏng khỏng sinh, tạo phản ứng mầu của chỳng.  Phải cú điểm tỏi bản để đảm bảo sự nhõn lờn của chỳng trong tế bào chủ mới.  Trong một số trƣờng hợp một plasmit cú thể đƣợc sử dụng làm vectơ nhõn dũng cho hai tế bào chủ khụng cú liờn quan với nhau nhƣ E.coli và Bacillus subtilis. Cỏc vectơ hai chức năng này phải cú số điểm tỏi bản lớn hơn 1.  DNA cloning cho phộp chọn lọc và sao chộp bất kỳ một đoạn trỡnh tự đặc thự của DNA (Hoặc RNA) và sản xuất với một lượng khụng giới hạn  Là bước đầu tiờn trong một loạt cỏc thớ nghiệm về kỹ thuật di truyển ▪ Tạo thư viện DNA ▪ PCR ▪ DNA sequencing Nhõn dũng DNA Các b-ớc cơ bản của nhân dòng gen 1. Tách chiết ADN từ mẫu nghiên cứu, cắt ADN bằng enzym cắt giới hạn để tạo ra các đoạn ADN là nguyên liệu cho quá trình nhân dòng (tách dòng) 2. Gắn các đoạn cắt vào một vectơ nhân dòng 3. Chuyển nạp các vectơ nhân dòng sau phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật chủ để nhân bản các đoạn ADN đã đ-ợc gắn cùng với vectơ 4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành th- viện mẫu đã nhân dòng. Từ đây có thể chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm. Bước 1. Cắt mẫu DNA bằng RE Bước 2. Cắt PLASMID DNA bằng RE Bước 3. Nối mẫu DNA và PLASMID DNA Bước 4. Biến nạp  Biến nạp: là quỏ trỡnh chuyển DNA ngoại sinh vào trong 1 tế bào “transformation”  Cú hai phương phỏp để biến nạp DNA vào vi khuẩn :  Phương phỏp húa học sử dụng CaCl2 và shock nhiệt để thỳc đẩy DNA đi vào trong tế bào  Dựng xung điện (electroporation ): dung xung điện để kớch thớch quỏ trỡnh tế bào tiếp nhận DNA Biến nạp theo phương phỏp dựng CaCl2 và sốc nhiệt Biến nạp bằng xung điện Cỏc sản phẩm thu được sau biến nạp Plasmid + insert Ampicillin resistant Plasmid without insert Ampicillin resistant No plasmid No ampicillin resistance Làm thế nào để phõn biệt và chọn lọc đƣợc sản phẩm mong muốn? Cỏc phương phỏp chọn lọc  Chọn lọc dựa vào khỏng sinh  Chọn lọc trắng/ xanh  Chọn lọc dựa vào cỏc gen bỏo cỏo khỏc:Luciferase Chọn lọc dựa vào khỏng sinh Origin Basic selection Vector/No vector Negative selection Insert/No insert Disruption of KAN gene leads to NO RESISTANCE to Kan Chọn lọc õm tớnh Chọn lọc trắng xanh Dựa vào hệ thống lac Operon: điều khiển phản ứng đối với lactose trong tế bào E. coli  - galactosidaza &  - glucuronidaza Lactoza Galactoza + Glucoza  - galactosidaza -D-glucuronid + H2O Axít glucuronic + Glucoza  - glucuronidaza X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside  - g a la c to s id a z a 5-Brom-4-chlor-indigo X-Gluc 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-glucuronid  - g lu c u ro n id a z a 5-Brom-4-chlor-indigo Không màu Màu xanh sẫm _cleanup1.jpg Lac Z gene LacZ genepromotorRNA pol. Gene expression dogma DNA LacZ mRNARibosome β-galactosidase RNA Protein X-gal BLUE colonies WHITE coloniesX-gal LacZpromotor operator Repressor Lac Z gene LacZpromotorRNA pol. RNA pol. IPTG IPTG IPTG LacZpromotor operator IPTG IPTG RNA pol. X-gal Β-galactosidase X + galactose Cells which produce ò-galactosidase form BLUE colonies. Cells without ò-galactosidase production form WHITE colonies. XXX X X Plasmid without Insert Plasmid +Insert without plasmid Chọn lọc LacZ pGEM Insert WHITE colonies BLUE colonies promoto r operato r T T Bước 5. Nhõn nuụi trờn mụi trường và chọn lọc Bước 5. Nhõn nuụi trờn mụi trường và chọn lọc  Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì tồn tại đ-ợc trên môi tr-ờng và sinh khuẩn lạc (vì có plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh ).  Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hoá  -galactozidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn ADN ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nh-ng không gắn ADN ngoại lai, còn khuẩn lạc có mầu trắng chính là khuẩn lạc có chứa 1 đoạn ADN cần nhân dòng đ-ợc ghép vào. Movie on making recombinant DNA