Phân tích tính đa dạng DNA tập đoàn cây gỗ Sưa bằng chỉ thị RAPD và ISSR

Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Phân tích tính đa dạng DNA tập đoàn cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) bằng chỉ thị RAPD và ISSR” Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Vũ Đình Hòa TS. Đinh Thị Phòng Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Vân Anh Lớp: CNSH K51 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NỘI DUNG CHÍNH PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) thuộc chi Dalbergia, họ đậu (Fabaceae). Ghi nhận trong Danh lục đỏ Việt Nam và được Chính phủ Việt Nam quy định trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP là loài đặc biệt quý hiếm, có nguy cơ đe doạ tuyệt chủng. Cây Sưa đang bị khai thác quá mức vì vậy việc bảo tồn cây này đang là việc làm cấp thiết. Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Trước đây, việc đánh giá đa dạng di truyền các loài cây gỗ thường sử dụng chỉ thị hình thái. Tuy nhiên, độ chính xác không cao nên có nhiều hạn chế. Ngày nay, Công nghệ Sinh học đã khắc phục được những nhược điểm của chỉ thị hình thái và đưa ra hoàng loạt các chỉ thị phân tử: (RFLP, AFLP, RAPD, ISSR …) để đánh giá đa dạng di truyền. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) tương đối đơn giản, dễ thực hiện nên được sử dụng phổ biến và rộng rãi. Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ “Phân tích đa dạng DNA tập đoàn cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị ISSR” Mục đích: Xem xét, đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các giống trong tập đoàn cây gỗ Sưa Làm cơ sở cho công tác bảo tồn và tái tạo nguồn gen quý hiếm này. Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo luận khóa luận nghiệp - 2010 Hình 1.1: Hình ảnh về cây gỗ Sưa Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo luận khóa luận nghiệp - 2010 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu thực vật 35 mẫu lá cây gỗ Sưa do phòng Sinh học thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp. bảng 2.1 2. Các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu 17 chỉ thị (7 chỉ thị RAPD và 10 chỉ thị ISSR) . A. Vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Bảng kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu Bảng 2.2. Danh sách tên và trình tự nuleotide 17 chỉ thị nghiên cứu Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số từ lá Sưa DNA được tách chiết dựa theo quy trình CTAB của Doyle và Doyle, 1987 DNA tổng số sẽ được xác định hàm lượng và độ sạch Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,9% Xác định hàm lượng và độ sạch của DNA bằng quang phổ kế Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B. Phương pháp nghiên cứu 2. Phương pháp phân tích tính đa hình DNA dựa trên phản ứng PCR Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR – RAPD dựa theo nghiên cứu của William và cộng sự, 1990 Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR – ISSR dựa theo nghiên cứu của Zeitkiewic và cộng sự, 1994 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU B. Phương pháp nghiên cứu 3. Phương pháp phân tích số liệu Số liệu được phân tích trong phần mềm NTSYSpc2.0 Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi chỉ thị được xách định theo công thức của Saa và Wricke (1999). PICi = 1 - ∑Pij2 Trong đó Pij là tần số alen thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không đa hình) tới 1 (đa hình hoàn toàn). Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tách chiết DNA tổng số từ 35 mẫu lá cây gỗ Sưa 1 Kết quả phân tích tính đa dạng DNA của 35 mẫu cây gỗ Sưa với 7 chỉ thị RAPD và 10 chỉ thị ISSR 2 Mối quan hệ di truyền giữa 35 mẫu cây gỗ Sưa với 7 chỉ thị RAPD và 10 chỉ thị ISSR 3 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ 35 mẫu lá cây gỗ Sưa Hình 3.1: Hình ảnh DNA tổng số đại diện của 14 mẫu lá cây gỗ Sưa chạy điện trên gel agarose 0,9%. Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Bảng 3.1: Bảng giá trị đo OD của 35 mẫu nghiên cứu ← Bảng 3.2: Giá trị PIC và % phân đoạn đa hình của 35 mẫu cây gỗ Sưa phân tích với 17 chỉ thị Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị OPP08 Hình 3.2: Sản phẩm PCR-RAPD của 35 mẫu cây gỗ Sưa với chỉ thị OPP 08 (giếng 1-35: thứ tự sắp xếp của các mẫu cây gỗ Sưa như trong bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb). 1,3kb 0.35kb 0,25kb 0,5kb 0,75kb 1kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3031 32 33 34 35 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị OPP19 Hình 3.2: Sản phẩm PCR-RAPD của 35 mẫu lá cây gỗ Sưa với chỉ thị OPP 19 (giếng 1-35: thứ tự sắp xếp của các mẫu cây gỗ Sưa như trong bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb). 0.8kb 0,25kb 0,5kb 0,75kb 1kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 1314 15 16 17 1819 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3031 32 33 34 35 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chỉ thị IS15 Hình 3.3: Sản phẩm PCR-ISSR của 35 mẫu lá cây gỗ Sưa với chỉ IS15 (giếng 1-35: thứ tự sắp xếp của các mẫu cây gỗ Sưa như trong bảng 2.1; M: marker phân tử 10kb). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 0.5kb 0.75kb 0.45kb 0.75kb Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổng hợp kết quả phân tích DNA của 35 mẫu cây gỗ Sưa bảng 3.3 Tổng số phân đoạn DNA nhân bản của 35 mẫu với 17 chỉ thị là 2246. Trong đó: Chỉ thị P55 nhân bản được nhiều phân đoạn nhất (215 phân đoạn) Chỉ thị OPG13 nhân bản được ít phân đoạn nhất (68 phân đoạn) Số lượng phân đoạn DNA được nhân bản khi phân tích với 17 chỉ thị dao động từ 60 đến 70. Trong đó, mẫu Dt22 có số phân đoạn nhân bản được ít nhất (60 phân đoạn DNA) và nhiều nhất là mẫu Dt05 (70 phân đoạn DNA). ← Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 3.4: Giá trị tương quan kiểu hình (r) giữa 35 mẫu lá cây gỗ Sưa Hệ số di truyền Kiểu phân nhóm Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN + Hệ số tương đồng di truyền của 35 mẫu nghiên cứu dao động từ 0,800 đến 0,978. + Mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội có kí hiệu Dt1 đến Dt25 có hệ số tương đồng dao động từ 0,884 đến 0,955 với hệ số tương đồng trung bình là 0,935. + Mẫu thu thập tại Vườn Quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng – Quảng Bình kí hiệu từ Dt26 đến Dt35 với hệ số tương đồng di tuyền dao động từ 0,800 đến 0,962 với hệ số tương đồng trung bình là 0,893. + Các mẫu ở Hà Nội có mối quan hệ di truyền gần gũi hơn so với các mẫu trên ở Quảng Bình. Kết quả về hệ số tương đồng di truyền của 35 mẫu nghiên cứu. bảng 3.5 Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.4: Sơ đồ hình cây của 35 mẫu nghiên cứu II I II.2 II.1 II.2.2 II.2.1 a b 0.978 0.848 II I II.2 II.1 II.2.2 II.2.1 a b Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình 3.5. Biểu đồ tọa độ đa chiều của 35 mẫu nghiên cứu Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Chỉ thị RAPD và chỉ thị ISSR có hiệu quả trong việc sử dụng phân tích tính đa hình DNA tập đoàn cây gỗ Sưa. 2. Tính đa hình DNA giữa các mẫu nghiên cứu thấp với giá trị PIC dao động từ 0 đến 0,496. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu cao, dao động từ 0,8 đến 0,978. Các mẫu thu thập ở Hà Nội có mối quan hệ gần gũi với nhau hơn so với các mẫu thu ở Quảng Bình. 4. Biểu đồ hình cây của 35 nghiên cứu đã phân ra làm 02 nhánh chính rõ ràng có mức độ sai khác di truyền từ 2,2% đến 15,2%. Những mẫu có cùng địa điểm thu thập có xu hướng tập trung vào các nhánh phụ. A. Kết luận Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Báo cáo khóa luận tốt nghiệp - 2010 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ B. Kiến nghị Tiếp tục phân tích tính đa dạng di truyền của loài cây này với số lượng chỉ thị nhiều hơn, và thu thập mẫu ở nhiều địa điểm. Các mẫu cây gỗ Sưa có hệ số tương đồng di truyền khá cao chính vì vậy cần có biện pháp, kế hoạch bảo tồn hợp lý nguồn gen cây này. Em xin chân thành cảm ơn!