Phân tích mức độ biểu hiện của các protein bền nhiệt trong huyết thanh bệnh nhân đái tháo đường type 2 có biến chứng mạch vành cấp - Nguyễn Thị Minh Phương

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 212-219 212 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC PROTEIN BỀN NHIỆT TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 CÓ BIẾN CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP Nguyễn Thị Minh Phương1, Trần Thái Thượng1, Nguyễn Bích Nhi1, Đặng Minh Hải2, Đỗ Doãn Lợi2, Phan Văn Chi1* 1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *pvchi@ibt.ac.vn 2Viện Tim mạch Quốc gia, Bệnh viện Bạch Mai TÓM TẮT: Bệnh mạch vành cấp (MVC) là một biến chứng chủ yếu, hay gặp và thường dẫn đến tử vong ở các bệnh nhân đái tháo đường type 2 (ĐTĐT2). Nguyên nhân là do bệnh nhân ĐTĐT2 có những yếu tố làm tăng nguy cơ bị MVC như: mỡ máu cao; huyết áp cao; béo phì và thói quen ít vận động. Bệnh ĐTĐT2 với biến chứng MVC có thể làm sai hỏng cấu trúc và chức năng của tim dẫn tới loạn nhịp tim và suy tim. Vì vậy, việc nghiên cứu để hạn chế các biến chứng MVC ở các bệnh nhân ĐTĐT2 sẽ làm giảm nguy cơ tử vong và kéo dài cuộc sống cho họ. Trong nghiên cứu này, phương pháp biến tính nhiệt đã được sử dụng để loại bỏ các protein hàm lượng lớn trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Hỗn hợp protein sau khi phân đoạn nhiệt được phân tách bằng điện di hai chiều và hình ảnh điện di được xử lý bằng phần mềm PDQuest v7.1. Những protein có mức độ biểu sai khác có ý nghĩa giữa mẫu thường và mẫu bệnh sẽ được nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối khối phổ (nanoLC-MS/MS). Kết quả, 13 protein có mức độ biểu hiện tăng/giảm trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC đã được xác định. Trong đó, 5 protein (chuỗi fibrinogen alpha, chuỗi fibrinogen gama, chuỗi haptoglobin beta, chuỗi haptoglobin alpha 1 và zinc alpha 2 glycoprotein) có mức độ biểu hiện tăng và 6 protein (alpha 1 antitrypsin, angiotensinogen, antithrombin III, apolipoprotein A-I, apolipoprotein E và transthyretin) có mức độ biểu hiện giảm trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Trong khi đó chuỗi haptoglobin alpha 2 và apolipoprotein A-IV lúc biểu hiện tăng, lúc biểu hiện giảm trong huyết thanh mẫu bệnh. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các protein này đều liên quan đến sự phát sinh và phát triển của bệnh ĐTĐT2 và bệnh MVC. Từ khóa: Bệnh mạch vành cấp, đái tháo đường type 2, điện di hai chiều, huyết thanh, protein bền nhiệt, sắc ký lỏng kết nối khối phổ. MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, bệnh đái tháo đường type 2 (ĐTĐT2) đang ngày càng gia tăng cả về tỷ lệ, biến chứng và đối tượng mắc bệnh. Theo thống kê mới nhất của Bệnh viện Nội tiết Trung ương, Việt Nam có khoảng gần 5,7 triệu người mắc căn bệnh này, trên 64% người bị mắc bệnh ĐTĐT2 chưa được phát hiện và độ tuổi mắc bệnh ngày càng trẻ hóa. Người bị đái tháo đường (ĐTĐ) có nguy cơ bị tim mạch cao gấp 4 đến 10 lần so với người bình thường [29]. Bệnh mạch vành cấp (MVC) là một biến chứng chủ yếu của bệnh ĐTĐT2. Nhiều thống kê cho thấy, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ bị xơ vữa động mạch, tỉ lệ này chỉ chiếm 30% nếu bệnh nhân không có ĐTĐ [6]. Tùy theo vị trí các mạch máu bị tổn thương, mà các bệnh nhân ĐTĐ thường xuất hiện một số biến chứng tim mạch khác nhau. Phổ biến nhất là các bệnh nhân ĐTĐT2 bị hẹp hoặc tắc động mạch vành gấp 3 lần người bình thường. Tổn thương động mạch vành sẽ gây thiếu