Phân tích vi sinh

ĐẶC ĐIỂM NẤM MEN, NẤM MỐC 1 Nấm men Khái niệm nấm men Là sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có chung các đặc điểm sau đây: Có tồn tại trạng thái đơn bào Đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi là hình thức phân cắt tế bào. Hình thái, cấu tạo và kích thước nấm men Một tế bào nấm men dài khoảng 5 – 7 µm thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn Hình dạng nấm men thường là hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại có hình que và một số hình dạng khác như: hình trứng, hình ovan, hình mũ phớt, hình mụn cơm, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thuôn, hình thoi, hình tam giác... Hình 1.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống tế bào thực vật bao gồm đầy đủ các cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, ryboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ. + Thành tế bào: cấu tạo bởi hai lớp phân tử gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipid và glucozamin. Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó chất dinh dưỡng được hấp thu và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra. + Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 8 nm có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Tế bào chất của nấm men cũng tương tự như tế bào chất của vi khuẩn, độ nhớt của tế bào chất cao hơn nước là 800 lần. + Nhân: là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân tế bào nấm men ngoài AND còn có protein và nhiều loại men. + Ty thể: là cơ quan sinh năng lượng của tế bào. Có hình bầu dục được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc đính vô số các hạt nhỏ hình cầu trên bề mặt, các hạt này có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể. + Riboxom có hai loại: 80S nằm trong tế bào chất và 70S nằm trong ti thể. + Bào tử: nhiều nấm men có khả năng hình thành bào tử, đó là một hình thức sinh sản của nấm men. Sinh sản ở nấm men Có 3 hình thức sinh sản: Sinh sản sinh dưỡng: là hình thức sinh sản đơn giản nhất. Gồm kiểu nảy chồi và hình thành vách ngăn ngang phân đôi tế bào. + Hình thức nảy chồi: từ một cực của tế bào mẹ trong điều kiện thuận lợi nấm men hình thành chồi và nảy chồi thành một tế bào con chui ra khỏi tế bào mẹ, sau đó chồi dần phình to xuất hiện ngăn giữa hai tế bào. Tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ để lại sẹo trên tế bào mẹ và tế bào con hoặc có thể dính với tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi. + Hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces): tế bào dãn ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra làm hai phần tương đương nhau, mỗi tế bào con sẽ có một nhân. Sinh sản đơn tính: là hình thức sinh sản bằng bào tử. Có hai loại bào tử: + Bào tử túi: là bào tử hình thành trong một túi nhỏ gọi là nang. Trong nang thường chứa từ 1 – 8 bào tử, đôi khi đến 12 bào tử. Phương thức hình thành túi phụ thuộc vào hình thức sinh sản của nấm men. + Bào tử bắn là những bào tử sau khi hình thành nhờ năng lượng của tế bào bắn mạnh về phía đối diện. Đó là một hình thức phát tán bào tử. Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia hình thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử được phát tán ra ngoài. Nếu hai tế bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu hai tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao. Nấm mốc Khái niệm nấm mốc Hình 2.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải nấm men cũng không phải các nấm lớn có tai (nấm có kích thước lớn có thể nhìn thấy bằng mắt thường, có dạng như ô dù. Ví dụ: nấm rơm, nấm mèo,...). Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật đa bào dạng sợi phân nhánh, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có xellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, phân chuồng, nước, không khí,...). chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc bảo đảm vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, do chúng có khả năng phân giải các hợp chất như: cellulose, protein, lipid, kitin, pectin,... Hình thái cấu tạo và kích thước nấm mốc Một số ít nấm mốc có thể đơn bào có hình trứng, đa số nấm mốc có dạng hình sợi. Sợi nấm có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính sợi nấm thường từ 3 – 5 µm, có khi đến 10 µm, thậm chí đén 1mm. Chiều dài sợi nấm có thể lên tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Đỉnh sợi bao gồm một chóp hình nón có tác dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm. Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài và phân nhánh trong đó chứa các chất nguyên sinh, nhân, các bào quan và emzyme. Sợi nấm còn được gọi là khuẩn ty, có vách ngăn như nấm bậc cao (ascomycytes basicdiomycetes) các vách ngăn thường lên hệ với nhau bằng vách lỗ, không có vách ngăn như nấm bậc thấp (oomyctes, zygomycetes) hoặc hình ống có nhiều nhân gọi là sợi cộng bào. Hình 2.2 Sợi nấm dưới kính hiển vi + Dạng hình sợi có vách ngăn (đa số các loài nấm mốc khuẩn ty được tạo thành bởi một chuỗi tế bào nối tiếp nhau). Sợi nấm chứa một, hai hay nhiều nhân hoặc không có nhân do sự di truyền của nhân trong khuẩn ty. Ngăn cách hai tế bào là một màng ngăn. Vách ngăn ở đây không hoàn toàn mà có các lỗ hổng ở giữa vách ngăn giúp cho sự trao đổi chất giữa các tế bào. + Dạng sợi không có vách ngăn (nấm bậc thấp khuẩn ty) toàn bộ sợi nấm phân nhánh trong suốt có nhiều nhân ở rãi rác trong tế bào chất gọi là các tế bào đa nhân. Hệ sợi nấm có thể biến hóa để thích nghí với các điều kiện sống khác nhau hình thành các dạng đặc biệt sau: + Rễ giả: giống như một chùm rễ phân nhánh, có tác dụng giúp nấm bám chặt vào cơ chất và hấp thu chất dinh dưỡng từ cơ chất. + Sợi hút: có ở nấm mốc sống ký sinh bắt buộc, chúng mọc ra từ khuẩn ty, phân nhánh và mọc xuyên sâu vào tế bào chủ, ở đó chúng có thể có hình cầu hoặc hình sợi. Nấm mốc sử dụng sợi hút để hút chất dinh dưỡng từ cơ thể của sinh vật chủ. + Sợi áp: hiện diện ở nấm mốc kí sinh trên thực vật. Phần sợi nấm tiếp xúc với sinh vật chủ sẽ phồng to lên để tăng diện tích tiếp xúc với sinh vật chủ. Phàn này thường có hình đĩa, có nhiều nhân tế bào, áp chặt vào sinh vật chủ. Các mô của sinh vật chủ dưới tác dụng của enzyme do nấm tiết ra sẽ bị phá hủy từng phần hây bị phân hủy hoàn toàn. Qua các mô bị phá hủy này, sợi nấm sẽ lấn sâu vào bên trong sinh vật chủ và tiếp tục sinh enzyme để phân hủy sinh vật chủ mà không phát triển thành nhánh đâm sâu vào tế bào còn sống của sinh vật chủ như sợi hút. + Sợi bò: đoạn sợi nấm khí sinh không phân nhánh, phát sinh từ các sợi nấm dinh dưỡng, có hình thẳng hoặc hình cung. Đầu mút của sợi bò chạm vào cơ chất, phát triển thành rễ giả để bám chặt vào cơ chất rồi lan dần ra mọi phía. + Vòng nấm và mạng nấm: là những biến đổi của các loài nấm có khả năng bẫy các loài động vật nhỏ trong lòng đất. Vòng nấm có thể dạng bọng dính, mọc ra từ những cuống ngắn xếp thẳng góc với sợi nấm chính. Đỉnh phồng to hình thành bọng hình cầu tiết ra chất dính trên khắp bề mặt để giữ chặt con mồi khi chạm vào. Sợi nhánh đâm xuyên qua vỏ ngoài rồi phồng lên thành một bọng nhỏ bên trong cơ thể con vật và tiếp tục phân nhánh các sợi hút. Khi bào tử nấm mốc rơi vào điều kiện môi trường thích hợp, chúng sẽ nẩy mầm thành hệ sợi nấm. Trong hệ sợi nấm có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất) và khuẩn ty khí sinh: + Khuẩn ty dinh dưỡng cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng hút thức ăn làm nhiện vụ nuôi dưỡng. + Khuẩn ty khí sinh phát triển tự do trong không khí mang cuống bào tử và chuỗi làm nhiệm vụ sinh sản. Sợi nấm được bao bọc bởi một lớp màng mỏng gọi là thành tế bào, thành tế bào nấm hầu như không được bao bọc bởi xellulose như ở thực vật mà ngược lại là chất kitin. Màng tế bào chất dày. Nhân: thường có hình tròn, đôi khi kéo dài. Ty thể có hình elip và luôn di động. Sinh sản ở nấm mốc Sinh sản sinh dưỡng: nếu một khuẩn ty của nấm mốc đặt vào điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành khuẩn ty mới. Sinh sản vô tính: + Sinh sản vô tính bằng các loại bào tử: gồm các loại bào tử có một hoặc hai tiên mao có khả năng di động trong môi trường nước. Chúng được sinh ra từ các nang động bào tử. Hình 2.3 Các kiểu động bào tử + Bào tử túi (bào tử lọc): gồm các bảo tử được sinh ra từ các nang bào tử kín. Nang còn non chứa nhiều nhân, các nhân phân chia gián phân, sau đó chất nguyên sinh trong nan phân chia ra làm nhiều phần, mỗi phần chứa 1 – 6 nhân. Các phần này được bao bọc bởi vỏ chitin và