Sinh học - Chương 3: Simple cloning

Simple cloning Tp. Hồ Chí Minh 24-9-2014 Vector pUC • Ori: vùng tự tái bản • ampR or bla (beta- lactamase) : gen kháng ampiciline • lacZ’: beta- galactosidase gene • MCS: multi cloning site • lacI: lac repressor gene Vai trò của các gene • bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy phân vòng beta-lacta của ampiciline Vai trò của các gene • lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy phân các đường đôi bao gồm X-gal tạo màu xanh Cấu trúc của (c) IPTG: isopropyl --D-thiogalactoside Cắt vector và DNA Nối bằng ligase được hay và cuối cùng là DNA tái tổ hợp (recombinant). Chuyển tất cả cấu trúc vào E.coli • Hóa biến nạp (competence cell + thermal shock) • Điện biến nạp (electroporation) Operon lacZ và IPTG Operon lacZ và IPTG Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp Blue + White Systems + ampiciline + IPTG + XGal Khẳng định dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp – Dùng enzyme cắt và điện di – Colony PCR (dùng primer chuyên biệt) Yêu cầu cần có của Vector 1. Điểm khởi đầu nhân đôi (an origin of replication) 2. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 3. Những trình tự nhận biết duy nhất của các RE (suitable single restriction sites) 4. Kích thước phù hợp (suitable size) 5. Chỉ thị nhận biết đoạn DNA chèn 6. Nhiều bản sao trong tế bào vật chủ 7. Tàn tật , không có khả năng chuyển sang tế bào vi khuẩn khác (loại bỏ những trình tự tham gia trong quá trình tiếp hợp) Vector nhân tạo đầu tiên, pBR322 Polycloning vector • Chứa vùng polylinkers hay multicloning sites • Chứa đoạn DNA ngoại lai từ 3 -10 kb Nhóm pUC Nhóm pUC Nhóm pGEM Nhóm pBluescript Biến nạp (transformation) • Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào: – Số lượng DNA tái tổ hợp – Kiểu DNA tái tổ hợp – Vật chủ • Hóa biến nạp (calcium chloride) • Điện biến nạp (electroporation) Tế bào chủ (host) • Tế bào mang DNA tái tổ hợp, DNA tái tổ hợp được nhân lên. • Chọn vật chủ rất quan trọng như chọn vector. Tính chất của tế bào chủ 1. Hiệu quả biến nạp - Khả năng tiếp nhận DNA, (chưa hiểu rõ). - Hiện diện hệ thống phân hủy DNA nội sinh.  sử dụng các dòng E. coli đột biến làm giảm khả năng phân hủy DNA ngoại sinh. 2. Sự bền vững của plasmid trong tế bào vật chủ - Hệ thống tái tổ hợp của tế bào vật chủ  Sử dụng các dòng đột biến hạn chế sự tái tổ hợp Tính chất của tế bào chủ 3. Dị tật: hạn chế khả năng sống sót khi phát tán ra bên ngoài 4. Chứa cấu trúc lacZ’ hữu dụng cho chọn lọc 5. Các marker khác DH5, tế bào chủ cho pUC vector • Xuất phát từ E. coli dòng K • Kiểu gene: endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA (nalR) relA1D(lacZYA-argF)U169 F80lacZDM15 - endA1: ức chế 1 endonuclease cắt DNA chuyên biệt. -hsdR17 ức chế hệ thống hạn chế của tế bào chủ, DNA được bảo vệ bởi sự methyl hóa 1) Tránh vector tự nối lại bằng A lk al in e p h o sp h at as e 1) Hoặc vector chứa gene gây chết tế bào vật chủ khi tự nối Ex: gene ccdB (control of cell death) 2) Nhân dòng cưỡng bức - Tạo vector có DNA chèn theo chiều mong muốn  thuận lợi cho việc biểu hiện protein  Sử dụng hệ thống vector chứa multicloning site (MCS) hoặc polylinker 3) Nhân dòng sản phẩm PCR - Tạo dòng với sản phẩm PCR đầu bằng hiệu quả thấp  Thêm trình tự nhận biết của RE vào primer và tạo dòng bằng hệ thống polylinker.  Hoặc thêm A vào đầu 3’ sản phẩm PCR và tạo dòng bằng hệ thống TA vector Vector chứa RS của topoisomerase 5) Hệ thống recombinase Linkers – Các đoạn nối Adaptors – Các đoạn chuyển đổi Cassette M13, vòng đời Bộ gene M13 và vector M13 Multicloning sites trong lacZ’ gene Vector có nguồn gốc từ M13 • pBlueScripIIKS2+ phage lamda Bacteriophage lamda Bacteriophage lamda Nếu loại bỏ vẫn không ảnh hưởng đến sinh sản và làm tan tế bào chủ của phage Bacteriophage lamda Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào. Bacteriophage lamda Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào. Vector cải tiến từ phage  Cosmid = plasmid + đầu cos • Dùng tạo dòng các đoạn DNA kích thước lớn • Thành phần – Marker kháng kháng sinh – Trình tự ori – Đoạn DNA mang đầu cos của phage lamda • Kích thước nhỏ, chứa đoạn DNA eukaryote khoảng 45 kb. Tạo dòng bằng cosmid Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors • Yếu tố F (Fertility factor): plasmid, di chuyển sang tế bào mới không hiện diện yếu tố F nhờ tiên mao giới tính (sex pilus). • Có khả năng chèn vào chromosome tế bào chủ • Mang DNA ngoại lai lớn (300 kb) • Chuyển vào E. coli bằng xung điện • Số bản sao thấp 1-2. • Ổn định trong E. coli Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors • parA, parB, parC : kiểm soát số bản sao • oriS và repE: cần thiết cho sự tái bản Yeast Artificial Chromosomes (YAC) vectors • Dựa trên cấu trúc NST của nấm men • Có thể nhận DNA 2000 kb