máu cơ tim, nhồi máu cơ tim, suy tim, chết đột ngột. Bệnh ở dạng cấp tính là những cơn đau thắt ngực không ổn định hoặc có thể là nhồi máu cơ tim cấp, hạ huyết áp, tử vong do loạn nhịp tim, rất nguy hiểm với người bệnh. Với biến chứng mãn tính do ĐTĐ gây ra là bệnh nhân bị tổn thương hẹp động mạch vành diễn biến âm thầm dẫn đến thiếu máu hay nhồi máu cơ tim yên lặng, gây hậu quả suy tim trên bệnh nhân ĐTĐ [16]. Một số nghiên cứu cho thấy có một mối liên quan chặt chẽ giữa bệnh ĐTĐT2 và bệnh MVC [1, 6]. Nguyên nhân là do mức độ đường máu tăng cao kéo dài ở những bệnh nhân ĐTĐT2 sẽ ảnh hưởng lên lớp bao quanh thành động mạch, có thể làm dày thành mạch máu dẫn đến hẹp lòng động mạch (chứng xơ vữa động mạch). Ngoài ra, ở bệnh ĐTĐT2 còn có một số yếu tố Nguyen Thi Minh Phuong et al. 213 nguy cơ cao dẫn đến bệnh MVC như: nồng độ HDL (high densitylipoprotein) cholesterol thấp và triglyceride tăng cao trong huyết thanh [26]; tăng huyết áp [21]; béo phì; thói quen hút thuốc lá và ít vận động [20]. Bên cạnh đó, bệnh MVC ở những bệnh nhân ĐTĐT2 thường làm tăng nguy cơ mắc các hội chứng vi mạch chủ yếu là bệnh thận ở giai đoạn cuối hoặc bệnh thần kinh liên quan đến ĐTĐ [2]. Vì vậy, việc nghiên cứu gì để hạn chế các biến chứng MVC ở các bệnh nhân ĐTĐT2 sẽ làm giảm nguy cơ tử vong cho họ [23]. Hiện nay, ở Việt Nam, những nghiên cứu trên bệnh ĐTĐT2 và các biến chứng đã thu được những kết quả nhất định [14, 18, 24]. Tuy nhiên, những nghiên cứu cơ bản trên bệnh ĐTĐT2_MVC nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học hỗ trợ cho việc phát hiện sớm biến chứng MVC của bệnh ĐTĐT2 còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày về kết quả phân tích mức độ biểu hiện của hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC bằng cách sử dụng các kỹ thuật proteomics. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Mẫu huyết thanh của người bình thường, 10 mẫu (là những người không mắc bệnh ĐTĐ, bệnh thận, bệnh tim mạch) và bệnh nhân ĐTĐT2_MVC, 10 mẫu (bệnh nhân ĐTĐT2 có hội chứng mạch vành cấp gồm đau thắt ngực không ổn định và nhồi máu cơ tim cấp) được cung cấp bởi Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai thông qua các xét nghiệm: các chỉ tiêu hóa sinh huyết thanh (Glucose huyết, Cholesterol toàn phần, Triglyceride, HDL-cholesterol, LDL- cholesterol, SGOT, SGPT, Creatinine máu, Troponin, CK-MB, BNP); các chỉ tiêu huyết áp, điện tim, siêu âm tim, chụp X quang tim phổi và chụp mạch vành. Các hóa chất được sử dụng gồm: Methanol, acetonitrile (ACN), formic acid (FA), trifluor acetic acid (TFA) của Fluka (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Thụy sỹ); enzyme trypsin của Sigma Aldrick (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Hoa Kỳ), Coomassie Brilliant Blue G 250 được mua từ MP Biomedicals (MP Biomedicals, Eschwege, Đức) và các hóa chất dùng cho điện di một chiều, hai chiều của Bio- Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Hệ thống máy điện di 1 chiều và 2 chiều được cung cấp bởi hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Hệ thống máy khối phổ QSTAR®XL của AppliedBiosystem (AppliedBiosystem/MDS Sciex, Toronto, Canada), hệ thống máy sắc ký lỏng nano được cung cấp bởi LC Packings/Dionex (Amsterdam, Nertherland) và một số thiết bị khác của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp Phân đoạn protein trong huyết thanh bằng phương pháp biến tính nhiệt Huyết thanh được trộn với đệm cân bằng (EDTA 20 mM, Tris HCl pH 8,9 0,2 M, polyethylene glycol (PEG) 6.000 