biến đổi thành bào tử kín. + Bào tử đỉnh: bào tử trần sinh ra theo kiểu cả phần đầu của sợi nấm chuyển hóa thành. + Bào tử tản: sợi nấm xuất hiện tế bào có vách dầy được gọi là bào tử áo vị trí khác nhau tùy loài. + Bào tử đốt: sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chữ nhật và tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt. Sinh sản hữu tính: xảy ra khi có sự kết hợp giữa giao tử đực và cái, có trải qa giai đoạn giảm phân. Qúa trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: + Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp hai tế bào trần của hai giao tử + Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp hai nhân của hai giao tử để tạo một nhân dị bội + Giảm phân hình thành bốn bào tử đơn bội. HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG MT-Hóa chất Mục đích Saline Pepton Water (SPW) NaCl 85g,pepton 10g,nước cất 1000ml Pha loãng mẫu DG 18 (Dichloran 18% Glycerol) Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme, D-glucose,KH2PO4, Mg Nuôi cấy nấm men-nấm mốc DRBC (Dichloran Rose Begal Chloramphenicol) glucose 10g,peptone 5g,K2HPO4 1g,MgSO4 0,5g,Rose Bengal (5%w/v) 0,5 ml,Dichloran (0,2% w/v trong ethanol) 1ml,Chloramphenicol 0,1g, Agar 15g,Nước cất 1000ml.pH 7,0±0,2 HCl 10% Chỉnh pH NaOH 10% CÁCH TIẾN HÀNH Cân 10/25g đối với mẫu rắn hoặc 10/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water (SPW) QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 2-3 phút Dịch mẫu (10-2) Dịch mẫu (10-1) Pha loãng ∙∙∙ 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml DRBC hoặc DG18 DRBC hoặc DG18 DRBC hoặc DG18 DRBC hoặc DG18 . Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch. Ủ 250C/3-5 ngày Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc <=150 khuẩn lạc/mầm/chồi ở 2 độ pha loãng lien tiếp Tính và biểu thị kết quả Chuẩn bị Mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g/ 25g đối với thực phẩm rắn hoặc đong 10/25ml đối với thực phẩm lỏng (sai số ± 5%) cho vào túi nhựa vô trùng (hoặc bình tam giác). Hút dung dịch SPW 90ml/225ml cho vào túi đã chứa mẫu. Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu (2-3p). Giữ nhiệt độ dung dịch bằng với nhiệt độ phòng suốt quá trình Lắc huyền phù và dd pha loãng (tránh có phần tử có VSV lắng xuống) Pha loãng mẫu Dùng pipet hút 1ml dung dịch huyền phù ở bước chuẩn bị mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp. Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng ở các nồng độ khác nhau.Nếu cần thì lặp lại quá trình pha loãng ở mức 10 -4 ,10-5 Quá trình pha loãng theo sơ đồ sau: Cấy và ủ mẫu Hút 0,3ml dung dịch mẫu pha loãng 10-1 cho vào đĩa Petri đã có sẵn môi trường DRBC hoặc DG18.Sau đó lặp lại các bước này (nếu cần) cho các mẫu pha loãng 10-2 .kế tiếp cho đến mẫu pha loãng cuối cùng.. Dàn đều dịch lỏng khắp bề mặt đĩa, tạo điều kiện cho tế bào tiếp xúc tối đa với oxi KK và giảm nguy cơ bất hoạt. Cho vài túi ni lông.Ủ đĩa trong môi trường hiếu khí, tư thế thẳng đứng (25±1oC) trong 3-5 ngày. Lưu ý: Cần lưu ý rằng trong thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát triển trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào không khí, gay nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. Đếm và chọn khuẩn lạc để khẳng định Đếm trên đĩa ủ 3-5 ngày. Chọn các đĩa ít hơn 150 khuẩn lạc và đếm chúng. Kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt tế bào. nấm men, nấm mốc và VK từ khuẩn lạc nếu cần. Đếm riêng nấm men nấm mốc nếu cần. Để dễ nhận biết, chọn vùng phát triển hoặc cấy trên môi trường phân lập để kiểm tra. Kết quả: Tổng số nấm men hoặc nấm mốc trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức: X=∑CV × (n1+0,1 ×n2)×d (CFU/g hay CFU/ml) Trong đó: C: Tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của 2 độ pha loãng lien tiếp. V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml n1: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất. n2: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2. d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất Làm tròn số kết quả có được tới 2 số có nghĩa 9(chẳng hạn 2864 làm tròn la 2900) và biểu thị theo công thức: a x10n a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1,0 tới 9,9 n: số mũ phù hợp của 10