Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase từ đất và xác định một số tính chất của dịch enzyme thô

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 112 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC SÀNG LỌC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH GELATINASE TỪ ĐẤT VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA DỊCH ENZYME THÔ SCREENING OF A GELATINASE PRODUCING BACTERIUM FROM SOIL AND CHARACTERIZATION OF THE CRUDE ENZYME EXTRACT Trần Quốc Đảm1, Nguyễn Thị Thanh Hải2, Nguyễn Anh Tuấn3, Nguyễn Minh Trí4 Ngày nhận bài: 21/8/2012; Ngày phản biện thông qua: 25/01/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Gelatinase có khả năng thủy phân gelatine thành các peptid và acid amin hay còn gọi là gelatin thủy phân đượ c ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm thu nhận gelatinase từ cá c vi khuẩn trong đất và khả o sá t mộ t số đặc tính củ a enzyme nà y. Chúng tôi đã tiến hành phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase trên môi trường đặc trưng gelatine-agar (gelatine 1,5%; agar 1,5%, pepton 0,4%, cao nấm men 0,1% và pH 7,2). Kết quả tuyển chọn được chủng Bacillus sp. C7 có khả năng tổng hợp gelatinase cao. Enzyme gelatinase thu đượ c hoạ t độ ng tố i ưu ở nhiệt độ 50 oC, pH 7,5. Cá c ion Mn2+ và Fe2+ là m tăng hoạ t tí nh củ a enzyme và ion Ca2+ là m giả m hoạ t tí nh gelatinase. Nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho cá c nghiên cứ u tiế p theo về thu nhận gelatinase tinh khiết từ chủng Bacillus sp. C7 và ứng dụng enzyme này vào đờ i số ng sả n xuấ t. Từ khóa: Gelatin, Gelatinase, Bacillus ABSTRACT Gelatinase can hydrolyze gelatine into peptides and amino acids which is called hydrolyzed gelatin and this is used in industries. The present research aims to obtain gelatinase from bacteria in soil and defi ne some properties of the gelatinase. Gelatinase producing bacteria were isolated and screened on the selected gelatine-agar medium (1.5% gelatin, 1.5% agar, 0.4% peptone, 0.1% yeast extract and pH 7.2). The result of the screening has indicated a strain Bacillus sp. C7 of with high gelatinase production activity. The optimal pH and temperature of the gelatinase from the strain Bacillus sp. C7 were found to be at 7,5 and 50°C, respectively. Ion Mn2+ and Fe2+ were shown to increase the gelatinase activity whereas this activity was reduced by ion Ca2+. The study is the basis for further researches on obtaining purifi ed gelatinase from strain Bacillus sp. C7 and application of this enzyme. Keywords: Gelatine, Gelatinase, Bacillus 1 Trần Quốc Đảm: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 - Trường Đại học Nha Trang 2 ThS. Nguyễn Thị Thanh Hải, 3TS. Nguyễn Anh Tuấn, TS. 4Nguyễn Minh Trí: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật [7]. Gelatin được thủy phân tạo thành các peptid và acid amin gọi là dịch thủy phân gelatin. Khả năng hòa tan, khả năng tạ o nhũ, tạo bọt hay hoạt tính chống oxy hóa là những tính chất quan trọng của dịch thủy phân gelatin đượ c ứ ng dụ ng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm [11, 12]. Dịch thủy phân gelatin có chứa một lượng lớn các acid amin như glycine, proline, hydroxyproline, lysine, hydroxylysine và chúng dễ dàng được hấp thụ vào cơ thể. Đây là các thành phần chức năng quan trọng, nó được ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm để sản xuất các sản phẩm hỗ trợ cấu trúc collagen trong da và sụn [11]. Quá trình thủy phân gelatin có thể đượ c thự c hiệ n bằng phương pháp hóa học hoặc bằng Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 113 phương pháp enzyme. Chú ng ta đã biế t, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều so với các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác, đồ ng thờ i nó có thể thự c hiệ n hoạ t độ ng xú c tá c ở điề u kiệ n á p suấ t và nhiệ t độ thườ ng [1, 2]. Từ nhữ ng đặ c điể m trên cho thấ y phương phá p enzyme gó p phầ n nâng cao chấ t lượ ng sả n phẩ m và giả m thiể u tá c độ ng gây ô nhiễ m môi trườ ng từ quá trình sản xuất so vớ i phương phá p hó a học. Việ c nghiên cứ u và ứ ng dụ ng enzyme có ý nghĩ a to lớ n về mặ t lý thuyế t cũ ng như về thự c tế á p dụ ng [1]. Gelatinase là mộ t enzyme thủy phân protein, có thể thủ y phân gelatin thà nh cá c peptid và cá c acid amin. Chú ng ta có thể thu nhậ n gelatinase từ nhiề u nguồ n khá c nhau, trong đó thu nhậ n gelatinase từ vi sinh vậ t đượ c chú ý nhiều hơn cả. Trong tự nhiên có nhiề u chủng vi khuẩ n có khả năng sinh tổ ng hợ p gelatinase như: Bacillus, Flavobacterium, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Serratia, Shigella, Vibrio [5, 6, 10]. Việ c tuyể n chọ n chủ ng an toà n, thường được quan tâm nhằm ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm [8, 9]. Hoạt động của enzyme phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường mà nó xú c tá c phả n ứ ng [3]. Việ c xá c đị nh điề u kiệ n hoạ t độ ng xú c tá c thí ch hợ p củ a gelatinase giúp cho việc ứ ng dụ ng thủ y phân gelatin bằ ng gelatinase mộ t cá ch hiệ u quả . Mục tiêu của nghiên cứu này là sàng lọc được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gelatinase có hoạt tính cao và khả o sá t mộ t số điều kiện hoạt động củ a enzyme nà y. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Môi trường phân lập và nuôi sinh enzyme Môi trườ ng phân lập (MT1): sử dụng môi trường thạch gelatin-agar của Smith và Goodner có thành phần như sau: gelatin 1,5%, agar 1,5%, pepton 0,4%, cao nấm men 0,1%. Môi trường được điều chỉnh về pH 7-7,2 và vô trùng ở 121oC trong 15 phút trước khi sử dụng [6]. Môi trườ ng nuôi sinh enzyme gelatinase (MT2): sử dụ ng môi trườ ng phân lậ p không bổ sung thà nh phần agar. 2. Mẫu đất phân lậ p vi khuẩn Mẫu đất được lấy tại Tháp Bà, Vĩnh Phước, Nha Trang, Khánh Hòa. Quá trình chuẩn bị mẫu như sau. Da cá tra được ủ trong đất cho đến khi bị mũn ra. Khi da cá bị phân hủy, chuẩn bị 100 ml dung dịch gelatin 1%, đổ xuống phần đất đã ủ da cá, định kỳ 3 ngày một lần, tiến hành liên tục trong khoảng 2 tuần. Sau đó, lấy 1 g mẫu đất ở độ sâu từ 3 - 6 cm cho vào 10 ml nước vô trùng, trộn đều và để ổn định trước khi phân lập. 3. Phân lập chủng vi khuẩn sinh gelatinase Mẫ u đượ c phâ n lậ p trên môi trường MT1 bằ ng kỹ thuậ t cấy ria, ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Các vi khuẩn có khả năng phân cắt gelatin sẽ tạo vòng trong xung quanh khuẩn lạc. Chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau đem nuôi cấy và giữ chủng [4, 6]. 4. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao nhất Tiến hà nh nuôi cấy cá c chủng trên cù ng một đĩa thạch chứa môi trường MT1, ủ ở 37oC. Cá c chủng vi khuẩn phá t triển tạo vò ng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Tiến hà nh đo đường kính khuẩn lạc và đườ ng kí nh vò ng phân giải tạo ra xung quanh chủng vi khuẩn đó . Chủng có tỷ lệ đường kính vò ng phân giải/đường kính khuẩn lạc lớn nhất là chủng có khả năng sinh gelatinase cao nhất trong nhó m chủ ng phân lậ p đượ c [4]. 5. Thu dịch gelatinase thô Chủng tuyển chọn được nuôi cấy trong môi trường nuôi sinh gelatinase MT2 ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 180 vòng/phút trong 48 giờ. Canh trường nuôi cấy được ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4oC để loại bỏ sinh khối vi khuẩn. Phần dịch còn lại chứa gelatinase và một số chất hòa tan khác gọi là dịch gelatinase thô. 6. Xác định hoạt độ của gelatinase Hoạt độ enzyme gelatinase được xác định dựa vào lượng mg nitơ amin hình thành trong quá trình thủy phân gelatin. Một đơn vị hoạt độ gelatinase là lượng enzyme thủy phân gelatin tạo thành 1 mg nitơ amin trong 1 giờ ở 40oC và pH thích hợp [1]. Tiến hành thủy phân gelatin 1%, tỷ lệ E/S là 1/2, pH 7, ở nhiệt độ 40oC trong 1 giờ để xác định hoạt độ dịch gelatinase thô. 7. Định lượng nitơ amin Hàm lượng nitơ amin được xác định dựa vào hàm lượng nitơ amin-amoniac (Xf) và hàm lượng nitơ amoniac (X NH3). Đạm nitơ amin (Xaa) được tính như sau: Xaa= Xf – XNH3 - Hàm lượng nitơ amin-amoniac được xác định bằng phương pháp formol (TCVN 3707 - 90). - Hàm lượng nitơ amoniac được xác định bằng phương pháp chưng cất (TCVN 2626-98). Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 114 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Để xác định một số tính chất của dịch gelatinase thô, phản ứng thủy phân dịch gelatin bằng enzyme này được thực hiện lần lược ở các điều kiện nhiệt độ, pH và ion kim loại khác nhau. Tiến hành thí nghiệm từng yếu tố đơn với các giá trị đã chọn và các yếu tố còn lại giữ nguyên không đổi theo bố trí trong hình 1. 9. Định danh vi khuẩn Chủng vi khuẩn được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA và so sánh với ngân hàng gen trên NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST ( Mẫu vi khuẩn C7 được gửi định danh tại Công ty TNHH Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh ( nk-biotek.com.vn/). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lậ p và tuyể n chọ n chủ ng vi khuẩ n sinh gelatinase cao 1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ đất sinh tổng hợp gelatinase Sau 48 giờ cấy mẫu phân lập trên môi trường MT1 thì thấy có nhiều khuẩn lạc phát triển tách biệt nhau. Kế t quả phân lậ p đượ c 12 chủ ng vi khuẩ n có khả năng sinh gelatinase. 1.2. Kiểm tra khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập được Việc kiểm tra khả năng sinh gelatinase của các chủng vi khuẩn phân lập được là cơ sở cho việc tuyển chọn chủng thích hợp để thu nhận gelatinase. Kế t quả nuôi cấy các chủng phân lập được trên môi trường MT1 cho thấy các chủng đề u phát triển và tạo vòng phân giải xung quanh sinh khối củ a chú ng. Điều này cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được điều có khả năng sinh gelatinase. Kế t quả bước đầu cò n cho thấ y các chủng vi khuẩn C1, C2, C3, C4, C5 và C7 là nhóm chủng có khả năng sinh gelatinase cao trong 12 chủng phân lập được (hình 2). 