Sinh học - Chương 4: Di truyền tế bào xoma và kỹ thuật di truyền thực vật

7/18/15 1 CHƢƠNG 4 DI TRUYỀN TẾ BÀO XOMA VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN THỰC VẬT 4.1. Các khái niệm và đặc điểm tiếp cận nghiên cứu di truyền tế bào xoma thực vật 4.1.1. Khái niệm đột biến xoma và biến dị dòng tế bào xoma - Đột biến ở tế bào xoma tồn tại ở hai trạng thái: tiềm ẩn và thể hiện tính trạng. -Dòng tế bào xoma là khối tế bào xoma đưa vào môi trường nuôi cấy. Những tế bào biến đổi có thể phân chia tạo nên một khối tế bào => cây. Cây có thể có những biến đổi khác so với dạng ban đầu => biến dị dòng tế bào xoma. - Dòng tế bào xoma - có sẵn => tách dòng => cây biến đổi - Trong quá trình nuôi cấy => biến đổi => cây tái sinh biến đổi 4.1.2. Phân lập các đột biến xoma - Phân lập các đột biến chồi - Các biến đổi xuất hiện khi xử lý phóng xạ - Phân lập bằng nhân vô tính 4.2. Biến dị dòng tế bào xoma 4.2.1. Nguyên nhân và các yếu tố ảnh hưởng tới sự xuất hiện các biến dị dòng tế bào xoma a. Nguyên nhân - Tính không đồng nhất về di truyền của các tế bào xoma ở vật liệu ban đầu đưa vào nuôi cấy. - Các yếu tố của quá trình nuôi cấy có thể trực tiếp gây ra các biến dị di truyền và các tân biến. b. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự xuất hiện các biến dị dòng xoma - Mức độ thể hiện các biến dị dòng tế bào phụ thuộc vào kiểu gen, vào nguồn gốc mô nuôi dùng để tạo calus hay dùng để tách tế bào trần. - Điều kiện nuôi cấy và tái sinh cây có ảnh hưởng rất lớn tới biến dị dòng tế bào. - Các dạng phytohoocmon khác nhau và chế độ nuôi cấy có thể gây nên những biến đổi khác nhau ở quần thể tế bào nuôi. 4.2.2. Một số đặc điểm trong ứng dụng phương pháp chọn lọc ở hệ thống in vitro Mỗi tế bào sống tách ra từ cơ thể, khi ở điều kiện thích hợp đều có khả năng phân chia và phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh (tính toàn năng của tế bào). Quá trình nuôi cấy invitro ở thực vật gồm 3 công đoàn: + Tạo các vật liệu nuôi cấy: các tổ chức mô nuôi khác nhau được vô trùng, các tế bào đơn, tế bào trần... + Quá trình nuôi cấy: sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau, điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ... để thu các khối tế bào, các phôi xoma, chồi bất định, cây non... + Các chồi được tách ra, cây non được nuôi dưỡng, đưa ra bầu đất để thu cây trưởng thành. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 2 4.2.3. Các biến dị dòng tế bào xoma khi nuôi cấy tế bào trần dung hợp - Tế bào trần: là tế bào đã được phân huỷ vỏ cứng (thành tế bào thực vật) bằng: + Phương pháp cơ học + Phương pháp enzym + Phương pháp cơ học:  Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ xenlulose, sử dụng kim nhọn và dao phẫu thuật để tách cắt các mô cùng lớp vỏ.  Sau đó ngâm vào môi trường cấy pha loãng, TBC phồng to và tách khỏi vỏ xenlulose => tế bào trần. + Phương pháp enzyme: Enzyme: + Pectinase : phá huỷ pectin + Xenlulase phá huỷ xenlulose + Hemixenlulase: phá huỷ hemixenlulose Tế bào trần được thu nhận bằng máy li tâm, sau đó được rửa sạch. + Dung hợp tế bào trần - Các phương pháp dung hợp tế bào trần: + Sử dụng hoá chất polyethylenglycol (PEG). PEG có tác dụng tạo lực hút các tế bào trần + Sử dụng xung điện -Dung hợp tế bào trần có thể xảy ra rất nhiều trường hợp khác nhau như: + Nhân lai, bào chất thuộc về một trong hai bố mẹ + Nhân lai, bào chất lai + Nhân thuộc về một trong hai bố mẹ, bào chất lai Cybrid N Hybrid C¸c trêng hîp trong lai soma Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 