Sàng lọc và phân tích bản chất hóa học của các hoạt chất kháng nấm từ xạ khuẩn - Trần Thị Đức Phương

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 202-209 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. XXX﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXSÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH BẢN CHẤT HÓA HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM TỪ XẠ KHUẨN Trần Thị Đức Phương1, Nguyễn Thị Vân2, Phạm Thị Thu Hướng2, Nguyễn Kim Nữ Thảo2* 1Viện Đại học Mở Hà Nội 2Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội, *thaonkn@vnu.edu.vn TÓM TẮT: Nhiễm nấm là một vấn đề nghiêm trọng trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, y tế hay công nghiệp bảo quản thực phẩm. Các chất được tổng hợp hóa học có khả năng kháng nấm ở một mức độ nhất định. Tuy nhiên, các chất này có rất nhiều nhược điểm như thiếu tính đặc hiệu và có thể tích tụ lại trong môi trường, một số chất còn gây hại cho cả con người. Chính vì vậy, các chất kháng nấm có nguồn gốc từ vi sinh vật luôn được quan tâm, đặc biệt là nhóm chất kháng nấm dạng polyene được sinh ra từ xạ khuẩn. Đây là nhóm chất kháng nấm đã được biết đến từ lâu nhưng có phổ kháng rất rộng. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này để tìm được các chủng xạ khuẩn phân lập được ở Việt Nam sinh chất kháng nấm dạng polyene. Kết quả sàng lọc 500 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) cho thấy 7 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh. Điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh lượng chất cao nhất của 7 chủng xạ khuẩn này đã được xác định. Kết quả nghiên cứu khẳng định cả 7 chủng đều thuộc chi Streptomyces và đều sinh chất kháng nấm dạng polyene. Trong số đó có 1 chủng, VTCC-A-2787, Streptomyces misionensis có khả năng kháng đặc hiệu và mạnh nấm men và nấm sợi. Chất kháng nấm do chủng VTCC-A-2787 sinh ra cũng đã được xác định là chất Fillipin III. Từ khóa: Streptomyces, fillipin III, kháng nấm, polyene, xạ khuẩn. MỞ ĐẦU Nấm là nguyên nhân gây rất nhiều bệnh nghiêm trọng cho con người, vật nuôi và cây trồng. Đặc biệt trong lâm sàng, bên cạnh các loài nấm gây bệnh cơ hội thường gặp như Candida albicans, Cryptococcus neoformans và Aspergillus fumigatus, càng ngày càng có nhiều báo cáo về các trường hợp nhiễm các loại nấm nguy hiểm khác như Trichosporon spp., Rhodotorula spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium spp. [2, 7, 12]. Những loài nấm này gây nhiều khó khăn trong chẩn đoán cũng như được biết đến là những loài nấm có khả năng kháng những thuốc kháng nấm thông thường. Các nhóm thuốc kháng nấm được sử dụng để điều trị nhiễm nấm hiện nay gồm nhóm polyene, azole và echinocandin. Các chất thuộc nhóm polyene như amphotericin B, albelcet, amphotec thường phá hủy ergosterol trong màng tế bào nấm; các chất thuộc nhóm azole như fluconazole, ketoconazole, itraconazole thường ức chế quá trình sinh tổng hợp ergosterol; trong khi đó, các chất thuộc nhóm echinocandin như caspofungin, micafungin, anidulafungin thường ức chế quá trình sinh tổng hợp b-1,3-glucan trong thành tế bào nấm [3]. Gần đây xuất hiện nhiều báo cáo khuyến cáo về khả năng kháng các thuốc kháng nấm mới (thuộc nhóm azole và echinocandin). Vì vậy, việc