7%) theo tỷ lệ 1:1. Hỗn hợp huyết thanh và đệm được ủ và lắc 15 phút ở 98oC và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, mẫu được ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút để thu giữ phần dịch nổi. Hỗn hợp protein sau khi phân đoạn nhiệt được tủa bằng acetone lạnh và nồng độ protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford (1976) trước khi tiến hành điện di hai chiều [5]. Phân tách protein bằng điện di hai chiều Hỗn hợp protein bền nhiệt được hòa lại trong 125 l dung dịch đệm rehydration (Urea 8 M; 2% CHAPS; đệm 0,8% IPG pH 4,7-5,9; 13 mM DTT). Hỗn hợp mẫu được rehydrate hóa trên thanh gel cố định (7 cm, pH 4,7-5,9; Bio- Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ) trong 12h. Quá trình điện di đẳng điện được tiến hành trên hệ thống PROTEAN IEF cell (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ) theo quy trình: 250 V trong 20 phút; 250 V đến 4.000 V trong 1 giờ và 4.000 V cho đến khi đạt được 12.000 Vhr. Sau đó, thanh gel được khử bằng đệm cân bằng 1 (50 mM Tris-HCl pH 8,8; 6 M Urea; 30% Glycerol; 2% SDS; 1% DTT) và alkyl hóa bằng đệm cân bằng 2 (Urea 6 M; SDS 2%; 0,375 M Tris-HCl pH 8,8; Glycerol 20% và IAA 40 mM). Các protein được phân tách chiều hai trên gel SDS-PAGE 12.6% sử dụng hệ thống điện di Mini TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 212-219 214 PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Gel được nhuộm bằng dung dịch Coommassie Brilliant Blue G-250. Bản gel được quét và phân tích hình ảnh bằng phần mềm PDQuest v7.1 (Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ). Nhận dạng và xác định protein bằng sắc ký lỏng kết nối khối phổ (nanoLC-ESI-MS/MS) Các điểm protein có sự biểu hiện sai khác giữa mẫu đối chứng và mẫu bệnh được thủy phân bằng enzyme trypsin theo quy trình đã được mô tả bởi Nguyễn Thị Minh Phương và nnk. (2008) [25]. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được phân tách trên hệ thống sắc ký lỏng nanoLC (Packing, Dionex, Netherland). Peptide được loại muối và cô đặc trên cột TRAP C18 (PepMap100, LC Packing, Dionex, Netherland) và phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18 (GraceVydac, Hesperia, CA, Hoa Kỳ). Mẫu được đưa lên cột với tốc độ dòng 0,2 l/phút bằng dung dịch FA 0,1% và thôi ra khỏi cột C18 bằng gradient từ 0 đến 100% đệm B trong 60 phút. Quá trình thực hiện khối phổ liên tiếp được tiến hành trên hệ thống khối phổ QSTAR®XL. Các protein được nhận dạng thông qua phần mềm Mascot v.1.8 (MatrixScience Ltd., London, UK) trên cơ sở dữ liệu NCBInr. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân đoạn protein trong huyết thanh bằng phương pháp biến tính nhiệt Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để có thể giảm bớt các thành phần protein hàm lượng cao trong huyết thanh như: phương pháp sắc ký, cut-off, sử dụng kít để loại bỏ các protein có hàm lượng lớn, biến tính nhiệt... Trong đó, biến tính nhiệt là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và hiệu quả trong việc loại bỏ bớt các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh (gây ảnh hưởng cho việc phân tích và nhận dạng các protein có hàm lượng thấp). Quy trình phân đoạn nhiệt protein trong huyết thanh được tiến hành như đã trình bày trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Hỗn hợp protein bền nhiệt trong huyết thanh người (bệnh ĐTĐT2_MVC, bình thường) sau khi tủa được xác định nồng độ trước khi phân tách bằng điện di hai chiều [5]. Phân tích và xác định các protein bền nhiệt có mức