3 4.3. Tạo dòng đồng hợp tử và đa dạng di truyền các quần thể chọn lọc 4.3.1. Các phương pháp tạo cây đơn bội - Thường ta sử dụng kỹ thuật tự phối nhiều đời để thu dòng đồng hợp tử (dòng thuần) - Tạo cây đơn bội (n) => lưỡng bội hoá (2n). Thông qua sinh sản vô phối và nuôi cấy tiểu bào tử. 4.3.2. Đặc điểm và khả năng ứng dụng của các cây đơn bội a. Đặc điểm: - Xuất hiện các biến dị không mong muốn như bạch tạng .. - Sức sống giảm hơn so với cây bình thường - Tác động của nuôi cấy có thể tạo nên một số đột biến ở nhân và ở các bào quan khác. b. Ứng dụng - Tạo các đột biến và chọn lọc ở mức đơn bội - Chuyển nạp gen ở mức độ đơn bội - Tạo dòng đồng hợp tử 4.3.3. Nuôi cấy phôi trong lai xa và tạo sự đa dạng di truyền của quần thể chọn lọc a. Nuôi cấy phôi trong lai xa - Trong lai xa giữa các loài, các chi nhiều biến cố có thể xảy ra đối với quá trình phát triển phôi và nội nhũ: xuất hiện các không bào trong bào chất, bào chất nghèo các cơ quan tử, mất cân đối trong phát triển phôi và nội nhũ, nội nhũ kém hoàn chỉnh... => phôi con lai xa kém sức sống. - Nuôi cấy phôi lai xa trong môi trường nhân tạo các tác dụng khắc phục những thiếu hụt mà nội nhũ không đủ đảm nhận, hoàn thiện phát triển phôi để thu nhận cây lai xa. b. Ứng dụng của nuôi cấy phôi + Các phôi kém phát triển, không có sức sống thu được trong lai xa giữa các loài. + Bảo toàn tính đa dạng ở quần thể phân ly + Hạt không nảy mầm ở điều kiện thông thường, hạt có thời gian ngủ nghỉ lâu + Nuôi cấy phôi non trong các thực nghiệm tạo cây tái sinh và tác động chọn lọc ở invitro + Phôi non được sử dụng như một trong các dạng mô nuôi được đưa vào nuôi cấy invitro nhằm tạo callus và thu cây tái sinh. 4.4. Chỉ thị phân tử 4.4.1. Các enzyme giới hạn, phương pháp RELP a. Các enzyme giới hạn và tính chất của chúng - Trong tế bào vi khuẩn có những enzyme đặc biệt, chúng có khả năng nhận biết các ADN lạ của phage thâm nhập vào và phân huỷ chúng làm hạn chế sự sinh sản của phage => đó là các enzyme giới hạn. - Các enzyme giới hạn chỉ cắt ADN lạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mà không cắt ADN của mình. Vì vi khuẩn còn có enzyme sửa đổi, có tác dụng bổ sung một nhóm phân tử vào gốc bazơ của ADN tế bào chủ, làm nó khác với ADN lạ, vì thế nó không bị cắt bởi enzyme giới hạn. - Cơ chế hoạt động của enzyme giới hạn: các enzyme này nhận biết một trật tự nucleotit đặc thù trên phân tử ADN và cắt ADN tại vị trí đó. Sự cắt xảy ra ở liên kết photphodiester giống như các enzyme endonuclease. - Theo phương thức cắt ADN các enzyme giới hạn chia làm 2 nhóm: + Nhóm 1 bao gồm các enzyme có khả năng nhận biết một đoạn trình tự đặc hiệu về các nhận biết. + Nhóm 2 bao gồm các enzyme có đặc điểm là cắt ADN tại điểm nhận biết đặc hiệu - Sự cắt của enzyme giới hạn ở ADN xảy ra theo 2 cách: + Cắt theo hình zigzag tạo đầu đứt lệch (đầu dính) + Cắt thẳng tạo các đầu đứt tù Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 4 Escherichia coli Bacillus amyloliquefaciens Haemophilus intluenzae Haemophilus egyptius Arthrobacter luteus * Chỉ thị phân tử chia làm 4 loại chính:  Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: RFLP  Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: RAPD, AFLP, SSR, SNP, STS, CAP.  Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại  Các chỉ thị khác b.RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)  Chỉ thị RFLP được ứng dụng đầu tiên bởi Bitstein et al. (1980) để xây dựng bản đồ liên kết di truyền ở người. RFLP cũng được ứng dụng để nghiên cứu di truyền trên nhiều đối tượng thực vật như: lúa, ngô, cà chua, bông .  Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội tức là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen. Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử AA hoặc aa và các cá thể dị hợp tử Aa. Do sử dụng mẫu dò mang tích đặc hiệu nên chỉ thị này có độ chính xác cao, dùng để kiểm tra các chỉ thị phân tử. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn thời gian, sức lực và khối lượng công việc lớn. 4.4.2. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, phƣơng pháp RAPD (Radomly Amplyfied Polymorphic DNA - Đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên) PCR:  - Phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là kỹ thuật nhân đoạn ADN đặc hiệu do Kary Mullis phát hiện.  - Phản ứng chuỗi trùng hợp cho phép tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn ADN cần chọn từ genom mà không cần tách và nhân dòng. RAPD:  Chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi nó biểu hiện sự có mặt hay không có mặt những băng ADN đặc trưng. Vì vậy không phân biệt được thể dị hợp tử.  Chỉ thị RAPD có ưu điểm không cần biết trước thông tin về trình tự ADN để thiết kế mồi, rẻ tiền, nhanh. Tuy nhiên nhược điểm của nó là do sử dụng mồi ngắn và nhiệt độ kết cặp thấp (34 - 370C) nên độ chính xác không cao.  RAPD phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ những dòng nhị bội, những dòng cận phối và các quần thể lai trở lại. Các loại chỉ thị phân tử khác: - Chỉ STS. - Chỉ thị CAPs (Cleaved Amplification Polymorohism - Đa hình đoạn nhân bội bị cắt giới hạn) - Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site - Vị trí được đánh dấu bởi trình tự) - Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism - Đa hình của các Nucleotide đơn) - SCAR (Sequence Characterized Amplified Region - Vùng khuếch đại trình tự đặc trưng) - RGA (Resistance Gene Analog - Vùng tương tự gen kháng) 7/18/15 5 4.4.3. Đặc điểm của các phương pháp chọn lọc theo chỉ thị  Chỉ thị hình thái: Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi vì không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả nhất định, giúp các nhà nghiên cứu có thể phân biệt các giống, các vật liệu một cách nhanh chóng trên đồng ruộng. Các đặc điểm hình thái trong phân loại được sử dụng từ rất sớm. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: Hai đơn vị phân loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai đơn vị phân loại càng gần gũi nhau. Người ta thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh. Phương pháp dựa trên các tính trạng hình thái đưa đến thành công còn phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà chọn giống, hơn nữa phương pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loài đồng hình.  Chỉ thị enzyme Enzym là một dạng protein có khả năng xúc tác cho những phản ứng hóa sinh học, có tính đặc thù cao và hoạt tính có thể điều khiển được. Isoenzym hay isozym còn được gọi cách khác là các đẳng men, thực chất là những trạng thái khác nhau của một enzym. Các isozym của một enzym đều xúc tác cho một phản ứng, chỉ khác ở một số tính chất như nồng độ cơ chất hay độ pH mà ở đó nó có hoạt tính cao nhất. Việc phân tích isozym cho biết những alen đồng trội, là phương pháp tương đối rẻ, dễ tiến hành hơn các phương pháp phân tích ADN. Tuy nhiên do số lượng các isozym ít và chúng chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh chính xác bản chất di truyền của các cá thể.  Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN. Đặc điểm của chỉ thị phân tử là: - Rất đa hình - Là đồng trội hoặc trội - Không ảnh hưởng bởi môi trường Chỉ thị phân tử có nhiều loại, đa dạng và ổn định trong mọi giai đoạn của sinh vật. Chỉ thị phân tử có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị enzym. 4.5.1. Các bước của công nghệ nhằm thu nhận gen - Tách các đoạn ADN từ genom, - Thu ADN (gen) từ ARNm thông qua sao chép ngược - Phương pháp tổng hợp hoá học. 4.5. Chuyển nạp gen ở thực vật a. Tách các đoạn ADN từ genom - Mỗi phân tử ADN của genom được cắt ra nhiều mảnh nhờ các enzym giới hạn - Những đoạn cắt ADN được phân tách và phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel. Những đoạn ADN có thể được phân lập ra bằng sử dụng kỹ thuật tạo khối lai phân tử: + Sử dụng màng lọc notroxenlulose, ở đó được nạp các đoạn ADN mạch đơn có đánh dấu phóng xạ, các đoạn này phân bố ở màng lọc như những vệt băng. Những mẫu ADN thử này là các đoạn ADN đã biết trước kích thước và cấu trúc. + Các đoạn ADN trên gel được tách mạch đơn bằng kiềm, sau đó chúng thấm sang màng lọc khi cho gel và màng lọc áp sát nhau. Ở màng lọc những đoạn ADN nào tương đồng với các đoạn thử chúng sẽ tạo khối lai phân tử. Sau đó màng lọc được rửa sạch. Từ đó nhờ khối lai người ta tách được những đoạn ADN cụ thể trong hỗn hợp nhiều đoạn cắt. b. Thu nhân gen từ ARNm của gen tương ứng  - Phương pháp này được thực hiện nhờ sử dụng enzim ARN- dependent ADN- polymerase hay reverse transcriptase.  - Nhờ enzim sao chép ngược một gen bất kỳ được tổng hợp khi có ARNm của gen đó.  - ARNm được tách ra từ hỗn hợp các loại ARN nhờ cấu trúc chuỗi poly-A có ở đầu 3’. Người ta nạp các đoạn poly-dT vào cột xenlulose hay agarose. Khi đi qua, ARNm được giữ lại nhờ sự liên kết của chuỗi poly-A với poly-dT.Sau khi rửa các ARNm được tách ra. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 6  - Quá trình sao chéo ngược gồm hai giai đoạn:  + Đoạn mồi sử dụng ở đây là đoạn olygo-dT, nó kết cặp với poly-A, từ đó xảy ra tổng hợp mạch ADN đơn bổ sung theo sợi ARNm khuôn dưới xúc tác của enzym sao chép ngược.  + Tiếp theo mạch c-ADN đơn được tách ra và tiếp tục tổng hợp thành c-ADN mạch kép nhờ enzym ADN polymerase.  - Các c-ADN được nhân dòng bằng cách gắn chúng vào vector. Tập hợp các c-ADN thu nhận từ tất cả các loại ARNm ở tế bào chuyên hoá của một loài sinh vật gọi là ngân hàng c- ADN hay thư viện c- ADN của loài đó. c. Tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học - Để tổng hợp nhân tạo gen cần phải biết trình tự các nucleotit của nó, từ đó người ta thiết kế hệ thống tổng hợp ADN trong ống nghiệm. Thường áp dụng đối với gen ngắn. 4.5.2. Kỹ thuật ARN – ngược nghĩa - Sử dung ARNm ngược nghĩa trong quá trình điều khiển sự biểu hiện của gen. ARNm ngược nghĩa bắt cặp bổ sung với ARNm bình thường, từ đó quá trình dịch mã bị kìm hãm. - Kỹ thuật tạo dòng ADN ngược nghĩa cho một gen bất kỳ bằng cách quay ngược toàn bộ phần mã hoá của gen. - Tạo giống kháng virus - Tạo giống kháng sâu - Tạo giống kháng thuốc trừ cỏ - Các cải tiến khác ở cây trồng: + Cải tiến chiến lược thực phẩm của cây trồng + Đối với những cây hoa, cây cảnh, người ta xử dụng kỹ thuật di truyền nhằm biến đổi màu sắc hoa theo ý muốn. + Tạo cây trồng chuyển gen để sản xuất những hợp chất quý hiếm + Tạo các dòng bất dục đực, tạo giống chống chịu với một số yếu tố bất lợi của ngoại cảnh. 4.5.3. Một số thành tựu khi sử dụng cây trồng chuyển gen Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/