Sinh học - Chương II: Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Phương pháp PCR  Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Các kỹ thuật xác đinh tính đa hình DNA (dựa trên PCR, dựa trên RELP)  Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA Kỹ thuật lai phân tử Cơ sở khoa học  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity) 1) DNA-DNA. 2) DNA-RNA. 3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể ) Các dạng phức hợp lai bổ sung Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới. Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN 42 C is more stringent condition that 35 C (hybridization is more specific) Lai Southern Lµ kü thuËt dïng ®Ó nhËn d¹ng mét ®o¹n DNA ®Æc thï dùa trªn trình tù thÓ hiÖn cña nã sau khi ®iÖn di trªn gel agarose. Ph-¬ng ph¸p nµy ®-îc ph¸t triÓn bëi Edwin Southern (1975) nªn ®-îc gäi lµ ph-¬ng ph¸p “Southern Blot”. Kỹ thuật Southern Blot cho biết Sự có mặt của đoạn ADN (gen) Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen) Độ lớn của đoạn ADN Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò .Edwin Southern University of Oxford Nguyên tắc  Southern Blot dùa trªn khả năng giữ l¹i c¸c ®o¹n ADN ®· qua xö lý enzyme giíi h¹n, trªn mét mµng máng ®Æc biÖt (Hybond - N).  Mµng máng nµy sau ®ã ®-îc ng©m trong dung dÞch chøa mẫu dò ®· cho ë d¹ng cã ®¸nh dÊu 32P. NÕu cã mÆt gen ®· cho trong ADN trªn mµng máng thì c¸c ®o¹n ADN cña cïng gen sÏ b¾t cÆp (lai) theo c¬ chÕ bæ sung (complementation) vµ nhËn biÕt qua phãng x¹ tù ghi. C¸c b-íc tiến hành 1. ChuÈn bÞ mÉu:  ChiÕt t¸ch ADN nghiªn cøu, c¾t ADN nghiªn cøu b»ng enzym giíi h¹n, kÕt quả cho mét hçn hîp c¸c ®o¹n c¾t cã kÝch th-íc kh¸c nhau.  TiÕn hµnh ®iÖn di hçn hîp sản phÈm c¾t trªn gel ®Ó t¸ch c¸c ®o¹n DNA  Lµm biÕn tÝnh (t¹o thµnh c¸c sîi ®¬n) c¸c băng ADN trªn gel ®iÖn di b»ng c¸ch xö lý gel với nhiệt độ cao hoặc ®iÖn di 20 phót trong dung dÞch NaOH 0,5M hoÆc NaCl1,5 M C¸c b-íc tiến hành (tiếp) 2. ThÊm truyÒn (blotting):  ĐÆt gel lªn hÖ thèng gi¸ chuyÓn (m¸y Blotting) ®Ó chuyÓn nguyªn vÑn c¸c ADN ®· biÕn tÝnh trªn gel lªn mµng lai (mµng nitrocellulose, mµng nylon (giữ chÆt c¸c ®o¹n ADN ®-îc chuyÓn lªn tõ gel ®iÖn di). PhÝa trªn ®Ó mét líp giÊy thÊm. Trªn cïng ®Æt mét vËt nÆng  Qu¸ trình thÊm truyÒn thùc hiÖn víi dung dÞch dÉn chuyÓn lµ NaOH 0,5M trong 8-12h. C¸c b-íc tiến hành (tiếp) 3. Lai ph©n tö  C¸c ®o¹n ADN cè ®Þnh trªn mµng lai ®-îc ®em lai víi dung dÞch mÉu dß ®· ®-îc ®¸nh dÊu hoÆc b»ng p32 hoÆc mét chÊt g©y phản øng mµu. Qu¸ trình ®-îc thùc hiÖn ë buång lai (nhiÖt ®é 65- 680 C) trong thêi gian 3- 12 giê.  Röa mµng lai ë 650 C b»ng dung dÞch SSC (NaCl 3M, natri citrat 0,3 M vµ n-íc, pH=7.0) ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng tham gia phản øng lai. C¸c b-íc tiến hành (tiếp) 4. X¸c ®Þnh kÕt qña b»ng kü thuËt phãng x¹ tù ghi (autoradiogragh).  Mµng lai sau khi ®-îc lµm kh«, lÊy mét tÊm phim nh¹y X quang ®Æt lªn mµng lai vµ ®Ó trong mét thiÕt bÞ chuyªn dông. Xö lý ¸nh s¸ng tö ngo¹i, N¬i xảy ra phản øng lai sÏ mang ho¹t tÝnh phãng x¹ (do cã mÆt mÉu dß), VÞ trÝ xảy ra phản øng lai sÏ ph¸t x¹ vµo phim. Tr¸ng phim sÏ thu ®-îc c¸c vÕt ®en t¹i n¬i ph¸t x¹ ®Þa ®iÓm lai. Southern Blot Technique Southern Blot Technique  MOVIE_Southern Blot Ph-¬ng ph¸p Northern Blot  Ph-¬ng ph¸p lai Northern Blot lµ ph-¬ng ph¸p lai ARN cña tÕ bµo víi mÉu dß ADN. VÒ mÆt nguyªn lý vµ c¸c b-íc tiÕn hµnh còng t-¬ng tù nh- ph-¬ng ph¸p trªn.  Phương pháp này cho biết  Sự có mặt của mARN trong mô  Mức độ thể hiện của gen  Độ lớn của mRNA  Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò Northern blot Western blot  Lai Western Blot ®-îc thùc hiÖn giữa c¸c protein víi nhau dùa trªn nguyªn t¾c phản øng miÔn dÞch giữa kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ  Phương pháp này cho biết:  Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô  Mức độ thể hiện của gen  Độ lớn của protein Các bước tiến hành - Western Blot Mixture of protein molecules Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm So sánh 3 phương pháp lai Blot Type Matrix Molecule Detection Southern agarose DNA nucleic acid northern agarose RNA nucleic acid western polyacrylamide Protein antibody