độ biểu hiện thay đổi trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC Hình 1. Hình ảnh minh họa kết quả 2DE của protein bền nhiệt trong huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ĐTĐT2_MVC (bộ 1). Các vùng điểm protein có sự biểu hiện khác biệt được khoanh tròn đánh số. (A): Mẫu người bình thường, (B) Mẫu bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. (1) Angiotensinogen; (2) Chuỗi fibrinogen alpha; (3) Chuỗi fibrinogen gama; (4) Chuỗi haptoglobin beta; (5) Zinc alpha 2 glycoprotein; (6) Apolipoprotein E; (7) Apolipoprotein A-I; (8) Chuỗi haptoglobin alpha 2; (9) Transthyretin; (10) Apolipoprotein A-IV; (11) Chuỗi haptoglobin alpha 1. Nguyen Thi Minh Phuong et al. 215 Hình 2. Hình ảnh minh họa kết quả 2DE của protein bền nhiệt trong huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ĐTĐT2_MVC (bộ 2). Các vùng điểm protein có sự biểu hiện khác biệt được khoanh tròn đánh số. (A): Mẫu người bình thường, (B) Mẫu bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. (1) Antithrombin III; (2) Alpha 1 antitrypsin; (3) Chuỗi haptoglobin alpha 2; (4) Transthyretin; (5) Apolipoprotein A-I & Apolipoprotein A-IV. Để phân tích mức độ biểu hiện của hệ protein bền nhiệt trong mẫu huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ĐTĐT2_MVC, phương pháp điện di hai chiều (2DE) trên các thanh gel 7cm với dải pH 4,7-5,9 đã được sử dụng. Sau đó các bản gel 2DE được nhuộm bằng Commasive blue R 250. Hình ảnh 2DE của protein bền nhiệt trong huyết thanh người bình thường và bệnh nhân ĐTĐT2_MVC được minh họa như trên hình 1 và hình 2. Các mẫu thí nghiệm đều được thực hiện cùng lúc (tủa, đo nồng độ, 2DE và nhuộm) để tránh tối đa những sai khác do thực hiện mẫu bằng tay. Trên bản gel 2DE, các protein được phân tách thành từng spot hoặc hình thành những dải spot của một loại protein. Đây là kết quả của việc cải biến sau dịch mã của các protein (quá trình glycosyl hóa và phosphoryl hóa) có thể tạo ra các đồng phân với khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau. Hình ảnh điện di được phân tích bằng phần mềm PDQuest v7.1. Những protein có mức độ biểu hiện thay đổi có ý nghĩa ở mẫu bệnh so với mẫu đối chứng đều được cắt ra, thủy phân bằng enzyme trypsin, phân tích và nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối khối phổ. Protein được tìm kiếm bằng phần mềm Mascot v.1.8 (MatrixScience Ltd., London, UK) trên cơ sở dữ liệu NCBInr với hơn 8 triệu trình tự protein. Kết quả đã xác định 13 protein bền nhiệt có mức độ biểu hiện tăng/giảm trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC (bảng 1). Trong đó, 5 protein là chuỗi haptoglobin beta, chuỗi haptoglobin alpha 1, chuỗi fibrinogen alpha, chuỗi fibrinogen gama, zinc alpha 2 glycoprotein có mức độ biểu hiện tăng và 6 protein là alpha 1 antitrypsin, angiotensinogen, antithrombin III, apolipoprotein A-I, apolipoprotein E, transthyretin có mức độ biểu hiện giảm trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC so với người bình thường. Trong khi đó, 2 protein là chuỗi haptoglobin alpha 2 và apolipoprotein A-IV có mức độ biểu hiện lúc tăng, lúc giảm trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Bên cạnh đó, mức độ biểu hiện của 13 protein bền nhiệt trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC và người bình thường được định lượng tương đối bằng phần mềm PDQuest v7.1 (bảng 1). Kết quả cho thấy mức độ tăng/giảm của các protein bền nhiệt không đều, một số protein có mức độ biểu hiện tăng nhẹ ở mẫu ĐTĐT2_MVC như: chuỗi