Phân tích dữ lượng chất kháng sinh trong thực phẩm

p các acid amin vòng có đường rẽ nhánh sinh tổng hợp chloramphenicol tại vị trí acid shikimic. COOH COOH OH O C CH2 CH2 H2N-CH NH2 COOH HC-OH H2N-CH NH2 COOH COOH CHCl2 HC-OH NH2 O=C HN CH CH2OH CHCl2 HC-OH NH2 O=C HN CH CH2OH CHCl2 HC-OH NO2 O=C HN CH Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic Lên men và tinh chế Chlorampenicol Công nghệ lên men sản xuất Chloramphenicol được hoàn thiện chủ yếu cho đến thời kì đầu thế kỷ XX. Từ khi công nghệ tổng hợp hóa học xuất hiện, với hiệu quả kinh tế cao hơn, đã dần thay thế hoàn toàn công nghệ lên men. Trong vài năm gần đây, việc áp dụng thành tựu và khoa học công nghệ mới đã mở ra triển vọng hoàn thiện công nghệ lên men sản xuất chloramphenicol với hiệu quả kinh tế có khả năng cạnh tranh được với phương pháp tổng hợp hóa học. Để lên men chloramphenicol người ta thường sử dụng các chủng có hoạt tính cao thuộc loài S.Venezuelae. Nguồn dinh dưỡng carbon có thể sử dụng là glucose, lactose, maltose và glycerine. Trong đó ưu thế hơn cả là glycerine. Nguồn dinh dưỡng nitơ tốt nhất là tryptone, amoniac, asparagin, glutamine. Cảm ứng sụ phát triển sinh khối, nhưng không cải thiện hiệu quả tích tụ kháng sinh. Trong khi bổ sung phanlalnine, locine hay izolocine xạ khuẩn tích tụ chậm nhưng cải thiện dược lượng kháng sinh tích tụ. Trong việc sản xuất, với nguồn nitơ người ta thường sử dụng nguyên liệu thay thế rẻ tiền hơn như: dạ dày lợn, nấm men thủy phân, dịch nấm men đồng thời cung cấp thêm chất khoáng. Giống xạ khuẩn được nuôi hoạt hóa thu bào tử, rồi cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác và nuôi ở 250C trong vòng 72h, tiếp theo cấy chuyền sang fermentor dung tích lơn hơn đến khi đủ giống để sản xuất. Quá trình sinh tổng hợp chloramphenicol xảy ra gần như đồng thời với sự phát triển sinh khối và phần lớn lượng kháng sinh được sinh tổng hợp và tích tụ trong pha cân bằng. Với các chủng hoạt lực cao, nồng độ chloramphenicol trong dung dịch thường đạt khoảng 130 – 150 mg/l sau khoảng 3 ngày lên men. Nồng độ chloramphenicol được định lượng bằng phương pháp sinh hoạc (sử dụng sarcina lute), phương pháp khử vitamin hóa, phương pháp đo phổ hấp phụ cục đại ở 278nm, phương pháp sắc ký khí và hiệu quả nhất là phương pháp HPLC. Kết thúc quá trình, dịch lên men được acid hóa nhẹ xuống pH = 4.0, lọc tách sinh khối, rồi điều chỉnh pH kiềm nhẹ (pH = 8.5 – 9.0) để trích ly sang ethylacetat hay amin acetate. Sau khi phân ly, dịch trích ly được cô chân khong loại dung môi rồi hòa tan lại bằng dầu lửa. Dung dịch này được rửa tiếp bằng dung dịch acid acetic, dung dịch natri bicacbonat loãng rửa nước và sau khi phaanly pha sẽ được cô chân không loại dầu lửa. Sau khi rửa phần không bay hơi còn lại (bằng ete dầu lửa để loại lipid) người ta thu được bột chloramphenicol thô. Bột kháng sinh thô này được hòa tan lại trong dung môi hữu cơ để xử lý tẩy màu qua cột than hoạt tính hay cột nhôm trong nước nóng, tẩy màu lại qua than hoạt tính, lộc, cô chân không rồi làm lạnh xuống nhiệt độ thấp để kết tinh thu chloramphenicol dạng tinh thể. Để đạt độ tinh sạch cao hơn, có thể hòa tan và kết tinh lại trong ethylene dicloride hoặc trong dung môi hỗn hợp ethel – ethel dầu lửa. Penicillin [13] a. Lịch sử  Penicilin được tìm ra nǎm 1928 và được sử dụng trong lâm sàng lần đầu tiên vào nǎm 1941. Nǎm 1941, penicilin G là kháng sinh có hiệu quả cao, thậm chí chống được hầu hết các chủng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên, đến nǎm 1947, phần lớn các các vi khuẩn phân lập được trong bệnh viện đều biểu hiện tính kháng penicilin. Trong một nỗ lực nhằm vào vấn đề này, các penicilin "bán tổng hợp" đã được triển khai. Methicilin, một penicilin ổn định beta-lactamase, được đưa ra thị trường nǎm 1959. ít lâu sau, nafcilin và oxacilin cũng được đưa ra thị trường. Nǎm 1961, ampicilin có hiệu quả cao chống lại  E.coli,  H.influenzae  và  N.gonorrhea. Ngày nay, một số đáng kể E.coli và H.influenzae đả kháng ampicilin, và ampicilin không còn là liệu pháp hàng đầu chống lại N.gonorrhea nữa. Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Carbenicilin được cho phép sử dụng nǎm 1970 và là một penicillin bán tổng phổ rộng đầu tiên. Thuốc có hoạt tính cao chống lại các vi khuẩn gam âm ở ruột và Pseudomonas aeruginosa. Nhóm penicilin này còn được gọi là các penicilinkháng pseudomonas và được chia theo cấu trúc thành 2 nhóm: Nhóm carboxypennicillin (ticarcillinvà carbenicillin) và nhóm acylureidopenicillin(piperacillin và mezlocillin).Nhóm carboxypenicillin có tỷ lệ gây bất thường tiểu cầu và xuất huyết trên lâm sàng cao hơn nhóm acylureidopenicillin. b. Cơ chế hoạt động  Để đạt được hiệu quả, penicillin phải thấm qua màng tế bào và gắn với các protein gắn penicillin. Các protein gắn penicillin chịu trách nhiệm nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp của màng tế bào và có mặt trong hàng trǎm đến hàng nghìn phân tử trên một tế bào vi khuẩn. Các protein gắn penicillin rất khác nhau giữa các chủng vi khuẩn. Các kháng sinh beta – lactam cản trở việc tổng hợp màng tế bào qua trung gian PBP, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào. Sự ly giải diễn ra qua trung gian là các enzym tự ly giải thành tế bào vi khuẩn (ví dụ: các autolysin). Còn chưa rõ mối liên quan giữa các PBP và các autolysin, nhưng có lẽ kháng sinh beta – lactam gây cản trở bằng một chất ức chế autolysin. Cơ chế kháng Tính kháng với các penicillin có được phần lớn là nhờ sản sinh beta – lactam. Để khắc phục điều này, người ta đã tạo ra một số chất ức chế beta – lactam: acid clavulanic và sulbactam. Các hợp chất này cũng là các phân tử beta – lactam nhưng bản thân chúng ít hoặc không có hoạt tính kháng khuẩn. Chúng làm bất hoạt enzyme beta – lactam bằng cách gắn vào vị trí hoạt động của enzym. Trong quá trình đó, chúng bị phá huỷ; vì vậy, chúng còn được gọi là các ức chế "tự sát". Việc bổ sung chất ức chế, như: acid clavulanic hoặc sulbactam, sẽ tái lập hoạt tính của penicillin chống lại vi sinh vật sản sinh beta – lactamase. Tuy nhiên, các cơ chế khác với sản sinh beta – lactam có vẻ là trung gian tạo ra tính kháng của Staph.aureus kháng methicillin. Các đặc điểm phân biệt Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động của chúng. Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn kỵ khí. Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase. Ampicillin và amoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng penicillin thì không. Amoxicillin đã thay thế penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó. Methicillin, nafcillin, mezlocillin, và dicloxacillin là các chất giống hệt nhau ngoại trừ đường dùng của chúng. Chúng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng chúng được dành để điều trị nhiễm tụ cầu. Chúng không có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm. Carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin và piperacillin có hoạt tính rộng chống lại các vi khuẩn hiếu khí gam âm nhưng không có hiệu quả chống tụ cầu. Các penicillin phổ rộng được sử dụng chủ yếu trong điều trị nhiễm khuẩn nghi ngờ hoặc biết chắc là do vi khuẩn hiếu khí gram âm. Để chống lại Pseudomonas aeruginosa, chúng thường được phối hợp với một aminoglycosid. Trong số các penicillin phổ rộng hay các penicillin kháng pseudomonas, hiệu lực tương đối chống lại Pseudomonas là: Piperacillin > Mezlocillin = Ticarcillin > Carbenicillin. Trừ carbenicillin, các thuốc này được dùng ngoài đường tiêu hóa. Các phản ứng có hại Các phản ứng có hại của penicillin bao gồm những phản ứng có hại của tất cả các thuốc kháng sinh (như: nhờn thuốc, các phản ứng quá mẫn) cũng như một số phản ứng huyết học và thần kinh. Nhiều, nhưng không phải tất cả các penicillin có liên quan với giảm bạch cầu trung tính và giảm tiểu cầu, và các carboxypenicillin có thể gây rối loạn chức nǎng tiểu cầu. Khi dùng liều cao cho bệnh nhân rối loạn chức nǎng thận, penicillin có thể gây ra cơn co giật. Methicillin có liên quan với viêm thận kẽ. Được sử dụng đúng, các penicillin là những thuốc cực kỳ an toàn và hiệu quả. II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực phẩm 2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS [5]. 2.1.1 Giới thiệu Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC – MS, GC – MS/MS, LC – MS, LC – MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC – MS/MS. Để có cơ sở xem xét tính hữu dụng của các phép thử trên ELISA trong kiểm tra và chứng nhận chất lượng thực phẩm thuỷ sản, trong phạm vi báo cáo này, chúng tôi sẽ đưa ra những đánh giá về kết quả phân tích CAP trên ELISA. Nội dung của báo cáo sẽ xem xét đến hai vấn đề chính là tỉ lệ phát hiện dương giả trên ELISA; và độ tương đồng kết quả kiểm nghiệm giữa hai phương pháp phân tích trên ELISA và LC-MS/MS. Kết quả đánh giá dựa trên số liệu thống kê kết quả phân tích tại phòng kiểm nghiệm của NAFIQAVED 4 – Tp Hồ Chí Minh, từ ngày 1/1/2006 đến tháng 7/2007. 2.1.2 Đối tượng Đối tượng trong nghiên cứu này các loại thực phẩm thuỷ sản sau : Cá các loại (7255 mẫu) Tôm các loại (4253 mẫu) Cua, ghẹ (606 mẫu) Nhuyễn thể các loại (600 mẫu) Thủy sản tẩm bột (302 mẫu) Thủy sản khô các loại (242 mẫu) Chả giò, há cảo (125 mẫu) Mắm hải sản các loại (35 mẫu) 2.1.3 Phương pháp phân tích a Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA. Qui trình thử nghiệm với ELISA: Qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Giới hạn phát hiện: 0,1ppb b Qui trình thử nghiệm LC – MS/MS sử dụng trong thực nghiệm Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được phân tích khẳng định trên LC – MS/MS theo qui trình tóm tắt như sau: Thiết bị Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-) Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS Qui trình chuẩn bị mẫu Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên LC – MS/MS Phân tích trên LC – MS/MS: Các thông số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dòng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (–) MRM : 321 à 152 321 à 194 321 à 256 326 à 157 Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP – d5 được sử dụng để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích. Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh – Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2). 2.1.4 Phân tích – nhận xét Tỷ lệ dương tính giả trên ELISA Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng dưới. TT Loại thuỷ sản Số mẫu phân tích Dương tính giả (Không phát hiện với LC_MS/MS Dương tính thật (phát hiện > 0,5ppb với LC-MS/MS) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Cá các loại 7255 42 0.6 76 1,0 Tôm các loại 4253 19 0.5 63 1,5 Cua, ghẹ 606 8 1.5 62 10,2 Nhuyễn thể các loại 600 3 0.5 3 0,5 Thủy sản tẩm bột 302 36 12.2 8 2,6 Thủy sản khô các loại 242 33 18.2 61 25,2 Chả giò, há cảo 125 13 13.8 31 24,8 Mắm hải sản các loại 35 13 43.3 5 14,3 Tổng số: 13.418 167 1.3 309 2,3 Bảng 2.1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS Trong tổng số 13.418 mẫu thuỷ sản các loại đã qua phân tích sàng lọc bằng ELISA thì có 167 mẫu là dương tính giả, chiếm 1.3% tổng số mẫu đã phân tích. Điều này cho thấy, ELISA là một công cụ hữu hiệu cho việc sàng lọc các mẫu thủy sản đối với chỉ tiêu CAP. Như thống kê trong bảng 2, tỷ lệ dương tính giả khác nhau giữa các đối tượng mẫu thủy sản và theo thư tự sau: Tôm = Nhuyễn thể < Cá < Cua, Ghẹ < Chả giò, há cảo < Thuỷ sản tẩm bột < Thuỷ sản khô < Mắm thuỷ sàn Tỉ lệ dương giả đối với nhóm sản phẩm thủy sản tẩm bột (tôm, cá, mực tẩm bột), chả giò - há cảo là khá cao (12,2% và 13,8%) so với các đối tượng mẫu thủy sản cùng loại ở dạng chưa phối chế (tôm, cá, mực, ghẹ) (< 1,5%). Điều này cho thấy lượng tinh bột có trong mẫu phân tích có ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác của xét nghiệm ELISA. Hiện tượng dương tính giả là do phản ứng không đặc hiệu (non-specific reaction) của kháng thể (Anti-CAP antibody) với các chất nền (matrices) trong dịch chiết. Trong trường hợp này có thể rút ra nhận xét rằng tinh bột có trong mẫu là tác nhân chính dẫn đến phản ứng không đặc hiệu và gây ra dương tính giả. Tỉ lệ dương giả đối với thuỷ sản khô cũng khá cao (18,2%), đặc biệt thuờng có hiện tượng tạo nhũ trong giai đoạn làm sạch dịch chiết bằng hexan. Hiện tượng này có lẽ do ảnh hưởng của các chất phụ gia thêm vào để bảo quản hàng thuỷ sản khô. Các sản phẩm dạng mắm gây ra một tỷ lệ dương tính giả rất cao (43,3%), cho thấy cần phải có qui trình xử lý mẫu chuyên biệt cho các đối tượng này. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả Kết quả thực nghiệm về tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng Elisa và tỉ lệ dương tính giả được tổng hợp tại bảng 2.2. Lọai thủy sản Số mẫu phân tích Giá trị hàm lượng CAP xác định bằng ELISA ≥0.3 ppb ≥0.5 ≥1 ppb Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Cá các loại 7255 15 0.21 7 0.10 2 0.03 Tôm các loại 4253 7 0.17 1 0.02 1 0.02 Cua, ghẹ 606 3 0.55 2 0.37 1 0.18 Nhuyễn thể 600 - 0.00 - 0.00 - 0.00 Thủy sản tẩm bột 302 4 1.36 1 0.34 0 0.00 Thủy sản khô các loại 242 13 7.18 11 6.08 8 4.42 Chả giò, há cảo 125 4 4.26 3 3.19 1 1.06 Mắm hải sản các loại 35 4 13.33 1 3.33 0 0.00 Bảng 2.2. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả Với hàm lượng CAP có giá trị từ 0.3ppb trở lên (tương đương mức qui định của EU), thì tỉ lệ dương giả giảm mạnh, đặc biệt thuỷ sản tẩm bột (từ 18,2% còn 1,36%) và không có dương giả đối với nhuyễn thể. Với những kết quả nêu trên có thể đưa ra nhận định rằng hiện tượng phát hiện dương tính giả trên xét nghiệm ELISA là phổ biến đối với tất cả các loại mẫu thủy sản. Tuy nhiên mức độ ảnh hưởng của nền mẫu tới kết quả của phép thử ELISA là khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau. Ảnh hưởng của nền mẫu đối với đối tượng thủy sản khô, các loại thực phẩm dạng tẩm bột, phối chế (chả giò, há cảo …) là rất đáng kể. Tuy nhiên ở hàm lượng phát hiện là >0,3ppb tỉ lệ này là chấp nhận được cho tất cả các loại nền mẫu khác nhau (ngoài trừ mắm). Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin [7] 2.2.1 Đặc tính chung Streptomycin là 1 bazơ hữu cơ chiết ra từ nấm streptomyces globisporus streptomyxini hay từ các loài sinh vật khác hoặc có được bằng các phương pháp tổng hợp. Các streptomycin đều tạo muối với acid vô cơ. Các loại muối của kháng sinh thường là sunfat, clohydrat, photphat và có cả phức chất canxiclorua của streptomycin clohydrat. Các muối này tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và Ethel. 2.2.2 Nguyên tắc Thuỷ phân streptomycin bằng kiềm cho maltol là Methyl – 3 – hydroxyl – 7 pyron. Sự tạo thành maltol xảy ra hoàn toàn định lượng cho phép xác định được streptomycin Maltol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thủy phân bằng cách dùng clorofooc để chiết khỏi dung dịch mẫu trong môi trường axit, sau đó giải chiết maltol bằng dung dịch kiềm trong nước. Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía đặc trưng và đo mật độ quang của phức màu này ở sóng 525 nm để xác định streptomycin. Nồng độ của streptomycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn. 2.2.3 Lấy mẫu Theo TCVN 4833 – 89 (ST SEV 2433 – 80) 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất a. Dụng cụ, thiết bị Hình 2.2 Máy trắc quang UV-VIS Hình 2.3: Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm Hình 2.4: Máy xay sinh tố Hình 2.5: Máy ly tâm Hình 2.6: Bình định mức các loại Hình 2.7: Pipet các loại Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml Và một số dụng cụ khác b. Hoá chất Dùng hoá chất có độ tinh khiết phân tích - Axit clohydric, dung dịch 1M - Natrihydroxyt, dung dịch 1N - Thuốc thử: phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% trong axit sunfuric 1N - Clorofooc - Dung dịch gốc tiêu chuẩn streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml - Nước cất 2 lần 2.2.5 Tiến hành thử Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng a = 20g cho vào máy xay sinh tố. Thêm 10 ml nước cất vào và cho máy chạy trong 5 phút. Cho 5 ml axit clohydric 1M vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất. Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút. Để nguội, ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch nước trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natrihydroxyt 1N và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit và nước cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước. Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bước sóng 525 nm. Pha dãy chuẩn Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunphat nồng độ 1 mg/ml, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 – 0,5 – 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5 μg/ml trong các bình định mức có thể tích 20 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho 2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2%, định mức bằng nước cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo. Mẫu trắng Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho có cùng thể tích Tiến hành thử + Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút); + Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm. Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần; + Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D – C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ; + Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được. Tính kết quả Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau: Co = (Cx .V) / a Tính bằng g/g Trong đó: a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g) V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml) Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn Phụ lục: Cách pha dãy chuẩn Sử dụng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin có nồng độ 1mg/ml (gọi là dung dịch A) Pha dung dịch streptomycin nồng độ 10 μg/ml: lấy 1ml dung dịch A, pha loãng và định m bằng nước cất đến 100 ml (dung dịch này gọi là B) Pha dãy dung dịch chuẩn: Lấy 6 bình định mức có thể tích 20 ml cho lần lượt vào các bìnhsố 1 đến số 6 một lượng như sau: 0,2 – 1,0 – 2,0 – 3,0 – 4,0 – 5,0 ml dung dịch B. Thêm vào mbình 2 ml natrihydroxyt 1N và lượng nước đến 10 ml. Đun cách thuỷ cho sôi để thủy phtrong 10 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2 trong axit, lắc kỹ và định mức bằng nước cất đến 20 ml. Như vậy, ta được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ là : 0,1 – 0,5 – 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5 μg/ml. 2.3 Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA [15] Quinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có khả năng khuyếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó được sử dụng phổ biến và hiệu quả trong cả nhân y và thú y (Appelbaum và Hunter, 2000; Crumplin và Smith, 1976; Emmerson và Jones, 2003). Tuy nhiên việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trường và sức khoẻ cộng đồng (WHO, 1998). Những năm gần đây, ngành thuỷ sản Việt Nam đã vượt qua những rào cản an toàn thực phẩm góp phần đưa sản phẩm thuỷ sản thâm nhập vào 106 nước, trong đó có những thị trường khó tính như châu Âu, Mỹ, Nhật Bản. Giá trị kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản trung bình hàng năm giai đoạn 2001-2007 tăng trên 10%. Năm 2007 đạt trên 3,76 tỷ USD (tăng 12% so với năm 2006) trong đó tôm đông lạnh vẫn là mặt hàng xuất khẩu chiến lược quan trọng với khối lượng đạt 145 nghìn tấn (năm 2006 là 143,6 nghìn tấn) với giá trị đạt 1,37 tỷ USD, tăng 2,65% so với năm 2006 (Thông tin khoa học công nghệ và kinh tế Thuỷ sản,số 1 năm 2008). Nhưng thực tế số lô hàng thuỷ sản bị các nước nhập khẩu phát hiện có dư lượng kháng sinh vẫn còn cao (NAFIQAVED, 2007). Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế của các doanh nghiệp mà quan trọng là còn ảnh hưởng đến đến uy tín chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam (Bộ Thuỷ sản, 2006). Trước tình hình đó, Bộ Thuỷ sản (nay là Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã ban hành một số qui định và nhiều chỉ thị để hướng dẫn kiểm soát dư lượng, trong đó Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005 và số 26/2005/QĐ-BTS ngày 18/8/2005 liên quan đến danh mục hoá chất và kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thuỷ sản. Thế nhưng, kết quả điều tra thực tế cho thấy việc sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm vẫn tiếp diễn và phổ biến nhất là nhóm quinolone (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 2006; Phạm Kim Đăng và cộng sự, 2007). Hơn nữa, để phát triển và tăng trưởng bền vững, bên cạnh các thị trường xuất khẩu, ngành thuỷ sản đã chú ý đến tiềm năng thị trường nội địa. Nhưng việc kiểm soát dư lượng các mặt hàng nội địa chưađược quan tâm đúng mức gây ảnh hưởng đến tâm lý và sức khoẻ người tiêu dùng. Để góp phần bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường và tăng cường kiểm soát dư lượng kháng sinh, việc đánh giá khả năng thích ứng các phương pháp phân tích, đặc biệt các phương pháp đặc hiệu như ELISA là rất cần thiết. Mục đích của nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp ELISA trong phân tích tồn dư quinolone trong tôm tại một số tỉnh miền Bắc. 2.3.1 Nguyên liệu Mẫu trắng: là mẫu tôm không chứa nhóm kháng sinh quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối (LC-MS/MS) tại phòng thí nghiệm phân tích thực phẩm - Bộ môn Khoa học thực phẩm- Khoa Thú y - Đại học Liège, Vương quốc Bỉ. Dung dịch kháng sinh chuẩn: Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự có mặt của NH4OH 2M. Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất). Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie - CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp. Mẫu kiểm tra thử nghiệm: Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào 6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và 12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An. Mỗi địa phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau. Riêng Hà Nội, ngoài chợ mẫu còn được lấy ở ba siêu thị. Các mẫu đều có nguồn gốc từ các đầm nuôi ở các địa phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội được xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Nam Định. Mẫu sau khi lấy được bảo quản lạnh chuyển về phòng thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ. Sau khi nghiền đồng nhất bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C. 2.3.2 Phương pháp Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 10 bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít được lặp lại 2 lần. Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6 dung dịch chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml. Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng của kít trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, các tham số liên quan đến khả năng phát hiện của phương pháp được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu (Quyết định 2002/657/CE). Bên cạnh đó, khả năng phát hiện và khả năng định lượng của kít tại các nồng độ tương ứng với giá trị MRL (Maximum Residue Limit - giới hạn nồng độ tối đa cho phép theo Quyết định số 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Âu) cũng được phân tích đánh giá. Mỗi kháng sinh thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm tính) và 20 mẫu củng cố các quinolone đại diện ở nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb) (được xem như mẫu thật sự dương tính). Các tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công thức sau: Độ xác thực (%) = X %100 Độ nhạy (%) = X %100 Độ đặc hiệu (%) = X %100 Trong đó : N là tổng số mẫu phân tích = N+ + N- N+ là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố) N- là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng) PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu Mỗi kít phân tích 20 mẫu đã bao gồm 2 mẫu trắng và 2 mẫu củng cố của mỗi kháng sinh đại diện. Mẫu được chuẩn bị và tách chiết theo hướng dẫn kèm theo trong kít. Sau khi đọc giá trị OD (mật độ quang) của các giếng trên khay ở bước sóng 450 nm, kết quả được tính toán nhờ vào công thức thiết lập trên Microsoft Office Excel 2003. Để khẳng định khả năng ứng dụng của kít để phát hiện quinolone và bước đầu đánh giá tình hình dư lượng nhóm quinolone trong tôm, được phân tích bằng phương pháp ELISA và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) để khẳng định lại nồng độ và định danh chính xác các quinolone. 2.3.3 Kết quả Tính ổn định và khả năng phát hiện Kết quả phân tích đường chuẩn Dung dịch chuẩn Mật độ quang (OD) Kí hiệu Nồng độ (ng/ml) x ± SD CV (%) NSB* 0 0 0,071 ± 0,006 6,88 C0 0 1,226 ± 0,037 3.05 C1 1 0,307 ± 0,008 2.57 C2 0.5 0,485 ± 0,016 3.23 C3 0.3 0,642 ± 0,021 3.24 C4 0.2 0,801 ± 0,022 2.72 C5 0.1 0,923 ± 0,022 2.44 C6 0.05 1,043 ± 0,028 2.65 NSB = Non Specific Binding: sử dụng dung dịch đệm photphat Bảng 2.3 Kết quả phân tích kiểm tra đường chuẩn Kết quả cho thấy mật độ quang của các giếng chứa các nồng độ thiết lập đường chuẩn của 10 bộ kít rất ổn định (hệ số biến động từ 2,44% đến 6,88%). Đặc biệt, giữa ln[nồng độ] của các dung dịch xây dựng đường chuẩn và đáp ứng của kít [logarit ((B -NS)/(B0 - NS))] có quan hệ tuyến tính chặt chẽ, tương quan nghịch, với giá trị trung bình R2 là 0,9915 (Bảng 1, Đồ thị 1). Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 1 ng/ml và tính ổn định của kít là tương đối cao (Đồ thị 1). Hay nói cách khác, về lý thuyết kít có thể xác định chính xác nồng độ kháng nguyên (trong trường hợp này là sarafloxacin) trong các mẫu sau khi tách chiết ở nồng độ trong khoảng 0,05 đến 1 ng/ml. Đồ thị 2.4 Đường chuẩn (B và B0 tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau và tại nồng độ bằng 0. NS mật độ quang của dung dịch không đặc hiệu) 2.3.4 Khả năng phát hiện của kít Đối với mẫu trắng ở 20 lần lặp lại đều không phát hiện quinolone. Còn các mẫu khác đều có thể phát hiện các kháng sinh được củng cố (Bảng 2). Tuy nhiên, dù được củng cố cùng một nồng độ nhưng kết quả khác nhau giữa các mẫu củng cố và khác so với nồng độ thực trong mẫu (nồng độ củng cố). Ở cả hai nồng độ củng cố (0,7 ppb và ở nồng độ bằng MRL), kít rất nhạy và phát hiện tốt nhất đối với sarafloxacine và enrofloxacine, tiếp đó là norfloxacine, ciproflorxacine và phát hiện kém nhất đối với flumequin. Kết quả này là do khả năng phát hiện kháng thể đặc hiệu của kít. Các kháng sinh có cấu trúc càng giống với kháng nguyên sử dụng để kích thích sản xuất kháng thể thì khả năng phát hiện của kít càng cao. Theo thông tin ghi trong kít thì kháng nguyên sử dụng để sản xuất kháng thể là dẫn xuất của sarafloxacine, do đó kết quả này hoàn toàn phù hợp. Như vậy, có thể kết luận kít có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm quinolone được thử ở nồng độ 0,7 ppb. Cũng từ kết quả này, theo chúng tôi, khi áp dụng kít này vào thực tế phân tích mẫu kiểm soát dư lượng để có kết luận chính xác về nồng độ dư lượng và đặc biệt định danh chính xác hợp chất quinolone, cần áp dụng các phương pháp khẳng định như phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Bảng 2.5. Khả năng phát hiện của phương pháp ở nồng độ giới hạn phát hiện và giới hạn nồng độ tối đa cho phép theo Quyết định 2377/90 CE của Uỷ ban Châu Âu đối với một số quinolone 2.3.5 Độ đặc hiệu, tính chọn lọc và độ xác thực của phương pháp Kết quả ở bảng 3 cho thấy phương pháp có thể phát hiện tất cả 5 quinolone được thử ở nồng độ 0,7 ppb với độ xác thực, độ đặc hiệu và độ nhạy có thể chấp nhận được. Độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp đối với sarafloxacin và enrofloxacin là 100%. Đối với norfloxacin, phương pháp có thể phát hiện với độ xác thực và độ nhạy tương ứng là 98,75 % và 97,5%. Còn flumequin và ciprofloxacin được phát hiện với độ xác thực, độ nhạy thấp nhất và tương ứng là 97,5 % và 95 %. Bảng 2.6. Các tham số độ mạnh của phương pháp đối với các quinolone được thử tại ngưỡng phát hiện tối thiểu Đặc biệt, phương pháp có khả năng phát hiện các quinolone trong tôm với độ đặc hiệu là 100%. Hay nói cách khác nếu mẫu thực sự âm tính thì 100% kết quả phân tích sẽ là âm tính. Như vậy, phương pháp có thể phát hiện tất cả các quinolone được thử ở nồng độ 0,7 ppb với xác suất saisố bé hơn hoặc bằng 5%. Đối chiếu với quyết định số 2002/657/CE (CE, 2002) qui định về việcchuẩn hoá phương pháp phân tích tồn dư thực phẩm thì kết quả này hoàn toàn đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng. 2.3.6 Kết luận Kít ELISA của hãng CER Vương quốc Bỉ có khả năng phát hiện tốt các kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong tôm ở nồng độ lớn hơn hoặc bằng 0,7 ppb. Khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiêm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002). Tuy nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone và xác định nồng độ chính xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp khẳng định lý hoá khác. 2.4 Phương pháp kiểm tra nhanh Chloramphenicol [6] 2.4.1 Mục đích Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol là một dụng cụ kiểm tra nhanh, chỉ 1 bước duy nhất để định lượng Chloramphenicol có trong thực phẩm nói chung, bao gồm thủy hải sản, mật ong… Tổng thời gian thực hiện