1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh gelatinase cao nhất Để thu nhận gelatinase có hoạt tính cao từ các chủng vi khuẩn phân lập được thì việc tuyển chọn chủng phù hợp là yếu tố quyết định. Chủng phù hợp là chủng có khả năng sinh gelatinase cao và thuộc nhóm GRAS. Sau 72 giờ nuôi cấy các chủng C1, C2, C3, C4, C5 và C7 trên môi trường MT1 thì thấy các chủng vi khuẩn đều phát triển và tạo vòng phân giải lớn. Kết quả đo đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc của chủng vi khuẩn tương ứng được trình bày trong bảng 1. Chủng vi khuẩn C7 là chủng có khả năng sinh gelatinase cao nhất trong nhóm chủng tuyển chọn. Bảng 1. Đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường MT1 sau 72 giờ nuôi cấy Chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải (D) mm Đường kính khuẩn lạc (d) mm Tỷ lệ D/d C1 22,5 12,5 1,80 C2 21,5 8 2,69 C3 11 5,5 2,00 C4 10,5 4,25 2,47 C5 12,5 5 2,50 C7 20 5,5 3,64 8. Bố trí thí nghiệm xác định một số tính chất của dịch gelatinase thô Hình 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ gelatinase từ chủng nghiên cứu Dịch gelatinase thô Xác định hoạt độ Điều kiện thích hợp - Nhiệt độ: 30÷70oC - pH: 5÷9 - Ion kim loại: EDTA, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+ và Ca2+ Thủy phân gelatin ở các điều kiện khác nhau Hình 2. Vòng phân giải gelatine của các chủng vi khuẩn phân lập Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 115 Từ kết quả tra cứu trình tự gen 16S rDNA trên BLAST SEARCH cho thấy, chủng C7 tương đồng 100% với B. subtilis và đồng thời cũng tương đồng 100% với B. licheniformis và 99,8% với B. mojavensis (bảng 2). Điều này cho phép kết luận chủng C7 thuộc chi Bacillus. 3. Mộ t số tí nh chất củ a enzyme thu đượ c Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH của môi trường, các ion kim loại và các chất khác... Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định pH, nhiệt độ thích hợp của enzyme thu được khi thủy phân gelatin và ả nh hưở ng củ a mộ t số ion kim loạ i đế n hoạ t tí nh củ a enzyme. 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase Nhiệ t độ phả n ứ ng ả nh hưở ng mạ nh mẽ đế n hoạ t tí nh xú c tá c củ a enzyme, mỗ i enzyme có mộ t nhiệ t độ phả n ứ ng thí ch hợ p. Trong giớ i hạ n nhiệ t độ chưa là m biế n tí nh enzyme, hoạ t tí nh enzyme tăng khi nhiệ t độ tăng. Tuy nhiên, khi nhiệ t độ tăng đến một giới hạn nào đó thì hoạ t tí nh củ a enzyme lạ i giả m [1]. Để khả o sá t nhiệ t độ tố i ưu củ a gelatinase từ chủ ng Bacillus sp. C7, phả n ứ ng đượ c thự c hiệ n ở cá c nhiệ t độ khá c nhau từ 30÷70oC. 2. Định danh chủng vi khuẩn C7 Kết quả giải trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA dài 472 bp trên máy CEQ 8000 được trình bày trong hình 3. Các trình tự gen này được so chuỗi bằng chương trình BLAST SEARCH trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI được trình bày trong bảng 2. GTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATC CGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCG GAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGT GTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGT TACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGC CACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCG GTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTC CGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAG GCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAA Hình 3. Trình tự gen 16S rDNA của chủng vi khuẩn C7 Bảng 2. Kết quả tra cứu trình tự gen 16S rDNA của chủng C7 trên BLAST SEARCH Accession Description Maxscore Total score Query coverage Expect value Max ident CP002906.1 Bacillus subtilis subsp. subtilis RO-NN-1, complete genome. 