fibrinogen alpha (1,37 ± 0,13 lần), chuỗi haptoglobin beta (1,29 ± 0,25 lần), zinc alpha 2 glycoprotein (1,71 ± 0,27 lần) hoặc chỉ thấy xuất hiện ở mẫu bệnh như chuỗi fibrinogen gama, chuỗi haptoglobin alpha 1. Ngược lại, có protein lại giảm nhẹ mức độ biểu hiện như alpha 1 antitrypsin (1,36 ± 0,23 lần), angiotensinogen (2,36 ± 0,12 lần), TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 212-219 216 antithrombin III (1,29 ± 0,15 lần), apolipoprotein A-I (1,84 ± 0,34 lần), transthyretin (giảm 2,5 ± 0,45 lần) hoặc không phát hiện được bằng 2DE ở mẫu bệnh ĐTĐT2_MVC như apolipoprotein E. Bảng 1. Kết quả nhận dạng và xác định protein có mức độ biểu hiện thay đổi trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC STT Tên protein Số đăng ký trên NCBInr Mức độ biểu hiện ở mẫu bệnh ĐTĐT2_MVC 1 Alpha 1 antitrypsin gi|225768 Giảm 1,36 ± 0,23 lần 2 Angiotensinogen gi|19705570 Giảm 2,36 ± 0,12 lần 3 Antithrombin III gi|179161 Giảm 1,29 ± 0,15 lần 4 Apolipoprotein A-I gi|178777 Giảm 1,84 ± 0,34 lần 5 Apolipoprotein A-IV gi|114008 Cả tăng và giảm ở mẫu bệnh 6 Apolipoprotein E gi|37805241 Giảm hoặc không phát hiện được bằng 2DE ở mẫu bệnh 7 Chuỗi fibrinogen alpha gi|790486 Tăng 1,37 ± 0,13 lần 8 Chuỗi fibrinogen gama gi|182430 Chỉ xác định được ở mẫu bệnh 8 Chuỗi haptoglobin beta gi|1212947 Tăng 1,29 ± 0,25 lần 10 Chuỗi haptoglobin alpha 2 gi|4826762 Cả tăng và giảm ở mẫu bệnh 11 Chuỗi haptoglobin alpha 1 gi|229323 Chỉ xác định được ở mẫu bệnh 12 Transthyretin gi|126030594 Giảm 2,5 ± 0,45 lần 13 Zinc alpha 2 glycoprotein gi|141596 Tăng 1,71 ± 0,27 lần Thảo luận Ở bệnh nhân ĐTĐT2_MVC, nồng độ đường máu và mỡ máu tăng cao có thể gây nên những biến đổi bất thường trong hệ protein huyết thanh do đó có khả năng dẫn đến thay đổi về mức độ biểu hiện của những protein này. Trong nghiên cứu này, 13 protein có mức độ biểu hiện thay đổi trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC đã được xác định.Trong đó, apolipoprotein A-I (ApoAI) là protein gắn với lipid, vận chuyển các phân tử lipid từ ruột đến gan. ApoA-I là thành phần chính của các lipoprotein có tỷ trọng lớn trong hệ tuần hoàn, đóng một vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa và loại cholesterol ra khỏi tế bào [7, 28]. Apo A-IV thực hiện nhiệm vụ chủ yếu trong việc hấp thụ lipid của ruột [17]. Apo E điều khiển việc vận chuyển, hấp thụ cholesterol và lipid bằng cách tương tác ái lực cao với các thụ thể khác nhau trong tế bào [8]. Vì vậy, nồng độ ApoA-I, Apo A-IV và Apo E thay đổi trong huyết thanh cũng có thể là nguyên nhân dẫn đến tình trạng mỡ máu cao-là một trong những yếu tố dẫn đến bệnh tim mạch. Haptoglobin (Hp) là một protein có cấu trúc tetramer gồm hai chuỗi alpha và hai chuỗi beta được biểu hiện trong gan và tiết vào máu. Hp là một chất chống oxy hóa dựa vào khả năng liên kết với hemoglobin để cản trở sự phá hủy các mô bị oxy hóa (được tạo ra do các hemoglobin tự do) [19]. Trong khi đó, bệnh ĐTĐ thường đi kèm với sự tăng lên của gốc tự do hoặc sai hỏng khả chống oxy hóa và các biến chứng chính của bệnh ĐTĐ như bệnh giác mạc hay chứng xơ vữa động mạch thường liên quan đến stress oxy hóa [3]. Ở bệnh ĐTĐ, stress oxy hóa cùng tồn tại với việc giảm khả năng chống oxy hóa, tăng quá trình glycosyl hóa của protein, khử hoạt tính của các enzyme và oxy hóa lipid [27]. Vì vậy, sự thay đổi mức độ biểu hiện của haptoglobin trong huyết thanh có thể liên quan đến bệnh ĐTĐ. Fibrinogen là một glycoprotein được tổng hợp ở gan và đóng vai trò quan trọng trong