xét nghiệm bằng dụng cụ này chỉ vào khoảng 25 phút. 2.4.2 Tóm tắt Chloramphenicol là một loại kháng sinh phổ rộng, nó được sử dụng thường xuyên cho quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc động vật nhờ có các đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời của nó. Tuy nhiên, trong cơ thể người nó lại có thể gây ra những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến dạng với 1 hàm lượng nào đó chưa được xác định rõ. Điều này dẫn đến việc Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng trong việc điều trị cho súc vật dùng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm. Dư lượng Chloramphenicol trước đây thường được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunologically) hoặc sắc ký khí (gas chromatographically). Tuy nhiên, xét nghiệm miễn dịch men (enzyme immunoassay) lại cho thấy các ưu điểm rõ rệt so với các phương pháp truyền thống. Không cần dùng đến các nguyên liệu phóng xạ, cũng như thời gian thực hiện xét nghiệm giảm đáng kể so với khi thực hiện phương pháp sắc ký khí. Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol là một dụng cụ kiểm tra nhanh để định lượng Chloramphenicol có trong mẫu thử với độ nhạy tùy theo yêu cầu kiểm nghiệm của khách hàng. Ưu điểm chính của dụng cụ này là kết quả có thể được quan sát bằng mắt thường và tất cả các thuốc thử đều đã bao gồm trong dụng cụ. 2.4.3 Nguyên lí Nguyên tắc của xét nghiệm này là phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Xét nghiệm nhanh bằng 1 bước duy nhất này là một xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh, trong đó chất dò (detector reagent) bao gồm những mảnh vàng keo (colloidal gold) được tráng phủ bởi các kháng thể kháng Chloramphenicol tinh khiết ái lực. Trong khi đó chất phát hiện (capture reagent) là một phức hợp Chloramphenicol-protein được đính trên màng của dụng cụ xét nghiệm. Trong quá trình xét nghiệm, mẫu thử đi qua màng này. Càng có nhiều chất phân tích trong mẫu thử, chúng sẽ càng cạnh tranh mạnh hơn với Chloramphenicol đính trên màng để gắn kết với các kháng thể của chất dò (có số lượng giới hạn). Chloramphenicol, nếu tồn tại trong mẫu thử với hàm lượng trên 0,1 ppb sẽ ngăn chặn sự gắn kết của chất dò với Chloramphenicol đính trên màng, cho ra kết quả dương tính. 2.4.4 Lưu ý Không được sử dụng quá hạn ghi trên bao bì. Dụng cụ xét nghiệm nên được giữ kín trong bao bì bảo vệ trước khi dùng. Sử dụng dụng cụ càng sớm càng tốt nhưng không quá 1 giờ sau khi bỏ bao bì bảo vệ, nhất là khi nhiệt độ trong phòng cao hơn 30oC và độ ẩm cao. Không đụng vào màng trắng ở giữa dụng cụ xét nghiệm. Không dùng ethyl acetate trong phòng không có thông hơi. 2.4.5 Bảo quản và độ ổn định Bảo quản ở nhiệt độ phòng (4-300 C) và trong bao bì bảo vệ. Dụng cụ ổn định trong thời hạn có ghi trên bao bì. KHÔNG ĐƯỢC ĐỂ ĐÔNG LẠNH hoặc dùng quá thời hạn sử dụng. 2.4.6 Thiết bị Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol (40 chiếc). Chất hút ẩm (một miếng cho mỗi gói). Chất đệm PBST (một lọ cho mỗi bộ). Ống nhỏ giọt sử dụng một lần (một ống cho mỗi gói). Tờ hướng dẫn sử dụng. 2.4.7 Xử lí mẫu Mẫu thử nên để nơi mát, tránh ánh sáng trực tiếp. Làm đồng nhất và lấy một lượng hợp lý mẫu thử (vd: 50 g). Cân 5 g mẫu thử và bỏ vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 10 ml ethyl acetate và lắc trong vòng 5 – 10 phút. Ly tâm: 5 phút / 4000 rpm / nhiệt độ phòng (20 – 25°C / 68 – 77°F) trong phòng kiểm nghiệm, hoặc bằng giấy lọc nếu như kiểm tại cảng thu mua. Lấy 7 ml lớp ethyl acetate phía trên cho vào bình cô quay và làm bay hơi ethyl acetate ở 65oC bằng máy cô quay chân không, hoặc cho vào ống nghiệm và làm bay hơi ethyl acetate ở 65oC bằng khí Nitơ. Hoà tan chất cặn trong 0,3 ml dung dịch PBST, thêm 0,3 ml dung dịch n – hexane và trộn đều trong 1 phút. Chuyển dung dịch này vào một ống nghiệm và dùng ít nhất 100 μl lớp dung dịch ở dưới để đưa vào xét nghiệm. 2.4.8 Quy trình thực hiện Để dụng cụ xét nghiệm và mẫu thử ổn định ở nhiệt độ phòng trước khi xét nghiệm. Chuẩn bị mẫu thử . Lấy dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol ra khỏi bao bì bảo vệ. Hình 2.9: Quy trình thực hiện Giữ ống nhỏ giọt thẳng đứng và nhỏ 3 giọt đầy của dung dịch thử vào giếng thử (S) của dụng cụ, và bắt đầu tính thời gian. Lưu ý: tránh đưa bọt khí vào giếng thử (S) (Xem minh hoạ ở hình trên). Chờ cho đến khi những vạch màu đỏ hiện lên. Nên đọc kết quả trong vòng 3 đến 5 phút. Cần chú ý rằng màng thử của dụng cụ phải hoàn toàn sạch trước khi đọc kết quả. Không nên đánh giá kết quả sau hơn 5 phút. 2.4.9 Đọc kết quả Hình 2.10: Âm tính: Hai vạch Vạch thử (T) bằng hoặc đậm hơn vạch chuẩn (C), cũng là vạch tham chiếu (R). Kết quả này cho biết hàm lượng Chloramphenicol trong mẫu thử dưới 0,1 ppb. Hình 2.11: Dương tính: Hai vạch Vạch thử (T) nhạt hơn vạch chuẩn (C), hoặc không thấy vạch thử. Kết quả này cho biết hàm lượng Chloramphenicol trong mẫu thử trên 0,1 ppb. Hình 2.12: Kết quả sai: khi vạch chuẩn không xuất hiện. Kết quả này có thể do lượng mẫu thử không đủ hoặc quy trình kỹ thuật thực hiện sai. Xem lại quy trình và làm lại xét nghiệm với một dụng cụ mới. Nếu vẫn gặp trục trặc, ngừng ngay việc sử dụng dụng cụ thử và liên hệ với công ty phân phối. 2.4.10 Kiểm soát chất lượng Một phép kiểm tra chất lượng đã được đưa vào trong quá trình thử. Một vạch đỏ xuất hiện tại vùng chuẩn (C), cũng là vùng tham chiếu (R), xem như là một kết quả kiểm tra chất lượng tích hợp sẵn. Điều này cho biết lượng mẫu thử đủ và các kỹ thuật thao tác đúng. Các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng không kèm theo dụng cụ này. Tuy nhiên, chúng tôi khuyến cáo việc kiểm soát chất lượng dương tính và âm tính nên được thực hiện với tiêu chuẩn thực hành thí nghiệm tốt để chắc chắn quy trình thử được thực hiện đúng. 2.4.11 Hiệu suất Độ nhạy: Độ nhạy phân tích của dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol là 0,1 ppb. Độ nhạy đã được xác định bằng cách thử lặp đi lặp lại các mẫu thử chứa 0,1 ppb Chloramphenicol. Đặc trưng: Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol đặc trưng bởi việc phân tích Chloramphenicol với nồng độ 0,1 ppb hoặc lớn hơn. Việc thêm Thiamphenicol (100 ppb) và Florfenicol (3000 ppb) vào dịch chuẩn âm tính (dung dịch đệm PBST) và các mẫu thử dương tính (0,1 ppb Chloramphenicol) cho thấy không có phản ứng chéo. Không phản ứng chéo với với tetracycline, gentamicin hoặc ampicillin. Độ chính xác: Một thử nghiệm đa trung tâm đã được thực hiện tại Bình Thuận để so sánh kết quả xét nghiệm thực hiện bằng Dụng cụ phát hiện nhanh dư lượng Chloramphenicol với kết quả xét nghiệm thực hiện bằng phương pháp tương đối thông dụng trên thị trường là ELISA. Nghiên cứu thực hiện trên cùng 234 mẫu xét nghiệm: cả hai phương pháp xét nghiệm đều nhận dạng đúng 145 mẫu âm tính và 98 mẫu dương tính. Kết quả cho thấy 94.7% trùng hợp giữa hai phương pháp xét nghiệm. 2.5 Phương pháp định lượng Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [16] 2.5.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất sulfonamit (gồm: sulfadiazine, sulfathiazole, sulfamerazine, sulfamethazine, sufamethoxypiridazine, sulfacloropyridazine, sulfadoxine, sulfamethoxazoll, sulfadimethoxine và sulfachinoxaline) trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp nhỏ hơn 5 mg/kg. 2.5.2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm sulfonamit của Trung tâm nghiên cứu Nestle (Determination of Sulfonamide residues/Jean-Marc Diserens and Marie – Claude Savoy-Perroud/Quality and Safety Assurance Department/ Nestle' Research Center) 2.5.3 Nguyên tắc Các chất nhóm sulfonamite có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclorometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamine để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 2.5.4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử a. Thiết bị, dụng cụ Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID: 250 x 3 mm, kí hiệu 100 – 5 C18 AB, loại Nucleosil. Máy nghiền đồng thể, tốc độ 6000 – 30 000 vòng/phút (KCH-1000). Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20 – 100oC (GRANT Y14). Máy lắc, tốc độ 50 – 500 vòng/phút (IKA  KS 260 basic). Máy ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút (Sigma 4K15). Máy rung trộn mẫu (HWASHIN technology Co. 250VM). Bình khí Nito tinh khiết 99,999 %. Ống ly tâm thủy tinh dung tích: 15, 25 và 50 ml. Pasteur pipet với quả bóp cao su. Pipet định mức 5 và 10 ml. Bình định mức dung tích: 10; 20; 25; 100; 500 và 1000 ml. Giấy lọc 0,45 mm. Cốc có mỏ dung tích 250 ml. b. Hoá chất: Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm: Axetonitrile (CH3CN) dùng cho HPLC. Diclorometan (CH2Cl2) dùng cho HPLC. Methanol (CH3OH) dùng cho HPLC. Aceton dùng cho HPLC. Nước cất dùng cho HPLC. Acid phosphoride (H3PO4) đậm đặc dùng cho HPLC. Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4). Acid citric. Natri hydroxit (NaOH). Tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (Fluram). Chuẩn các chất nhóm sulfonamit. Chuẩn nội sulfanilamit. Dung dịch thử và dung dịch chuẩn Các dung dịch natri hydroxit Dung dịch natri hyđdoxit 10 M: hòa tan 40 g NaOH trong nước cất để có 100 ml. Dung dịch natri hydroxit 1 M: hòa tan 4 g NaOH trong nước cất để có 100 ml. Dung dịch natri hydroxit 0,1 M: pha loãng 1 ml dung dịch NaOH 1M trong nước cất để có 10 ml. Dung dịch acetonitril/H3PO4 pH = 6,0 Cho 80 ml acetonitril và 20 ml H3PO4 0,02 M vào cốc 250 ml. Dung dịch này được để nguội tới nhiệt độ trong phòng. Dùng dung dịch natri hyđroxit 1 M hoặc dung dịch natri hydroxit 0,1 M chỉnh pH = 6,0 0,1. Dung dịch đệm citrat 0,5 M, pH = 3,0 Hòa tan 10,5 g axit citric với 100 ml nước cất, chỉnh pH = 3,0 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 10 M, dung dịch natri hydroxit 1 M và dung dịch natri hydroxit 0,1 M . Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất: trộn theo thể tích gồm 6 phần acetonitril/H3PO4  pH = 6,0 với 4 phần dung dịch đệm citrat 0,5 M, pH = 3,0. Dung dịch fluorescamin 10 mg/ml: hòa tan 50 mg tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin trong 5 ml aceton. Các chất thuộc nhóm sulfanilamite Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 1 mg/ml: hòa tan 10 mg chuẩn nội sulfanilamit trong 10 ml metanol . Dung dịch chuẩn nội sulfanilamite 50 mg/ml: hút 1 ml sulfanilamite 1 mg/ml vào bình định mức 20 ml rồi định mức tới vạch bằng methanol. Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 5 mg/ml: pha loãng 1 ml sulfanilamite 50 mg/ml với nước cất để có 10 ml. Các dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc các sulfonamite 100 mg/ml: cân lần lượt 10,0 mg từng loại các chất nhóm sulfonamite. Sau đó, hòa tan rồi định mức đến vạch 100 ml bằng methanol. - Dung dịch chuẩn các sulfonamite trung gian 1000 ng/ml: hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc các sulfonamite 100 mg/ml vào các bình định mức 100 ml. Sau đó, định mức đến vạch bằng methanol. - Các dung dịch chuẩn sulfonamite để dựng các đường chuẩn: 0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; và 10,0 ng/ml) Hút lần lượt 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 dung dịch các sulfonamite 1000 ng/ml vào bình định mức 500 ml. Sau đó, định mức tới vạch bằng methanol. Pha động - Dung dịch H3PO4 0,02 M: hòa tan 2,3 g H3PO4 85% với nước cất rồi định mức thành 1000 ml. - Hỗn hợp dung dịch methanol và acetonitril (tỷ lệ 1:1): hòa tan 500 ml methanol trong 500 ml acetonitril. 