Phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A

TCNCYH 83 (3) - 2013 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A Bùi Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2, Nguyễn Thị Hà1, Tạ Thành Văn1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực hiện tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu quả nặng nề cho gia đình bệnh nhân và xã hội. Trong nghiên cứu này, 7 thành viên nữ trong 5 gia đình bệnh nhân hemophillia A được lựa chọn nghiên cứu; Sử dụng kỹ thuật Inversion PCR và giải trình tự gen để xác định tình trang mang gen bệnh. Kết quả phát hiện được 4/7 trường hợp là người lành mang gen bệnh ở dạng dị hợp tử. Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, trung tâm Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 17/4/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hemophilia (hay bệnh ưa chảy máu) là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu huyết tương: yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A phổ biến nhất, chiếm khoảng 85%, bệnh hemophilia B chiếm 15 ÷ 20% các trường hợp mắc bệnh hemophilia [1; 2]. Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X. Người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4.000 ÷ 1/5.000 trẻ trai. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A ở các nước khác nhau nhưng có tần suất chung khoảng 30 ÷ 100/1.000.000 dân [3]. Nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh (mẹ, chị và em gái) trong gia đình bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh trên những thai phụ có nguy cơ cao giúp tư vấn hôn nhân và tư vấn di truyền, là biện pháp cơ bản để ngăn ngừa và giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng. Ở Việt Nam, năm 2004 Lê Nhật Minh và cộng sự nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh của 9 gia đình có con mắc bệnh hemophilia A, sử dụng kỹ thuât cắt en- zym giới hạn (PCR - RFLP), tác giả đã phát hiện được 44,44% người mẹ mang gen bệnh, còn lại trên 50% không phát hiện được [4]. Có nhiều dạng đột biến trên gen F8 gây bệnh hemophilia A như: đột biến đảo đoạn intron 1, đảo đoạn intron 2, đột biến điểm... Để phát hiện các dạng đột biến gen cần phải sử dụng các kỹ thuật khác nhau cho từng dạng đột biến cụ thể. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào phân tích trực tiếp và toàn diện các dạng đột biến gen F8 trên bệnh nhân hemophilia A, đặc biệt là phát hiện người lành mang gen bệnh. Vì vậy, đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: Phát hiện người lành mang gen F8 đột biến gây bệnh hemophilia A. 2 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng - Nhóm chứng: 5 người nam bình thường khỏe mạnh. - Nhóm nghiên cứu: 7 thành viên nữ trong 5 gia đình bệnh nhân hemophillia A đã được xác định có đột biến gen F8 (bao gồm 01 bệnh nhân thể nặng có đột biến đảo đoạn intron 22 bằng phương pháp I-PCR, 03 bệnh nhân thể trung bình và nhẹ có đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen, 01 bệnh nhân thể nặng có đột biến mất 3 nucleotid bằng kỹ thuật giải trình tự gen). Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Đột biến phát hiện được ở bệnh nhân là đột biến chỉ điểm cho việc phát hiện trạng thái mang gen bệnh của người mẹ và các thành viên nữ trong gia đình. 2. Phương pháp 2.1. Mô hình nghiên cứu 2.2. Tách chiết DNA + DNA được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ, dì, chị gái). + Kiểm tra độ tinh sạch của DNA được tách chiết: bằng phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0. 2.2.3. Xác định đột biến gen F8 - Kỹ thuật I - PCR (Inversion - PCR) xác định đột biến đảo đoạn của Rosetti và cộng sự năm 2005 [5]. Quy trình gồm 3 bước: + Cắt bằng enzym BclI. Thành phần phản ứng: 1,5 µg DNA, H2O 25,5 µl, Buffer 10X 3µl, enzym BclI 1,5 µl (Promega). Ủ 370C/4 giờ → Tinh sạch bằng phenol chloroform. + Nối bằng T4 ligate Thành phần phản ứng: 20 µl DNA, Buffer 10X 20µl, enzym T4 ligate 1,0 µl (Promega). Ủ 41 µl hỗn hợp trên ở nhiệt độ 160C qua đêm → Tinh sạch sản phẩm thu được bằng cột GFXTM theo quy trình của hãng Amersham → Pha loãng sản phẩm thu (DNA đã đóng vòng) trong 20 µl H2O. + Khuếch đại bằng phản ứng multiplex- PCR: Tổng thể tích 20 µl bao gồm: H2O 12,0 µl, buffer 10X 2 µl, dNTPs 1,0 µl , DNA 3,0 µl, Extaq 0,5 µl, các mồi: IU 0,5 µl, ID 0,5 µl , ED 0,5 µl. Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex - PCR: 940C/2 phút; [940C/12 giây, 600C/30 giây, 720C/7 phút] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút. - Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến điểm Sử dụng 38 cặp mồi được thiết kế bao phủ toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon của gen F8 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và tiến hành giải trình tự theo 2 chiều. Do có kích thước lớn nhất, exon 14 được thiết kế 9 cặp TCNCYH 83 (3) - 2013 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mồi và exon 26 được thiết kế 5 cặp mồi để khuếch đại toàn bộ chiều dài exon. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 01 - Bệnh nhân mã số 1 được chẩn đoán lâm sàng hemophilia A thể vừa. Bằng kỹ thuật giải trình tự phát hiện exon 14 bị đột biến mất C tại vị trí 2605 (del2605C), gây lệch khung dịch mã, làm thay đổi trình tự các acid amin kể từ vị trí đột biến đến hết chiều dài phân tử protein F8. - Tiến hành giải trình tự gen F8 của người mẹ và chị gái bệnh nhân tại vị trí đã xác định được đột biến trên bệnh nhân ở exon 14. Kết quả cho thấy ở người mẹ xuất hiện các đỉnh chồng lên nhau sau điểm đột biến, điều này chỉ ra rằng người mẹ ở trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh); chị gái bệnh nhân cho thấy trình tự exon 14 hoàn toàn giống với người bình thường, như vậy chị gái bệnh nhân là người không mang gen bệnh (hình 1). Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 1 2. Kết quả giải trình tự gen gia đình bệnh nhân mã số 03 - Bệnh nhân mã số 3 được chẩn đoán lâm sàng hemophilia A thể nặng. Bệnh nhân được tiến hành xác định đột biến đảo đoạn theo quy trình đã mô tả ở phần phương pháp, kết quả cho thấy bệnh nhân không có đột biến đảo đoạn intron 1 và 22. - Bệnh nhân tiếp tục được tiến hành xác định đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến mất 3 nucleotid TCT tại exon 13 gây mất acid amin phenylalanine (vị trí codon 672). - Người mẹ được xác định tình trạng mang gen bệnh tại vị trí đột biến chỉ điểm trên exon 13 bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Kết quả cho thấy không có hình ảnh mất 3 nucleotid TCT tại exon 13. Như vậy, người mẹ không mang gen bệnh (hình 2). 4 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 3 3. Kết quả giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 04 - Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng Hemophilia A thể nhẹ. Bệnh nhân được tiến hành giải trình tự toàn bộ gen F8 để xác định đột biến điểm. Kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến thêm 1 nucleotid A trên exon 14 tại vị trí gây lệch khung dịch mã (Thr904Asn fs*2). - Người mẹ và người dì được xác định tình trạng mang gen bệnh tại vị trí đột biến chỉ điểm trên exon 14 bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Kết quả cho thấy người mẹ ở trạng thái dị hợp tử là người lành mang gen bệnh, dì bệnh nhân là người lành mang gen bệnh (hình 3). Người bình thường Bệnh nhân Dì bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Hình 3. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 4 TCNCYH 83 (3) - 2013 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 4. Kết quả chung Bảng 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 đột biến trên thành viên nữ của gia đình 5 bệnh nhân hemophilia A Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân hemophilia A Bệnh nhân mã số 1 Thể trung bình Đột biến del2605C trên exon 14 Bệnh nhân mã số 2 Thể nặng Đột biến đảo đoạn intron 22 Bệnh nhân mã số 3 Thể nặng Đột biến mất 3 nucleotid TCT Bệnh nhân mã số 4 Thể nhẹ Đột biến thêm 1 nucleotid A trên exon 14 Bệnh nhân mã số 5 Thể trung bình Đột biến thêm 1 nucleotid A trên exon 3 Mẹ bệnh nhân Dị hợp tử Dị hợp tử Không mang gen bệnh Dị hợp tử Dị hợp tử Chị bệnh nhân Không mang gen bệnh Dì bệnh nhân Không mang gen bệnh Tổng số Số thành viên gia đình được phân tích gen F8 = 7 người Số người lành mang gen bệnh = 4 người (4/5 người mẹ) Số người không mang gen bệnh = 3 người (1/5 người mẹ + 1 chị gái + 1 người dì IV. BÀN LUẬN Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X và không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Người mẹ mang gen F8 ở trạng thái dị hợp tử có thể truyền gen bệnh cho con trai và khi đó, con trai sẽ mắc bệnh hoặc truyền gen bệnh cho con gái, con gái ở dạng dị hợp tử, người con gái này khi sinh con sẽ có thể truyền gen bệnh cho con trai và con gái. Người bố mang gen đột biến truyền bệnh cho con gái ở dạng dị hợp tử. Đột biến do di truyền chiếm 2/3 các trường hợp đột biến gen F8, 1/3 các trường hợp còn lại là do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc từ người mẹ (denovo mutation). Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Theo Oldenburg và cộng sự, các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid, gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%), tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn intron 1 và intron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen (10 ÷ 15%). Tùy thuộc vào dạng đột biến và vị trí đột biến trên gen F8 mà trên lâm sàng xuất hiện các thể bệnh nặng nhẹ khác nhau. Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia quá trình hoạt hóa yếu tố VIII, các vùng intron của gen F8 là tác nhân chính gây ra các dạng đột biến đảo đoạn ở những bệnh nhân hemophilia A thể nặng [6]. Kết quả đột biến gen F8 của bệnh nhân là cơ sở khoa học cho những phân tích phát 6 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC hiện đột biến gen đối với các thành viên trong gia đình bệnh nhân và phát hiện người lành mang gen bệnh. Trước đây, những thai phụ mang gen bệnh thường được tư vấn chỉ nên sinh con gái, nếu thai nhi là nam thì khuyến cáo nên đình chỉ thai nghén để tránh sinh con bị bệnh hemophilia A. Ngày nay, những tiến bộ về sinh học phân tử đã cho phép phát hiện chính xác những người ở trạng thái dị hợp tử để thực hiện tư vấn hôn nhân và di truyền khi gia đình bệnh nhân có nguyện vọng. Các thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemo- philia A (người lành mang gen bệnh) được khuyến khích thực hiện chẩn đoán trước sinh và có cơ hội sinh con trai khỏe mạnh. Quy trình ấy cần có những điều kiện sau: (i) xác định được dạng và vị trí đột biến gen F8 ở bệnh nhân, (ii) dựa vào phả hệ và phân tích gen nhằm phát hiện những người lành mang gen bệnh trong cộng đồng những người cùng huyết thống với bệnh nhân. Tuy nhiên, do gen F8 rất dài nên việc xác định được vị trí đột biến cần nhiều thời gian [7; 8]. - Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã số 01 cho thấy: người mẹ ở trạng thái dị hợp tử, người chị gái không mang gen bệnh. Người mẹ đang mang thai, được tư vấn cần thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A. Người chị gái không cần thiết phải thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A nếu sinh thêm con. - Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã số 02 cho thấy người mẹ mang gen đột biến đảo đoạn intron 22, được tư vấn cần có chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho những lần mang thai sau. - Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã số 03 cho thấy người mẹ không mang gen F8 đột biến, như vậy người mẹ không cần thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho những lần mang thai sau. - Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã số 04 cho thấy người mẹ mang gen F8 ở trạng thái dị hợp tử và người mẹ này được tư vấn cần làm chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho lần mang thai tiếp theo; người dì không mang gen F8 bị đột biến, hiện đang mang thai tuần thứ 18 và được tư vấn không cần làm chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho những lần mang thai sau. - Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã số 05 với kết quả: người mẹ mang gen bệnh, bởi vậy người mẹ cần làm chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho lần mang thai thứ hai. Nghiên cứu tuy mới chỉ thực hiện trên các thành viên của 05 gia đình bệnh nhân (7 người) nhưng cho thấy việc xác định người lành mang gen thu được kết quả khả quan, có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và nhân văn đồng thời cũng là cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh đối với các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh hemophilia A nói riêng. V. KẾT LUẬN Phát hiện được 4/7 thành viên nữ của gia đình 5 bệnh nhân hemophilia A ở trạng thái dị hợp tử (người lành mang gen bệnh), là cơ sở khoa học cho công tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh. Lời cảm ơn Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen gây bệnh hemophilia A”. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM (1984). Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor, Nature, 312, 342 - 347. TCNCYH 83 (3) - 2013 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 2. Graw J, Brackmann HH, Oldenburg J et al (2005). Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies, Nat Rev Genet. 6 (6), 488 - 501. 3. Goodeve AC, Peake I. (2003). The mo- lecular basis of hemophilia A: genotype- phenotype relationships and inhibitor develop- ment, Semin Thromb Hemost., 29(1), 23 - 30. 4. Lê Nhật Minh, Lê Thị Kim Tuyến, Đỗ Trung Phấn (2004). Sử dụng phương pháp ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định các cá thể mang gen bệnh máu khó đông hemophilia A, Tạp chí Y học thực hành, 8, 61 - 62. 5. Liliana C. Rossetti (2005). Genotyping the Hemophilia Inversion Hotspot by use of Inverse PCR, Hemostasis and Thrombosis, 51 (7), 1154 - 1158. 6. Oldenburg, J., Ananyeva, N. M, Saen- ko, E. L (2004). Molecular basis of haemophil- ia A, Haemophilia, 10 (4), 133 –139. 7. A. M. Street, R. Ljung, S. A. Lavery (2008). Management of carriers and babie with Hemophilia, Haemphilia, 14(3), 181 - 187. 8. Anne Goodeve (2008), Moleculer Genetic testing of Hemophilia A, Seminar in thrombosis an Hemostasis, 34(6), 491 - 501. Summary DETECTION OF HEMOPHILIA A PATIENTS WITH RECESSIVE GENE Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease that causes abnormal blood coagula- tion. In order to reduce the incidence of this disease to identify the recessive Hemophilia - A gene carriers are important for prenatal diagnosis and genetic counseling. In this study, we selected 7 female members of 5 hemophillia A families; Reverse PCR and sequencing methods were used to detect the recessive Hemophilia - A gene carrier. The result showed that 4 out of 7 female members were found to have mutation in. in heterozygous form. Keywords: Hemophilia A, recessive Hemophilia-A gene carrier