quá trình đông máu. Fibrinogen bị phân cắt bởi thrombin thành các peptide fibrin trong quá trình đông máu bình thường. Từ lâu, fibrinogen đã được quan tâm nghiên cứu như là chỉ thị cho bệnh tim mạch bởi vì nó phản ánh sự hình thành thrombin tăng và do đó tăng khả năng bị tắc nghẽn mạch máu.Các nhà nghiên cứu nghi ngờ Nguyen Thi Minh Phuong et al. 217 rằng fibrinogen có liên quan đến tỷ lệ vượt trội của bệnh tim mạch ở bệnh nhân ĐTĐT2 [9]. Trước đó, Harkut et al. (2004) [11] cũng đã chỉ ra mối quan hệ của fibrinogen với bệnh ĐTĐT2 có biến chứng đau thắt ngực không ổn định Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy mức độ biểu hiện của fibrinogen tăng lên rõ rệt trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Điều này càng khẳng định rằng có thể sử dụng fibrinogen như là một chỉ thị sinh học cho bệnh ĐTĐT2 và tim mạch để nghiên cứu sự phát sinh và phát triển của bệnh. Bên cạnh đó, antithrombin là một glycoprotein nhỏ, đóng vai trò quan trọng việc điều khiển sự đông máu [4, 30]. Trong đó, antithrombin III trong huyết thanh được xem là chất ức chế thrombin. Vì vậy nồng độ protein này giảm trong huyết thanh có thể dẫn đến sự tăng nồng độ thrombin do đó làm tăng khả năng tắc nghẽn mạch máu. Angiotensinogen được sản xuất trong gan và tiết vào huyết thanh. Mức độ giải phóng của angiotensinogen có liên quan đến stress oxi hóa, chứng viêm nhiễm và sự phá hủy mô ở các bệnh nhân ĐTĐT2 [12, 15]. Ngoài ra, cũng đã có những nghiên cứu bước đầu cho thấy mức độ liên quan của transthyretin [13], alpha-1-antitrypsin [22] và zinc alpha-2-glycoprotein [10] với bệnh ĐTĐT2 và bệnh tim mạch. Nghiên cứu của chúng tôi cũng đưa thêm những dẫn liệu mới về sự thay đổi mức độ biểu hiện của 3 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC ở Việt Nam. KẾT LUẬN Bằng phương pháp biến tính nhiệt kết hợp với điện di hai chiều và khối phổ đã phát hiện 13 protein có mức độ biểu hiện thay đổi trong huyết thanh bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Trong đó, 5 protein là chuỗi fibrinogen alpha, chuỗi fibrinogen gama, haptoglobin, chuỗi haptoglobin alpha 1, zinc alpha 2 glycoprotein có mức độ biểu hiện tăng và 6 protein là alpha 1 antitripsin, angiotensinogen, antithrombin III, apolipoprotein A-I, apolipoprotein E, transthyretin có mức độ biểu hiện giảm ở mẫu bệnh ĐTĐT2_MVC. Đáng chú ý, 2 protein là apolipoprotein A-IV và chuỗi haptoglobin alpha 2 có mức độ biểu hiện lúc tăng lúc giảm trong huyết thanh của bệnh nhân ĐTĐT2_MVC. Lời cảm ơn: Công trình được Đề tài Độc lập cấp Nhà nước số 03/2011 PTNTĐ/HĐ-ĐTĐL, Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ và được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alarouj M., Bennakhi A., Alnesef Y., Sharifi M., Elkum N., 2013. Diabetes and associated cardiovascular risk factors in the State of Kuwait: the first national survey. Int J Clin Pract, 67(1): 89-96. 2. Alzaid A. A., 1996. Microalbuminuria in patients with NIDDM: an overview. Diabetes Care, 19(1): 79-89. 3. Baynes J. W., 1991. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes, 40: 405-412. 4. Tạ Văn Bình, Nguyễn Huy Cường, 2012. Phòng và điều trị đái tháo đường. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. Bjork I., Olson S. T., 1997. Antithrombin, A bloody important serpin. Adv Exp Med Biol, 425: 17-33. 6. Bradford M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248-254. 7. Chen X., Yang L., Zhai S. D., 2012. Risk of cardiovascular disease and all-cause mortality among diabetic patients prescribed rosiglitazone or pioglitazone: a meta- analysis of retrospective cohort studies. Chin Med J, 125(23): 4301-4306. 8. Clarke R., Emberson J. R., Parish S., Palmer A., Shipley M., Linksted P., Sherliker P., Clark S., Armitage J., Fletcher A., Collins R., 2007. Cholesterol Fractions and Apolipoproteins as Risk Factors for Heart Disease Mortality in Older Men. Arch Intern Med, 167(13): 1373-1378. 9. Ehara H., Yamamoto-Honda R., Kitazato H., Takahashi Y., Kawazu S., Akanuma Y., TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 212-219 218 Noda M., 2012. ApoE isoforms, treatment of diabetes and the risk of coronary heart disease. World J Diabetes, 3(3): 54-59. 10. Gordon D. O. L., 2010. Fibrinogen assays for cardiovascular risk assessment. Clinical Chemistry, 56: 5. 11. Hale L. P., Price D. T., Sanchez L. M., Demark-Wahnefried W., Madden J. F., 2001. Zinc alpha-2-glycoprotein is expressed by malignant prostatic epithelium and may serve as a potential serum marker for prostate cancer. Clin Cancer Res, 7(4): 846-853. 12. Harkut P. V., Sahashrabhojney V. S., Salkar R. G., 2004. Plasma fibrinogen as a marker of major adverse cardiac events in patiens of type 2 diabetes with unstable angina. International journal of diabetes in developing counties, 24: 69-74. 13. Hayden M. R., Whaley C. A., Chowdhury N., Sowers J. R., 2006. Role of angiotensin II in diabetic cardiovascular and renal disease. Southern Medical J, 13(2): 135- 140. 14. Henze A., Espe K. M., Wanner C., Krane V., Raila J., Hocher B., Schweigert F. J., Drechsler C., 2012. Transthyretin predicts cardiovascular outcome in hemodialysis patients with type 2 diabetes. Diabetes Care, 35(11): 2365-2372. 15. Hoàng văn Sơn, 2010. Xét nghiệm chẩn đoán suy tim và bệnh mạch vành. Tạp chí Y học Việt Nam, 372(2): 5-14. 16. Kalupahana N. S., Massiera F., Quignard- Boulange A., Ailhaud G., Voy B. H., Wasserman D. H., Moustaid-Moussa N., 2012. Overproduction of angiotensinogen from adipose tissue induces adipose inflammation, glucose intolerance, and insulin resistance. Obesity, 20(1): 48-56. 17. Kannel W. B., McGee D. L., 1979. Diabetes and cardiovascular disease: the Framingham study. JAMA, 241(19): 2035-2038. 18. Kollerits B., Krane V., Drechsler C., Lamina C., März W., Wanner C., Kronenberg F., 2012. Apolipoprotein A-IV concentrations and clinical outcomes in haemodialysis patients with type 2 diabetes mellitus-a post hoc analysis of the 4D Study. J Intern Med, 272(6): 592-600. 19. Le D. S., Kusama K., Yamamoto S., 2006. A community-based picture of type 2 diabetes mellitus in Vietnam. J Atheroscler Thromb, 13(1): 16-20. 20. Lim Y. K., Jenner A., Ali A. B.,Wang Y., Hsu S. I., Chong S. M., Baumman H., Halliwell B., Lim S. K., 2000. Haptoglobin reduces renal oxidative DNA and tissue damage during phenylhydrazine-induced hemolysis. Kidney International, 58: 1033-1044. 21. Liu L., Núñez A. E., 2010. Cardiometabolic syndrome and its association with education, smoking, diet, physical activity, and social support: findings from the Pennsylvania 2007 BRFSS Survey. J Clin Hypertens (Greenwich), 12(7): 556-564. 22. Martínez Pérez S. R., Armando P. D., Molina Guerra A. C., Martí Pallarés M., Martínez Martínez F., 2009. Relationship between cardiovascular risk factors and high blood pressure by community pharmacists in Spain. Pharm World Sci, 31(3): 406-412. 