872 872 100% 0.0 100% JN399219.1 Bacillus subtilis strain DX-3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. 872 872 100% 0.0 100% JF749278.1 Bacillus subtilis strain ATCC 6051 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. 872 872 100% 0.0 100% KC250123.1 Bacillus subtilis strain BAB-115 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 872 872 100% 0.0 100% CP003695.1 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BSP1,complete genome. 872 872 100% 0.0 100% DQ345289 Bacillus licheniformis 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. 872 872 100% 0.0 100% NR024693 Bacillus mojavensis strain IFO15718 16S ribosomal RNA, partial sequence. 859 859 99% 0.0 99.8% Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ phả n ứ ng đến hoạt tính của gelatinase từ chủ ng vi khuẩn C7 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 116 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Kết quả khả o sát cho thấ y nhiệ t độ phả n ứ ng thí ch hợ p củ a gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7 là 500C, đây là enzyme ưa nhiệ t và có khoảng nhiệt độ hoạt động tương đối rộng từ 30 ÷ 600C (hì nh 3). Như vậy, gelatinase có thể ứng dụng vào các quá trình có gia nhiệt nhưng không quá cao. Ở nhiệt độ là 500C, khi ứng dụng geltainase vào quá trình sản xuất có thể hạn chế được sự phát triển của một số vi khuẩn có thể làm giảm chất lượng sản phẩm. 3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase Hình 4. Ảnh hưởng của pH phả n ứ ng đến hoạt tính gelatinase từ chủ ng vi khuẩn C7 Giá trị pH môi trường có ả nh hưở ng lớ n đế n tố c độ phả n ứ ng củ a enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động tốt tại một trị số pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme [1, 12]. Tù y thuộ c và o bả n chấ t enzyme mà pH enzyme hoạ t độ ng thí ch hợ p để enzyme hoạ t độ ng có thể trung tí nh, kiề m hoặ c acid [1]. Để tì m ra khoả ng pH tố i ưu cho hoạ t độ ng củ a gelatinase từ chủ ng Bacillus sp. C7 phả n ứ ng giữ a enzyme cơ chấ t đượ c thự c hiệ n ở nhiệ t độ 500C và giá trị pH thay đổ i trong khoả ng từ 5÷9. Kế t quả nghiên cứ u cho thấ y gelatinase từ chủ ng Bacillus sp. C7 hoạ t độ ng tố t nhấ t trong khoả ng pH 7,0÷7,5, thuộ c loạ i enzyme ưa pH trung tí nh. 3.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính gelatinase Hình 5. Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính gelatinase từ chủ ng vi khuẩn C7 Cá c ion kim loạ i có thể kì m hã m hoặ c hoạ t hó a sự hoạ t độ ng củ a cá c enzyme [1, 12]. Để khả o sá t ả nh hưở ng củ a ion kim loạ i đế n hoạ t tí nh củ a gelatinase từ chủ ng Bacillus sp. C7, dị ch enzyme đượ c xử lý ủ vớ i cá c ion kim loạ i Cu2+, Mn2+, Mg2+, Fe2+, Ca2+ ở nồ ng độ 2 mM và EDTA ở nồ ng độ 2 mM trướ c khi xá c đị nh hoạ t độ . Kế t quả nghiên cứ u từ hì nh 5 cho thấ y, tí nh chấ t và mứ c độ ả nh hưở ng củ a cá c ion kim loạ i đế n hoạ t tí nh gelatinase từ chủ ng Bacillus sp.C7 là khá c nhau. Khi xử lý gelatinase vớ i EDTA thì hoạ t tí nh củ a enzyme giả m mạ nh, điề u nà y cho thấ y gelatinase thuộ c nhó m enzyme phụ thuộc kim loại (metalloenzyme). Kế t quả cũ ng cho thấ y hai ion kim loạ i là Mn2+ và Fe2+ là hai yế u tố hoạ t hó a củ a gelatinase là m tăng hoạ t tí nh enzyme. Ngượ c lạ i, ion Ca2+ là yế u tố kì m hãm là m giả m hoạ t tí nh gelatinase nên cầ n đượ c loạ i bỏ . Trong khi đó hai ion Cu2+ và Mg2+ làm thay đổi hoạt tính enzyme không đáng kể. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 117 TÀ I LIỆ U THAM KHẢ O Tiếng Việt 1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998. Công nghệ enzyme. NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 2. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982. Enzyme vi sinh vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 3. Lê Ngọ c Tú , La Văn Chư, Đặ ng Thị Thu, Phạ m Quố c Thắ ng, Nguyễ n Thị Thị nh, Bù i Đứ c Hợ i, Lưu Dữ ng, Lê Đoà n Diên, 1997. Hó a sinh họ c công nghiệ p. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 4. Lê Gia Hy (chủ biên), Khuất Hữu Thanh, 2010. Cơ sở Công nghệ vi sinh vật và ứng dụng. NXB Giáo dục Việt Nam. Tiếng Anh 5. Evans D., G., and Wardlaw A., C. , 1953. Gelatinase and Collagenase Production by certain Species of Bucillus. Evans, D. G. & Wardlaw, A. C.,. J. gen. Microbiol. 8, 481-487. 6. Harry L. Smith, Jr., And Goodner K. ,1958. Detection of bacterial gelatinases by gelatin-agar plate methods. Received for publication July 28. 7. Karim, A. A., Rajeev Bhat, 2009. Fish gelatin: properties, challenges, and prospects as an alternative to mammalian gelatins. Food Hydrocolloids 23, 563–576. 8. Kalidas Shetty, Gopinadhan Paliyath, Anthony Pometto, Robert E. Levin, 2006. Food Biotechnology. 2nd Edition, T&F Informa. 9. Nduka Okafor, 2007. Modern industrial microbiology and bitechnology. Science Publishers, Enfi eld, NH, USA. 10. Pickett M., J., Greenwood V J., R., and Harvey S., M. , 1991. Tests for Detecting Degradation of Gelatin: Comparison of Five Methods. Journal Of Clinical Microbiology, Oct., p. 2322-2325. 11. Reinhard Shrieber và Herbert Gareis 2007. Gelatine Handbook. Theory and Inductrial Practice. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Weinheim. 12. ShaoYun Wang, Kingsley Agyare, Srinivasan Damodaran, 2009. Optimisation of hydrolysis conditions and fractionation of peptide cryoprotectants from gelatin hydrolysate. Food Chemistry, 115(2): 620-630. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận - Phân lậ p và tuyể n chọ n đượ c chủ ng C7 có khả năng sinh tổ ng hợ p gelatinase cao nhấ t trong số các chủ ng phân lậ p đượ c trên môi trườ ng thạch gelatin-agar. - Kết quả định danh bằng giải trình tự đoạn gen 16S rDNA dài 472 bp cho thấy chủng C7 thuộc chi Bacillus, có độ tương đồng 100% với Bacillus subtilis, 100% với Bacillus licheniformis và 99,8% với Bacillus mojavensis. - Xá c đị nh đượ c một số yế u tố ả nh hưở ng đế n hoạ t độ ng xú c tá c phả n ứ ng thủy phân củ a gelatinase từ chủng Bacillus sp. C7: Nhiệ t độ thí ch hợ p là 50oC, pH thí ch hợ p 7,5, cá c ion Mn2+ và Fe2+ là cá c yế u tố hoạ t hó a và Ca2+ là cá c yế u tố kì m hãm hoạ t tí nh gelatinase. 2. Kiến nghị - Tiến hành giải trình tự đoạn gen 16S rDNA dài hơn hoặc thử nghiệm phản ứng hóa sinh để định danh chính xác chủng C7 đến loài - Nghiên cứu tinh chế gelatinase từ chủng C7 và áp dụng enzyme này nhằm thủy phân gelatin. - Nghiên cứu bổ sung gelatinase vào chượp sản xuất nước nắm nhằm tăng cường khả năng phân cắt các thành phần collagen từ da và sụn cá làm tăng hàm lượng đạm acid amin cho sản phẩm.