đánh giá và khai thác các thuốc kháng nấm cũ với phổ rộng (như nhóm polyene) được cho là có thể đem lại phương pháp kháng nấm hiệu quả hơn [8, 11, 14]. Các chất dạng polyene được phát hiện đầu tiên từ những năm 1950 và là nhóm chất kháng nấm lâu đời nhất [9, 10]. Đây là các chất chứa vòng macrolactone với các liên kết đôi, chính vì vậy các chất này thường có màu với phổ hấp thụ rất đặc trưng. Cũng chính vì có cấu trúc như vậy, các chất dạng polyene thường có khả năng hấp thụ ánh sáng rất tốt, không bền ngoài sáng và rất ít tan trong nước [13]. Đã có rất nhiều chất dạng polyene được phát hiện từ chi Streptomyces, tuy nhiên chỉ amphotericin B và nystatin là được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng. Trong đó, amphotericin B đã được sử dụng trong 40 năm và cho đến nay vẫn chưa có thuốc nào có thể cạnh tranh với amphotericin B trong việc điều trị các bệnh về nấm [13]. Các chất dạng polyene mới vẫn đang đượcphát hiện trong các nghiên cứu gần đây trên thế giới như Separacenes A-D từ một chủng xạ khuẩn biển phân lập ở vùng đảo Jeji năm 2013 [1]; bahamaolides A and B cũng từ một chủng xạ khuẩn biển được phát hiện năm 2012 [6] hay PN00053 là một chất dạng polyene mới được phát hiện ở Ấn Độ năm 2014 với phổ ức chế rất rộng [15]. Việt Nam được biết đến như một nước trong khu vực có đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới. Tuy vậy, chưa có nhiều nghiên cứu ở Việt Nam xác định bản chất hóa học của các chất kháng nấm từ xạ khuẩn. Chính vì vậy, việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh ra từ các chủng xạ khuẩn này là công việc rất cần thiết để tìm kiếm chất kháng nấm có hiệu quả và gây ít tác dụng phụ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng xạ khuẩn kháng nấm từ 500 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại VTCC và xác định bản chất hóa học của các chất kháng nấm được sinh ra từ các chủng có hoạt tính cao nhất. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu gồm 500 chủng xạ khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu thuộc bộ giống xạ khuẩn được phân lập ở Việt Nam và bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật VTCC. Các chủng vi sinh vật kiểm định được sử dụng bao gồm: Saccharomyces cerevisiae (VTCC–Y–62), Candida albicans (OUT 6266), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Fusarium oxysporum (ATCC 7601), Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 29923). Sàng lọc hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp thỏi thạch Các chủng xạ khuẩn được hoạt hóa từ lạnh sâu trên môi trường thạch YS (g/l: tinh bột- 10; cao men- 2; thạch- 16) trong 7 ngày ở 28oC. Các thỏi thạch có đường kính 5 mm chứa xạ khuẩn được đặt trên môi trường đã trải vi sinh vật kiểm định. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC đối với vi khuẩn và 28oC đối với nấm, vòng ức chế được xác định bằng thước đo. Sàng lọc hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trongmôi trường dịch thể SKS (g/l: tinh bột- 10; glucose-10; đậu tương- 10; peptone- 5; CaCO3- 3) lắc 220 vòng/phút trong 7 ngày. Tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. 100 ml dịch nuôi cấy được nhỏ vào trong các giếng đã được đục sẵn trên đĩa thạch đã cấy các chủng vi sinh vật kiểm định. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC đối với vi khuẩn và 28oC đối với nấm, vòng ức chế được xác định bằng thước đo. Phân loại dựa trên hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử Hình thái và màu sắc khuẩn lạc của từng chủng xạ khuẩn được quan sát sau 5-6 ngày nuôi cấy trên môi trường YS ở 28ºC. Hình thái chuỗi bào tử được quan sát dưới kính hiển vi trên các lamen được cắm trên các đĩa nuôi cấy. Phân loại dựa vào trình tự 16S rADN Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường YG lỏng (g/l: cao men-10; glucose-10), lắc trong 2 ngày, ADN được tách theo phương pháp được mô tả bởi Kieser et al. [5]. Đoạn gen 16S rADN được nhân lên bằng phương pháp PCR sử dụng hai cặp mồi là 9F (GAGTTTGATCCTGGCTCAG) và 1541R (AAGGAGGTGATCCAGCC). Sản phẩm PCR được giải trình tự gen và so sánh với ngân hàng gen NCBI. Tối ưu điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn để đạt được hoạt tính kháng nấm cao nhất Điều kiện nuôi cấy được tối ưu đối với mỗi chủng xạ khuẩn bằng cách so sánh vòng hoạt tính kháng nấm men S. cerevisiae của dịch nuôi cấy trong các môi trường khác nhau từ 1 đến 8 ngày lắc ở nhiệt độ 28ºC, tốc độ lắc 220 vòng/phút. Các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: SKS (g/l: tinh bột- 10; glucose- 10; đậu tương- 10; peptone- 5; CaCO3- 3); 301 (g/l: tinh bột-24; glucose-1; peptone-3; cao thịt-3; cao men-5; CaCO3-4); No8 (g/l: casiton- 7.5; cao men- 7.5; glycerol- 15; NaCl-2.5); A16 (g/l: glucose-20; pharmamedia-10; CaCO3-5); 3M (g/l: glucose- 5; glycerol-20; tinh bột- 20; pharmamedia- 15; cao men- 3; diaion Hp20- 2); 2M (g/l: tinh bột-20; đậu tương-15; cao men-2; CaCO3-4); MT2 (g/l: tinh bột-25; glucose-20; bột đậu tương-10; cao men-10; NaCl-2; CaCO3-5; MgSO4-1). Tách chiết thô bằng butanol Các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm mạnh được nuôi cấy trên môi trường tối ưu lắc 220 vòng/phút trong 5-6 ngày ở nhiệt độ 28oC. Tế bào được loại bỏ bằng cách li tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nuôi cấy được tách chiết bằng 2 lần thể tích dung môi n-butanol. Lớp dung dịch phía trên được thu lại và cô quay đến khô. Phân tích hoạt tính kháng nấm của dịch chiết thô bằng cách kết hợp kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Dịch chiết thô của các chủng xạ khuẩn được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sử dụng cột phân tích C18 Cadenza CD-C18 (75x 4,6 mm; 3 µm). Dung môi chạy mẫu được chuẩn bị với hai kênh: (kênh A- nước MQ: axit formic = 1000: 1), (kênh B- acetonitrile). Các mẫu được phân tích qua cột C18 cùng với việc tăng dần nồng độ acetonitrile từ 15-85% trong 22 phút với tốc độ 1,2 ml/phút. Các phân đoạn sau cột được thu và thử hoạt tính để xác định phân đoạn chứa chất kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Tinh sạch hoạt chất kháng nấm bằng HPLC Các chất kháng nấm được tinh sạch bằng cột thu mẫu C18 (250 x 10 mm; 5 µm). Các chất được thôi khỏi cột bằng cách tăng nồng độ acetonitrile từ 15-85% trong 29 phút với tốc độ 2 ml/phút. Quá trình tinh sạch mẫu được tiến hành hai lần trên máy HPLC. Xác định trọng lượng phân tử chất kháng nấm bằng phương pháp khối phổ Chất kháng nấm đã được tinh sạch trên máy HPLC được phân tích trọng lượng phân tử bằng phương pháp khối phổ. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm bằng phương pháp thỏi thạch Trong nghiên cứu này, 500 chủng xạ khuẩn đã được sàng lọc hoạt tính kháng nấm men S. cerevisiae bằng phương pháp thỏi thạch. Kết quả cho thấy 7 chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao nhất, được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Kí hiệu, phương pháp phân lập và đường kính vòng kháng của 7 chủng xạ khuẩn này được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Kết quả sàng lọc bằng phương pháp thỏi thạch. OS (Oil separation- phân lập xạ khuẩn ưa lipit), RC (Rehydration-Centrifugation- phân lập xạ khuẩn có bào tử di động), DH (Dry heat- phân lập xạ khuẩn chịu nhiệt), SDS-YE (SDS-Yeast extract- phân lập xạ khuẩn chung), Pha loãng (phân lập xạ khuẩn chung) STT Kí hiệu VTCC Kí hiệu khác Nguồn gốc phân lập Phương pháp phân lập Đường kính vòng kháng S. cerevisiae (mm) 1 VTCC-A-236 Đất Pha loãng 21 2 VTCC-A-1854 VN08-A-435 Đất SDS-YE 20 3 VTCC-A-2787 VN08-A-24 Lá DH 16 4 VTCC-A-2947 VN08-A-224 Lá RC 15 5 VTCC-A-2893 VN08-A-146 Đất OS 12 6 VTCC-A-3350 VN12-B-562 Đất Pha loãng 20 7 VTCC-A-3779 VN12-B-551 Đất SDS-YE 13 Đánh giá hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Dịch nuôi cấy của 7 chủng xạ khuẩn được thử hoạt tính kháng 6 loại vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả cho thấy 7 chủng đều có khảnăng kháng cả 2 loại nấm men được sử dụng, S. cerevisiae và C. albicans (bảng 2). Trong khi đó, chỉ có 3 chủng (VTCC-A-236, VTCC-A-1854 và VTCC-A-2787) có khả năng kháng nấm sợi F. oxysporum, đây cũng là 3 chủng có khả năng kháng nấm men mạnh nhất trong số 7 chủng được lựa chọn. Chủng VTCC-A-1854 vừa có khả năng kháng nấm, vừa có khả năng kháng vi khuẩn G (+) S. aureus. Chủng VTCC-A-236 vừa có khả năng kháng nấm, vừa có khả năng kháng vi khuẩn G (-) E. coli. Đặc biệt VTCC-A-2787 là chủng duy nhất kháng nấm men và nấm sợi đặc trưng. Bảng 2. Hoạt tính kháng các vi sinh vật kiểm định của 7 chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Đường kính vòng kháng các VSV kiểm định (mm) S. cerevisiae C. albicans F. oxysporum E. coli S. aureus P. aeruginosa VTCC-A-236 21 20 15 12 - - VTCC-A-1854 22 23 13 - 10 - VTCC-A-2787 18 22 20 - - - VTCC-A-2893 12 11 - - - - VTCC-A-2947 15 12 - - - - VTCC-A-3350 14 12 - - - - VTCC-A-3779 17 10 - - - - Bảng 3. Bảng phân loại dựa trên hình thái và trình tự 16S rADN STT Tên chủng Màu sắc khuẩn ty cơ chất Màu sắc khuẩn ty khí sinh Sinh sắc tố Hình thái chuỗi bào tử Tên loài (dựa trên trình tự 16S rADN) 1 VTCC-A-236 Nâu Trắng xám - Thẳng/ Lượn sóng Streptomyces exfoliates 2 VTCC-A-1854 Trắng đục Xám - Xoắn S. lydicus 3 VTCC-A-2787 Xám Xám nâu - Xoắn S. misionensis 4 VTCC-A-2893 Đen Xám ghi + Thẳng S. atratus 5 VTCC-A-2947 Trắng xám Trắng xám - Thẳng/ Lượn sóng Streptomyces sp. 6 VTCC-A-3350 Trắng đục Trắng - Xoắn Streptomyces sp. 7 VTCC-A-3779 Vàng nhạt Xám đen - Xoắn Streptomyces sp. Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng xạ khuẩn được lựa chọn có hoạt tính kháng nấm cao nhất Phân loại Bảy chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được phân loại dựa trên hình thái và trình tự 16S rARN. Dựa vào màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, khả năng sinh sắc tố, hình thái chuỗi bào tử (hình 1) và trình tự 16S rADN, cả 7 chủng đều được phân loại thuộc chi Streptomyces. Kết quả phân loại chi tiết được liệt kê trong bảng 3. Tối ưu điều kiện nuôi cấy Môi trường và thời gian nuôi cấy được tốiưu đối với mỗi chủng xạ khuẩn nhằm thu được lượng chất kháng nấm cao nhất. Kết quả tối ưu được thể hiện ở hình 2. Mỗi chủng đều thích hợp cho môi trường và thời gian nuôi khác nhau: VTCC-A-1854 (6 ngày), VTCC-A-2893 (5 ngày), VTCC-A-3350 (7 ngày) cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên môi trường SKS; VTCC-A-2787 (6 ngày) và VTCC-A-3779 (7 ngày) thích hợp trên môi trường 2M; còn VTCC-A-236 (6 ngày) và VTCC-A-2947 (5 ngày) lại thích hợp với môi trường MT2 và A16. Hình 2. Kết quả tối ưu hóa điều kiện môi trường và thời gian nuôi cấy của 7 chủng xạ khuẩn Tách chiết và phân tích chất có hoạt tính Bước tiếp theo của nghiên cứu là xác định bản chất hóa học của các chất kháng nấm do 7 chủng xạ khuẩn được lựa chọn sinh ra. Dịch nuôi cấy 7 chủng xạ khuẩn này được tách chiết thô bằng n-butanol và phân tích bằng HPLC như đã mô tả trong phần phương pháp. Các chất kháng nấm được xác định bằng phương pháp thu phân đoạn kết hợp thử hoạt tính trên đĩa thạch. Kết quả phân tích cho thấy, cả 7 chất kháng nấm sinh ra từ 7 chủng xạ khuẩn đều là các chất dạng polyene với phổ hấp thụ gồm 3-4 đỉnh đặc trưng (hình 3). Tuy nhiên, phổ hấp thụ cùng thời gian lưu cho thấy đây là 7 chất dạng polyene hoàn toàn khác nhau. Kết quả này cũng cho thấy phương pháp sàng lọc dựa trên hoạt tính kháng S. cerevisiae mang lại hiệu quả rất cao trong việc tìm kiếm chất kháng nấm dạng polyene. Tinh sạch chất do chủng VTCC-A-2787 sinh ra Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 7 chủng nghiên cứu, chỉ duy nhất chủng VTCC- A- 2787 có khả năng kháng đặc hiệu nấm men và nấm sợi. Chính vì vậy, chất kháng nấm do chủng VTCC-A-2787 sinh ra được lựa chọn để tiếp tục tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học. Chất kháng nấm được tinh sạch qua cột C18 bằng HPLC như đã mô tả trong phần phương pháp. Kết quả thu phân đoạn và thử hoạt tính cho thấy, chất kháng nấm được thôi khỏi cột ở phút 27 trên cột thu mẫu C18 (hình 4). Chất này được thu lại và tinh sạch lần thứ hai qua cột phân tích C18 (hình 5). VTCC- A- 236 VTCC- A- 1854 VTCC- A- 2787 Thời gian lưu: 32 phút Thời gian lưu: 15,5 phút Thời gian lưu: 26,5 phút λmax = 320, 340, 360 λmax = 190, 310, 330 λmax = 310, 320, 340, 350 VTCC- A- 2893 VTCC- A- 2947 VTCC- A- 3350 Thời gian lưu: 14 phút Thời gian lưu: 13,5 phút Thời gian lưu: 14,5 phút λmax = 320, 340, 360, 380 λmax = 290, 310, 320 λmax = 320, 330, 350 Hình 3. Phổ hấp thụ, thời gian lưu và bước sóng hấp thụ cực đại của các hoạt chất kháng nấm của 7 chủng xạ khuẩn VTCC- A- 3779 Thời gian lưu: 18 phút λmax = 370, 390, 410 Hình 4. Phổ phân tích HPLC dịch chiết thô của chủng VTCC- A- 2787 trên cột thu mẫu C18. Mũi tên chỉ đỉnh chất có hoạt tính. Hình 5. Kết quả tinh sạch chất kháng nấm đã tinh sạch của chủng VTCC-A-2787 a. Phổ phân tích HPLC; b. Phổ hấp thụ từ bước sóng 200 nm đến 600 nm. Hình 6. Công thức cấu tạo của Filipin III Kết quả phân tích khối phổ Chất kháng nấm đã được tinh sạch từ chủng VTCC-A-2787 được phân tích khối