2.5.5 Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền đồng thể. Cân chính xác 5,0 g mẫu đã được nghiền (kí hiệu W) cho vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml. Thêm 10 ml acetonitril và 2,5 ml diclorometan vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml có chứa 5,0 g mẫu thử. Sau đó, lắc ống trong 10 phút trên máy lắc. Tiếp theo ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 6 000 vòng/phút. Dùng pasteur pipet hút lớp trên vào bình định mức 25 ml. Thực hiện lại bước chiếtrồi gom tất cả phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml, làm đầy tới vạch định mức bằng acetonitril. Hút chính xác 10 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml để bay hơi tới cặn khô bằng dòng khí nitrogen ở nhiệt độ 50oC trên bể điều nhiệt. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có các chất nhóm sulfonamite. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị đối với mẫu thử. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g Thêm chính xác 500 ml dung dịch các chuẩn sulfonamite trung gian 1000 ng/ml vào 5g mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi 100 ng/g như chuẩn bị đối với mẫu thử. Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn Hút chính xác 10 ml lần lượt các dung dịch chuẩn sulfonamite để dựng các đường chuẩn vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml. Sau đó, cho dung dịch bay hơi tới cặn khô dưới dòng khí nitrogen ở nhiệt độ 50oC trên bể điều nhiệt. Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất huỳnh quang. Tạo dẫn xuất huỳnh quang Thêm vào các ống nghiệm chứa mẫu đã chuẩn bị các dung dịch gồm: 1 ml dung dịch đệm tạo dẫn xuất , 20 ml dung dịch chuẩn nội sulfanilamite 5 mg/ml và 0,2 ml dung dịch fluorescamine 10 mg/ml. Sau đó, để cho phản ứng khoảng 30 - 50 phút ở nhiệt độ trong phòng, rồi lọc qua giấy lọc 0,45mm. Lấy 10 ml dung dịch này tiêm vào hệ thống HPLC. Tiến hành phân tích trên HPLC Ðiều kiện phân tích Cột sắc ký: Cột Nucleosil 250 x 3 mm 100-5 C18 AB. Chương trình pha động: Theo qui định trong Bảng 2.5 Thời gian Dung dịch H3PO4 0,02 M Hỗn hợp dung dịch methanol và acetonitril (tỷ lệ1:1) Bắt đầu 60 40 20 phút 60 40 25 phút 50 50 39 phút 50 50 40 phút 45 55 50 phút 45 55 51 phút 60 40 58 phút 60 40  Bảng 2.7: Chương trình pha động Tốc độ dòng:                  0,6 ml/phút. Thể tích tiêm:                  10 ml. Bước sóng kích thích:       l = 405 nm. Bước sóng phát xạ:          l = 495 nm. Ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc. Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang. Dựng đường chuẩn giữa tỷ số diện tích pic các chuẩn sulfonamite/diện tích pic chuẩn nội sulfanilamite và nồng độ theo quan hệ tuyến tính bậc nhất (phương trình y = ax + b). Tiêm các dịch mẫu trắng, dịch mẫu xác định độ thu hồi và dịch mẫu thử đã tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC, mỗi mẫu 2 lần. Xác định tỉ số diện tích pic sulfonamit/sulfanilamit. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm: Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Ðộ thu hồi (R): Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải nằm trong khoảng 60 -70 %. 2.5.6  Tính kết quả Hàm lượng sulfonamite có trong mẫu được tính theo công thức sau: M (mg/kg) = C(x).                            Trong đó:      M là hàm lượng sulfonamite có trong mẫu, tính theo mg/kg; C là nồng độ của từng chất thuộc nhóm sulfonamite thu được, tính theo ng/ml; V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử, tính theo ml; W là khối lượng mẫu thử (5,0 g). III. Nhận xét, đánh giá Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh bản thân nó (chloramphenicol, malachite green ...) có thể gây ra tác động có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ thể sống. Chính vì vậy những kháng sinh này đã bị cấm sử dụng hoàn toàn trong nuôi trồng và bảo quản thực phẩm. Để có thể hạn chế được các chất kháng sinh thì ta phải áp dụng tối đa các biện pháp phòng tránh các chất kháng sinh, mà đặc biệt nhất là cấm sử dụng dư chất kháng sinh trong nuôi trồng gia súc, gia cẩm, thủy hải sản (Theo “Bảng danh mục hóa chất, chất kháng sinh bị cấm sử dụng quá liều lượng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, thủy hải sản” của bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn). Ngoài ra, phải tăng cường phổ biến thông tin, nâng cao năng lực của người nông dân trong vấn đề chăn nuôi, cũng như ý thức của người nông dân và doanh nghiệp nhằm phòng tránh trường hợp thực phẩm bị nhiễm quá nhiều thuốc kháng sinh, gây hại cho người tiêu dùng. Tài liệu tham khảo Provet.com.vn/ www.sinhhocvietnam.com “Kháng sinh”. Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS. Nguyễn Anh Dũng, Trần Đăng Ninh, Nguyễn Tử Cương NAFIQAVED Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh dùng trong thực phẩm Nankai biotech sản xuất theo công nghệ Mĩ (Dacovi.com) Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN – 5148 1990 Giáo trình “Phân tích thực phẩm,” TS. Vũ Thu Hòa, Đại Học Bách Khoa Tp.HCM Luận án thạc sĩ Hóa Học, Nguyễn Thị Thanh Nga Quyết định việc chỉ định phòng thử nghiệm kiểm tra chất lượng thức ăn chăn nuôi, bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, Số 44 /QĐ-CN-TĂCN Danh mục chất kháng sinh cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản( Ban hành kèm theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Tiểu luận công nghệ sinh học “Nghiên cứu quy trình sản xuất chất kháng sinh penicillin từ vi sinh vật”, ThS. Nguyễn Thị Lâm Đoàn (Hướng dẫn), Khoa công nghệ thực phẩm, Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội. Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, Ths. Huỳnh Kim Phước (Hướng dẫn) Suckhoedinhduong.nld.com.vn “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía bắc”, Tạp chí Khoa Học Và Phát Triển 2008: Tập VI, số 3, Đại học Nộng nghiệp Hà Nội, Phạm Kim Đăng, Gui Degand, Phạm Hồng Ngân, Gui Maghuin Rogister, Marie Louise Scippo TCN196 : 2004: Sulfonamit trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao,