Phân lập gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP2) từ mRNA phục vụ chuyển gen ở cây đậu xanh

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 127 - 131 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 127 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN VẬN CHUYỂN LIPIT (LTP2) TỪ mRNA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU XANH Nguyễn Vũ Thanh Thanh1*, Võ Minh Hòa1, Hoàng Hà 2, Lê Văn Sơn2, Chu Hoàng Mậu3 1Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên 2Viện Công nghệ sinh học,3 Đại học Thái Nguyên TÓM TẮT Lipid Transfer Protein (LTP) là protein có khả năng vận chuyển lipid qua màng tế bào và liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật. Khi gặp hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nƣớc nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài. Những nghiên cứu trên cây đậu xanh đã cho thấy hàm lƣợng mRNA của LTP sẽ tăng lên trong các điều kiện bất lợi nhƣ hạn, mặn hay khi hàm lƣợng ABA ngoại bào cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng giống đỗ xanh Mỹ Đức-Hà Nội (HN2) để phân lập gen LTP2 từ mRNA. Kết quả phân tích trình tự gen LTP2 cho thấy, gen phân lập đƣợc có độ dài 351 bp, mã hóa cho 116 amino acid. Kết quả này là cơ sở để tạo cây trồng chuyển gen mang gen LTP, tăng cƣờng tính chống chịu với điều kiện mất nƣớc và khô hạn. Từ khóa: Đậu xanh, gen LTP, chịu hạn, phân lập gen. MỞ ĐẦU* Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) là cây trồng cạn có vai trò quan trọng bởi nó cung cấp protein và có tác dụng cải tạo đất. Tuy nhiên, đậu xanh là cây trồng chịu hạn kém. Để nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng, hiện nay các nhà khoa học thƣờng tạo cây chuyển gen mang một hoặc một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn. LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, là một trong các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn. Vai trò của LTP là tham gia vào quá trình sinh tổng hợp biểu bì ở thực vật giúp hạn chế sự mất nƣớc trong điều kiện khô hạn [1], [2], [4]. Các nghiên cứu đã cho thấy LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào. LTP đƣợc gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm nhƣ một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP-linoleic acid đã đƣợc chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [5]. LTP đã đƣợc chiết ra từ protein ở các loài thực vật khác nhau và hàm lƣợng cao nhất LTP đã đƣợc tìm thấy ở lớp biểu bì bên ngoài cũng nhƣ xung quanh các gân lá. Gen LTP điều khiển và tổng hợp nên các sản phẩm protein tƣơng ứng tham gia xúc tác sự vận chuyển phospholipid giữa các lớp màng tế bào, hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp cây hạn chế mất nƣớc [3]. * Tel: 0912664126; Mail: thanhthanhdhkhtn@gmail.com Hiện nay , cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học , các nghiên cứu sinh học phân tử, di truyền và hóa sinh liên quan đến tính chịu hạn mới ở thực vật đã đƣợc làm sáng tỏ. Nhiều gen mới đã đƣợc phát hiện và đƣợc nghiên cứu chức năng trên các đối tƣợng cây mô hình khác nhau . Trong đó có gen mã hóa Lipid Transfer Protein (LTP) liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì của cây trồng . Đây là cơ sở quan trọng cho việc cải tạo giống cây trồng, nhằm tăng khả năng chống chịu. Dựa vào trình tự của gen mã hoá protein LTP đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen mã hoá protein LTP2 của đậu xanh bằng kỹ thuật RT-PCR, nhằm phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen. Gen LTP đƣợc nhân lên bằng phƣơng pháp RT-PCR sau đó gắn vào vector để dòng hoá và xác định trình tự nucleotide của gen. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống đậu xanh địa phƣơng của Mỹ Đức-Hà Nội (kí hiệu HN2) có đặc điểm: năng suất cao, vỏ hạt màu xanh mỡ, khối lƣợng 1000 hạt khoảng 57,32 g. Phương pháp RNA tổng số đƣợc tách từ lá cây đậu xanh sử dụng kit Trilzol Regents (Invitrogen).Từ RNA tổng số chúng ta tiến hành tổng hợp cDNA đƣợc tạo ra trong 20 l dung dịch có chứa 5 g RNA tổng số; 200 ng mồi ngẫu nhiên; 2 l dNTPs 10 mM; bổ sung nƣớc khử Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 81(05): 127 - 131 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 128 ion tới thể tích 13 l. Dung dich phản ứng này đƣợc ủ ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút, sau đó giữ ở nhiệt độ 4oC. Tiếp theo bổ sung 4 l đệm 5X RT tổng hợp cDNA; 1l DTT 0,1 M; 1 l chất ức chế ribonuclease tái tổ hợp RNase OUTTM (40 đơn vị/l); 1 l cloned AMV RT (15 đơn vị/l) vào dung dịch trên trƣớc khi thực hiện chu kì nhiệt nhƣ sau: 01 chu kì 25 o C trong 10 phút, 01 chu kì 45 o C trong 50 phút, 01 chu kì 85 o C trong 5 phút và giữ ở 4oC. Phản ứng PCR nhân gen đặc hiệu đƣợc thực hiện trong dung dịch bao gồm 28,6 l nƣớc; 5 l đệm PCR 10X; 5 l MgCl2 25 mM; 4 l dNTPs 2,5 mM; 2 l mỗi loại mồi NcoI- LTPF/NotI-LTPR 10 pmol/l; 0,4 l Taq polymerase 5 u/l; 4 l cDNA và theo chu kì nhiệt nhƣ sau: 01 chu kì 94oC trong 3 phút; 35 chu kì 94 o C trong 1 phút, 56 o C trong 45 giây, 72 o C trong 45 giây; 01 chu kì 72 o C trong 5 phút; và giữ ở 4oC cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agrose 1% trong đệm 1X TAE. Gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide với nồng độ 0,1 g/ml. Sản phẩm PCR đƣợc tách khỏi gel, tinh sạch bằng bộ kit của Fermentas và gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Sản phẩm gắn này đƣợc biến nạp vào tế bào E. Coli DH5. Chọn lọc các khuẩn lạc dƣơng tính (khuẩn lạc màu trắng) trên môi trƣờng LB có bổ sung 50 mg/l ampicillin, 30 mg/l X-gal và 0,1 mM IPTG. Sự có mặt của DNA tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng phản ứng cắt enzyme. Tách plasmid mang gen LTP2 phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Trình tự nucleotide của gen LTP2 đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied Biosystem. Kết quả đọc trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm DNAstar và BioEdit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả thiết kế mồi, tách mRNA và RT- PCR nhân gen LTP2 Thiết kế mồi nhân gen Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác từ Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807 và dựa vào cấu trúc của vector chuyển gen pCB301, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân và phát hiện sự có mặt của gen LTP2 ở giống đậu xanh địa phƣơng HN2. Để sau này có thể ghép nối gen LTP2 vào vector chuyển gen dễ dàng, chúng tôi đã thiết kế mồi xuôi có thêm trình tự của enzyme giới hạn NcoI, mồi ngƣợc bổ sung trình tự của enzyme giới hạn NotI. Trình tự mồi đƣợc thiết kế thể hiện trong bảng 1. Tách RNA tổng số và nhân gen LTP2 Chúng tôi tách RNA tổng số từ lá non của giống đậu xanh HN2. Sau khi tách RNA chúng tôi tổng hợp cDNA và nhân gen LTP2. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 1. Hình 1 cho thấy, đoạn DNA đƣợc nhân đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 350 bp, hàm lƣợng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo. Độ dài của đoạn DNA vừa nhân đƣợc cũng phù hợp với lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi và chiều dài cũng tƣơng tự nhƣ với gen LTP đã đăng ký trên Ngân hàng gen với mã số AY300807. Bảng 1. Trình tự mồi nhân gen LTP2 Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi NcoI-LTPF CATGCCATGGATGGCTAGCCTGAAGGTTGCA 56 0 C NotI-LTPR ATTTGCGGCCGCCTTGATGTTAGCGCAGTTGGT 56 0 C Tách dòng gen LTP2 Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện nhƣ sau: gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT, rồi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α. Sau đó cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl và agar) Hình 2. Véctơ pBT Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 127 - 131 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 129 có kháng sinh ampicilin (100 mg/ml), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/ml), ủ hộp lồng petri ở 37oC trong 16 giờ. Kết quả thu đƣợc có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng, chọn khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi ở môi trƣờng có LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/ml) qua đêm. Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Những khuẩn lạc trắng phát triển tốt trên môi trƣờng chọn lọc đƣợc nhân lên và tách chiết plasmid sau đó kiểm tra gen LTP bằng cắt bằng enzym giới hạn BamHI (hình 2). Kết quả điện di ở hình 2 cho thấy, dòng khuẩn lạc số 2 thu đƣợc băng có kích thƣớc gần khoảng 350 bp. Nhƣ vậy, có thể tạm thời khẳng định rằng gen LTP có thể đã gắn đƣợc vào vector pBT. Để khẳng định kết quả biến nạp thành công, chúng tôi tiến hành tinh sạch plasmid tƣơng ứng với dòng khuẩn lạc số 2. Kết quả xác định trình tự nucleotide Để xác định chính xác trình tự nucleotide của gen LTP, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen LTP2 trên máy đọc tự động ABI PRISM@ 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợc đem phân tích, xử lý bằng phần mềm BioEdit. Sau khi xử lý kết quả đọc trình tự nucleotide cho thấy, chiều dài gen LTP2 ở giống đậu xanh HN2 có kích thƣớc 351 nucleotide. Khi so sánh trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá LTP2 của đậu xanh. Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi so sánh trình tự gen LTP2 của giống HN2 với trình tự của giống đậu xanh trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY300807. Kết quả hình 3 cho thấy, gen LTP2 của hai giống đậu xanh này có độ tƣơng đồng cao (chỉ sai khác 1 nucleotide ở vị trí 326). Ở vị trí này, nucleotide loại T ở AY300807 đƣợc thay bằng C ở HN2. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP2 đƣợc phân lập với AY300807 chúng tôi nhận thấy, có 1 vị trí sai khác là vị trí 109 (F thay bằng S). Nhƣ vậy, amino acid pheninalanin ở AY300807 đƣợc thay bằng serin ở HN2. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 Hình 1. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP2 (M: Marker 1kb) Hình 2. Sản phẩm plasmid pBT-LTP cắt bằng BamHI với hai dòng khuẩn lạc trắng (M: Marker 1 kb) M 1 2 250 bp 500 bp 350 bp 350 bp M 1 2 500 bp 250 bp Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 127 - 131 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 130 AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 AY300807 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN2 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 AY300807 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTCCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . AY300807 A HN2 A Hình 3. So sánh trình tự nucleotide của gen LTP2 ở giống đậu xanh HN2 và trình tự đã công bố AY300807 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 AY300807 NVPYKISTFT NCANIK HN2 NVPYKISTST NCANIK Hình 4. So sánh trình tự amino acid trong protein LTP của giống đậu xanh HN2 và AY300807 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 131 Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen LTP2 ở trên là cơ sở để chúng tôi tiếp tục thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP2 để phục vụ việc nghiên cứu chuyển gen nhằm tạo các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt phục vụ cho phát triển cây đậu xanh ở vùng Trung du và miền núi phía Bắc. KẾT LUẬN Đã thiết kế đƣợc cặp mồi đặc hiệu và nhân đƣợc gen LTP2 bằng phản ứng RT-PCR. Sản phẩm PCR đƣợc dòng hoá nhờ vector pBT. Trình tự nucleotide đƣợc xác định và xử lí cho kết quả gen LTP2 của giống đậu xanh HN2 nghiên cứu dài 351 nucleotide. Trình tự gen LTP2 là cơ sở để thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen LTP2. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện và hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp bộ B2010-TN09-01. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C. (2000), Lipid transfer protein are encoded by a small multigen familly in Arabidopsis thaniana, Plant Science 157, pp. 1-12. [2]. Bourgis F., Kader J.P. (1997), Lipid transfer protein: Tools for manipulating membrane lipids, Physiol Plant 100, pp. 78-84. [3]. Carvalho AO, Souza-Filho GA, Ferreia BS, Branco AT, Araujo IS, Fernandes KV, Retamal CA, Gomes VM, (2006) Cloning and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues. Plant Physiol Biochem 44: 732-742. [4]. Kader J.C. (1996), Lipid transfer protein in plants, Annual Review of Plant Molercular Biology 47, pp. 627-654. [5]. Kimberly DC, Mark AT, Lawrece BM (2005) Increased Accumulation of Cuticular Wax and Expresion of Lipid Transfer Protein in Response to Periodic Drying Events in Leaves of tree Tobacco. www.ncbi.nlm.gov. SUMMARY ISOLATION OF GENE ENCODING LTP2 (LIPID TRANSFER PROTEINS) FROM mRNA IN MUNG BEAN Nguyen Vu Thanh Thanh 1* , Vo Minh Hoa 1 , Hoang Ha 2 , Le Van Son 2 , Chu Hoang Mau 3 1College of Science – TNU, 2Institute of Biotechnology 3Thai Nguyen University LTP (Lipid transfer proteins) are associated with tolerance to drought in plant. LTP have the ability to transfer phospholipids between membrane vesicles. LTP are implicated in cuticle biosynthesis and thought to play a role in the protection of plant. Based on the sequence of LTP2 gene of a mungbean cultivar in NCBI sequence database with the accession number AY300807, specific primer pair was designed to amplify the gene in a Vietnamese mungbean cultivar. In this study, we presented some results on amplification of LTP2 gene from mRNA isolated from Mung bean cultivar My Duc – Hanoi in Vietnam via RT - PCR reaction using specific primers, and cloning and sequencing this gene. This gene was 351 bp in length. The RT- PCR products containing the LTP2 fragments were cloned into pBT and sequenced. The correspond a polypeptide sequence of obtained LTP2 gene was 116 amino acids residues. Key wods: Mungbean, LTP genes, drought tolerance, gene isolation. * Tel: 0912664126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com