23. Mateos-Caceres P. J., Garcia-Mendez A., Lopez Farre A., Macaya C., Núñez A., Gómez J., Alonso-Orgaz S., Carrasco C., Burgos M. E., de Andrés R., Granizo J. J., Farré J., Rico L. A., 2004. Proteomic analysis of plasma from patients during an acute coronary syndrome. J Am Coll Cardiol, 44: 1578-1583. 24. Mazzola N., 2012. Review of current and emerging therapies in type 2 diabetes mellitus. Am J Manag Care, 18(1): 17-26. 25. Nguyen Duc H., Paule P., Pham Nguyen S., Michel R., Vu Dien B., Fourcade L., 2007. A study of cardiovascular risk factors associated with atherosclerosis of thoracic aorta detected by transesophageal echocardiography in Vietnam. Med Trop, 67(6): 573-578. 26. Nguyễn Thị Minh Phương, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi, 2008. Sự biến đổi của các protein bền nhiệt và glycosyl hóa ở bệnh nhân đái tháo đường type 2. Tạp chí Y học Việt Nam, 351(2): 91-102. Nguyen Thi Minh Phuong et al. 219 27. Rubenfire M., Brook R. D., 2013. HDL Cholesterol and Cardiovascular Outcomes: What Is the Evidence? Curr Cardiol Rep, 15(4): 349. 28. Sabu M. C., Kuttan R., 2009. Antidiabetic and antioxidant activity of Terminalia belerica. Roxb. Indian Journal of Experimental Biology, 47: 270-275. 29. Saito H., Lund-Katz S., Phillips M. C., 2004. Contributions of domain structure and lipid interaction to the functionality of exchangeable human apolipoproteins. Prog Lipid Res, 43(4): 350-380. 30. Van Boven H. H., Lane D. A., 1997. Antithrombin and its inherited deficiency states. Semin Hematol, 34(3): 188-204. ANALYSIS OF THE EXPRESSION LEVEL OF THERMOSTABLE PROTEINS IN PLASMA OF DIABETIC CARDIOVASCULAR PATIENTS Nguyen Thi Minh Phuong1, Tran Thai Thuong1, Nguyen Bich Nhi1, Do Doan Loi2, Dang Minh Hai2, Phan Van Chi1* 1Institute of Biotechnology, VAST 2Vietnam National Heart Institute, Bach Mai hospital SUMMARY Cardiovascular disease is a major complication and the leading cause of early death among people with type 2 diabetes mellitus (T2DM). People with T2DM often have abnormal cholesterol level, high blood pressure, obesity and lack of physical activity that contributes to risk for developing cardiovascular disease. Diabetic cardiovascular disease can damage the structure and function of the heart and it can lead to heart failure. Therefore, research on diabetic cardiovascular disease is very important to achieve decreased mortality for T2DM patients and prolong their life. In this study, the thermostable fractionation method was used to remove highly abundant proteins in plasma of diabetic cardiovascular patients. The thermostable proteins were then separated by using 2DE. The 2DE gel images were analyzed by using PDQuest v7.1 software. The differentially expressed protein spots between disease and control samples were identified by nanoLC-MS/MS. Among the identified proteins, thirteen were up/down-regulated in disease samples. In which, five proteins (Fibrinogen alpha chain, Fibrinogen gama chain, Haptoglobin beta chain, Haptoglobin alpha 1 chain, Zinc alpha 2 glycoprotein) were up-regulated and six proteins (Alpha 1 antitrypsin, Angiotensinogen, Antithrombin III, Apolipoprotein A-I, Apolipoprotein E, Transthyretin) were down- regulated in plasma of diabetic cardiovascular patients. Meanwhile haptoglobin alpha 2 chain and apolipoprotein A-IV showed quite different expression from case to case. Our results suggest that these proteins might be related to the generation and progression of diabetes and heart disease. Keywords: 2DE, cardiovascular, diabetes type 2 mellitus, nanoLC-MS/MS, plasma, thermostable protein. Ngày nhận bài: 12-2-2013