lượng phân tử bằng phương pháp khối phổ. Kết quả phân tích cho thấy chất kháng nấm này có khối lượng phân tử là 654,4. So sánh khối lượng phân tử cũng như phổ hấp thụ đặc trưng của chất kháng nấm này với từ điển các hoạt chất tự nhiên (The dictionary of natural products- The Chapman & Hall/CRC chemical database) và ngân hàng dữ liệu các chất có hoạt tính sinh học ở Đại học Osaka, chúng tôi kết luận rằng, chất kháng nấm do chủng VTCC-A-2787 sinh ra là Filipin III. Filipin III đã được phát hiện lần đầu tiên từ chủng Streptomyces filipinensis, đây là một chất kháng nấm có màu vàng, với công thức hóa học là C35H58O11 và trọng lượng phân tử là 654,39 (hình 6) [16]. Nhờ vào khả năng phát huỳnh quang và khả năng bám rất chặt với cholesterol, Filipin III đang được sử dụng như chất nhuộm để phát hiện và định lượng choresterol trong màng tế bào [4]. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào công bố về khả năng sinh Filipin III của loài Streptomyces misionensis, vì vậy đây có thể là nghiên cứu đầu tiên. Tuy nhiên để khẳng định chất kháng nấm này chắc chắn có công thức hóa học hoàn toàn trùng lặp với Filipin III, các phân tích hóa học khác như phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR cần được thực hiện. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, 500 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại VTCC đã được sàng lọc hoạt tính kháng nấm men, 7 chủng đã được tìm thấy có hoạt tính kháng nấm men mạnh. Kết quả nghiên cứu khẳng định cả 7 chủng đều thuộc chi Streptomyces và đều sinh chất kháng nấm dạng polyene. Trong số đó có một chủng VTCC-A-2787, Streptomyces misionensis, có khả năng kháng đặc hiệu và mạnh nấm men và nấm sợi. Chất kháng nấm do chủng này sinh ra được xác định là Filipin III. Đây là nghiên cứu đầu tiên công bố khả năng sinh Fillipin III của loài Streptomyces misionensis. Nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải biến để tăng khả năng sinh Filipin III của chủng VTCC-A-2787, xác định qui trình tách chiết và tinh sạch Filipin III trên quy mô lớn hơn để phát triển kit phát hiện và định lượng cholesterol trong màng tế bào. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Nhiệm vụ Bảo tồn và Lưu giữ nguồn gen vi sinh vật và Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia Nafosted (MS: 106-YS.04-2013.07). TÀI LIỆU THAM KHẢO Bae M., Kim H., Shin Y., Kim B. Y., Lee S. K., Oh K. B., Shin J., Oh D. C., 2013. Separacenes A-D, novel polyene polyols from the marine actinomycete, Streptomyces sp. J Antibiot 66: 431-441. Chandrasekar P., 2009. Invasive mold infections: recent advances in management approaches. Leuk Lymphoma 50: 703-715. Chandrasekar P., 2011. Management of invasive fungal infections: a role for polyenes. J. Antimicrob Chemother 66: 457-465. Gimpl G., Gehrig-Burger K., 2007. Cholesterol reporter molecules. Biosci. Rep 27: 335-358. Kieser T., Chater K. F., Bibb M. J., Buttner M. J., Hopwood D. A., 2000. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation, England. Kim D. G., Moon K., Kim S. H., Park S. H., Park S., Lee S. K., Oh K. B., Shin J., Oh D. C., 2008. Bahamaolides A and B, antifungal polyene polyolmacrolides from the marine actinomycete Streptomyces sp. Curr Top Med Chem 8: 639-653. Lai C. C., Tan C. K., Huang Y. T., 2008. Current challenges in the management of invasive fungal infections. J Infect Chemother 14: 77-85. Masia Canuto M., Gutierrez Rodero F., 2002. Antifungal resistance to azoles and polyenes. Lancet Infect Dis., 2: 550-563. Mathew B. P., Nath M., 2009. Recent approaches to antifungal therapy for invasive mycoses. Chem. Med. Chem., 4: 310- 323. Mohr J., Johnson M., Cooper T., 2008. Current options in antifungal pharmacotherapy. Pharmacotherapy, 28: 614-645. Perlin D. S., 2007. Resistance to echinocandin-class antifungal drugs. Drug Resist Updat, 10: 121-130. Pfaller M. A., Pappas P. G., Wingard J. R., 2006. Invasive fungal pathogens: current epidemiological trends. Clin Infect Dis 43: S3-14. Seco E. M., Cuesta T., Fotso S., Laatsch H., Malpartida F., 2005. Two Polyene Amides Produced by Genetically Modified Streptomyces diastaticusvar. Chemistry & Biology, 12: 535-543. Snelders E., van der Lee H. A., Kuijpers J., 2008. Emergence of azole resistance in Aspergillus fumigatus and spread of a single resistance mechanism. PLoS Med., 5: 1629-1637. Vartak A., Mutalik V., Parab R. R., Shanbhag P., Bhave S., Mishra P. D., Mahajan G. B., 2014. Isolation of a new broad spectrum antifungal polyene from Streptomyces sp. MTCC 5680. Lett Appl Microbiol., 58: 591-596. Whitfield G. B., Brock T. D., Ammann A., Gottlieb D., Carter H. E., 1995. Filipin, an antifungal antibiotic: isolation and properties. J Am Chem Soc., 77: 4799-4801. SCREENING AND CHEMICAL ANALYSIS OF ANTIFUNGAL COMPOUNDS FROM ACTINOMYCETES Tran Thi Duc Phuong1, Nguyen Thi Van2, Pham Thi Thu Huong2, Nguyen Kim Nu Thao2,* 1Hanoi Open University 2Institute of Microbiology and Biotechnology, VNU Hanoi SUMMARY Fungal infections are a serious problem in agriculture, health and food preservation industry. The chemically synthesized compounds are able to inhibit fungi in a certain degree. However, these compounds have a lot of disadvantages such as lack of specificity and can accumulate in the environment, some compounds are even harmful to humans. Thus, antifungal compounds derived from microorganisms are always of interest, especially antifungal polyenes from actinomycetes. This is a group of antifungal substances have been known for a long time but have a very wide spectrum. Therefore, we conducted this study to find actinomycete strains isolated in Vietnam that are able to produce antifungal polyenes. Screening results from 500 actinomycete strains preserved at VTCC showed that 7 strains had strong activity against Saccharomyces cerevisiae. Optimal culture conditions for the 7 strains to produce the highest amount of active compounds were also determined. The study results illustrated that all 7 strains belonged to the genus Streptomyces and produced antifungal polyenes. Among the 7 strains, strain VTCC-A-2787 Streptomyces misionensis had specific and high activity against yeasts and filamentous fungi. The active compound produced by this strain has been purified and determined as Filipin III. This is the first study which revealed the ability of producing Filipin III by S. misionensis. Keywords: Streptomyces, actinomycetes, anti-fungal, fillipin III, polyene. Ngày nhận bài: 22-10-2014