Nuôi cấy mô lá đinh lăng (Polyscias fruticosa L. harms) tạo rễ tơ và định lượng hoạt chất saponin tích lũy - Nguyễn Trung Hậu1

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 184-189 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. NUÔI CẤY MÔ LÁ ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa L. Harms) TẠO RỄ TƠ VÀ ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT SAPONIN TÍCH LŨY Nguyễn Trung Hậu1, Lê Thị Như Thảo2, Trần Văn Minh3* 1Trường Đại học Công Nghiệp tp. Hồ Chí Minh 2Trường Đại học Nông Lâm tp. Hồ Chí Minh 3Trường Đại học Quốc Tế, ĐHQG HCM, *drminh.ptntd@yahoo.com TÓM TẮT: Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài cây dược liệu được trồng phổ biến trong vùng Đông Nam Á và được sử dụng như thực phẩm chức năng. Ngoài việc sử dụng nuôi cấy để phát triển vùng nguyên liệu, nuôi cấy rễ tơ là một kỹ thuật được sử dụng để thu nhận saponin tích tụ. Lá cây đinh lăng một năm tuổi được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy. Lá được vô trùng bằng nước javel pha loãng 50% trong 10 phút đạt hiệu quả cao. Môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA thích hợp cho nuôi cấy phát sinh rễ. Ở các công thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D cho thấy không có sự hình thành rễ tơ và mô sẹo được tạo ra mạnh mẻ. Rễ tơ tăng sinh mạnh mẽ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Rễ tơ in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung IBA tạo sợi rễ mảnh và nhỏ hơn so với rễ tơ được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA. Nuôi cấy bổ sung kinetin cho thấy không có tác động đến quá trình tăng sinh rễ tơ. Định tính oleanolic acid và saponin trong rễ tơ bằng phương pháp HPLC cho thấy có sự tích tụ oleanolic acid 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g. Keywords: Polyscias fruticosa, tích tụ, rễ tơ, saponin, tăng sinh. MỞ ĐẦU Hiện nay, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc là một xu thế được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm. Việt Nam là một trong những quốc gia thuộc các vùng nhiệt đới, nơi chứa đựng giá trị đa dạng sinh học cao chưa được khám phá [3]. Khoảng 40-50 năm trở lại đây, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chú ý đến tác dụng tăng lực, bồi bổ cơ thể của nhiều cây cùng họ với cây nhân sâm [9]. Một số cây trong họ này cho những vị thuốc bổ nổi tiếng và được dùng từ lâu đời trong nhân dân ta như nhân sâm, ngũ gia bì, tam thấtvà đinh lăng có tác dụng như nhiều cây họ hàng với nó. Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là cây sống nhiều năm, ưa ẩm, ưa sáng, nhưng có khả năng chịu hạn, chịu bóng nhưng không chịu ngập úng. Có thể phát triển trên nhiều loại đất nhưng tốt nhất là đất pha cát. Cây phát triển mạnh khi nhiệt độ dưới 25oC (từ giữa thu đến cuối xuân). Có thể trồng được bốn mùa nhưng tốt nhất là giữa mùa xuân, cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 7 [17]. Đinh lăng có tác dụng hồi phục sức khỏe, chống stress, tăng khả năng chịu đựng của cơ thể, giảm rối loạn tiền đình, phòng chống nhiễm ký sinh trùng sốt rét, bức xạ siêu cao tần [12]. Đinh lăng còn có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống xơ vữa động mạch dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn phần và lipid toàn phần trong huyết thanh. Có tác dụng kháng khuẩn và kháng tốt trên các chủng Gr (+) như Staphylococcus, yếu ở vi khuẩn Gr (-) và nấm mốc. Cao đinh lăng có độc tính thấp LD50 là 8,51 g/kg thể trọng. Lá đinh lăng chứa saponin triterpen chiếm 1,65% là một genin dạng acid oleanolic có tác dụng dược liệu [23]. Trung tâm Sâm và Dược liệu tp. Hồ Chí Minh đã phân lập được 5 loại hợp chất polyacetylen từ lá đinh lăng là: Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca - 1,8(E) - dien - 4,6diyn - 3,4diol, Heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6diyn - 3ol - 10on và Heptadeca - 1,8 (Z) - 4,6diyn - 3ol - 10on. Trong rễ chỉ tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen Panaxynol, Panoxydol, Heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6diyn - 3ol - 10on là ba hợp chất giống trong lá. Các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và có tác dụng chống một số dạng ung thư [21]. Với nhu cầu sử dụng các loài dược liệu làm thuốc ngày càng tăng, do khai thác liên tục trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác đã làm cho nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Các dịch chiết từ lá sim, ngải cứu, đinh lăng và bách bộ không ức chế sự sinh cytokin kháng viêm IL-10, chứng tỏ chúng là những dịch chiết kháng viêm tiềm năng [14]. Dựa vào đặc điểm hình thái, dược chất và phân tích di truyền là cơ sở khoa học cho phép chọn giống Đinh lăng (P. fruticosa) có nguồn từ Hưng Yên3 vào sản xuất thuốc [15]. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic trong cao khô đinh lăng bằng HPLC [2]. Nghiên cứu phát triển nguồn gen P. fruticosa ở miền Đông Nam Bộ [16] và bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro P. fruticosa [6]. Nuôi cấy mô in vitro nhằm mục tiêu bảo tồn, cải thiện chất lượng và phát triển các loài dược liệu mang lại hiệu quả thiết thực [19]. Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ in vitro [1, 4, 7, 10], giúp tạo nguồn nguyên liệu vô tận sản xuất saponin [8, 18], không phụ thuộc điều kiện thời tiết, khí hậu môi trường, giảm chi phí và nguồn lực đầu tư, là một trong những phương pháp lý tưởng, có tiềm năng ứng dụng rất lớn cho sản xuất các hoạt chất thứ cấp có trong nhiều loại thực vật [5, 20, 22]. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu là cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa) một năm tuổi, được thu thập tại quận 12, tp. Hồ Chí Minh. Mô lá non được sử dụng làm mẫu nuôi cấy. Môi trường khoáng nuôi cấy MS [11] có bổ sung 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA (α-naphthaleneacetic acid), IBA (β-indolbutyric acid), Kinetin (6-furfurylaminopurine). Chất khử trùng nước javen (nồng độ chlor 5%). Chất bám dính tween (80%). Chất chuẩn oleanolic acid và saponin (Sigma Aldrich) Thiết bị HPLC: Agilent 1200 (USA) bơm mẫu tự động, đầu dò DAD Môi trường nuôi cấy được khử trùng ở 121oC (1 at), nhiệt độ phòng nuôi cấy 26±2oC, cường độ chiếu sáng 22,2 µmol/m2/s, độ ẩm Rh 65%. Phương pháp Thí nghiệm lặp lại 3 lần, nuôi cấy 3 bình tam giác cho 1 lần lặp lại, mỗi bình nuôi cấy 7 mẫu. Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và SAS v9.1. Thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian khử trùng mẫu lá cây đinh lăng: Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian. Dùng cồn 70% ngâm mẫu trong 1 phút để khử trùng sơ bộ, rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần, sau đó dùng javen với nồng độ khảo sát để khử trùng sạch trong thời gian khảo sát. Có bổ sung 3-4 giọt tween 80% để tăng độ bám dính chất khử trùng mẫu, tiếp tục rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng. Các mẫu lá sau khi khử trùng sẽ được cắt thành những đoạn nhỏ có kích thước khoảng 0,5 × 1 cm, sau đó nuôi cấy trên môi trường thạch. Sau 2 tuần, quan sát và ghi nhận kết quả. Nước javen có nồng độ (50% và 100%) và thời gian khử trùng mẫu (10, 15, 20 phút). Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ in vitro lá đinh lăng: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ in vitro cây đinh lăng. Môi trường MS mới có bổ sung 2,4-D (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l), NAA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l). Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA và IBA đến quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro cây đinh lăng: Khảo sát nồng độ tối ưu nhất của 2,4D (0,3; 0,5; 1,0 mg/l), NAA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l), IBA (0,3; 0,5; 1,0 mg/l) và có kết hợp Kinetin (1 mg/l) trong quá trình tăng sinh rễ tơ in vitro cây đinh lăng. Thí nghiệm 4: Định lượng saponin trong mẫu rễ tơ: Định lượng saponin trong rễ tơ ở thí nghiệm 3 bằng phương pháp HPLC. Xác định hàm lượng saponin bằng phương pháp phân tích HPLC Chuẩn bị mẫu phân tích Oleanolic acid: Cân 150 mg mẫu vào ống COD, chiết siêu âm 4 lần với 10 mL ethylacetatat chứa 1% acid formic. Thổi khô ethyl acetat. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC. Chuẩn bị mẫu phân tích saponin tổng số: Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm 50 mL nước nóng và ủ tại 90oC trong 10 phút. Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x 100 mL dicloromethan. Pha dicloromethan cô quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro trước khi tiêm. Để định lượng saponin tổng số, các nhánh đường gắn trên aglycone được thủy phân trong môi trường acid để chuyển hết về dạng aglycone. Do đó, saponin tổng số được định lượng thông qua oleanolic acid. Quy trình HPLC phân tách và định lượng oleanolic acid và saponin Pha tĩnh: cột ACE3 C18 (4,6 × 150 mm, kích thước hạt 3,5 micro) Pha động: đệm triethylamine/ HCl pH3 : MeOH tỷ lệ 10:90 v/v. Tốc độ dòng pha động 0,5 mL/phút; bước sóng 210 nm; nhiệt độ cột 20oC. Phương pháp tính toán hàm lượng oleanoic acid và saponin tổng số trong mẫu được thực hiện theo phương pháp ngoại chuẩn: Pha 5 điểm chuẩn oleanoic acid các nồng độ C1, C2, C3, C4 và C5. Sau đó tiến hành ghi tín hiệu sắc ký của các điểm chuẩn này. Từ sắc ký đồ thu được của các điểm chuẩn, lấy tín hiệu diện tích mũi sắc ký của từng điểm chuẩn được các giá trị S1, S2, S3, S4 và S5. Từ đó, dựng đường tuyến tính diện tích mũi sắc ký theo nồng độ thu được hàm số bậc nhất: y=ax+b. trong đó y là diện tích mũi, x là nồng độ dung dịch chuẩn oleanoic đã biết từ sắc ký đồ của các mẫu phân tích, lấy diện tích của mũi sắc ký oleanoic acid được giá trị S mẫu. giá trị S mẫu được áp vào đường tuyến tính y=ax+b sẽ thu được giá trị nồng độ oleanoic acid trong mẫu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian khử trùng mẫu lá cây đinh lăng Với nồng độ javen 50% và 100% trong 3 khoảng thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút, có tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao. Với nồng độ javen 50% và thời gian khử trùng mẫu 10 phút có tỉ lệ mẫu chết 4,7% và tỷ lệ mẫu sống vô trùng là 96,3% đạt hiệu quả tốt nhất trong quá trình khử trùng mẫu so với các công thức khác (bảng 1). Nồng độ javen 50%, khử trùng mẫu trong 10 phút thích hợp cho khử trùng mẫu lá cây đinh lăng. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ đinh lăng in vitro Môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D thì không tạo rễ tơ, bổ sung NAA cho thấy có sự hình thành rễ tơ. Bổ sung NAA 1 mg/l vào môi trường nuôi cấy MS kích thích tạo rễ tơ cao 0,322 g/cụm. Bổ sung NAA có nồng độ 1,5 mg/l - 2 mg/l thì trọng lượng rễ tơ tạo ra ít. Ở nồng độ NAA 0,5 mg/l - 1 mg/l thì trọng lượng rễ tạo ra tương đương nhau và nhiều hơn so với các công thức khác (bảng 2). Ở các công thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D cho thấy không có sự hình thành rễ tơ và mô sẹo được tạo ra mạnh mẻ. Môi trường thích hợp nuôi cấy tạo rễ tơ từ lá cây đinh lăng là môi trường MS + 1 mg/l NAA. Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA và IBA đến quá trình tăng sinh rễ tơ đinh lăng in vitro Trên môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,4-D cho thấy không có sự tăng sinh rễ; riêng trên môi trường có bổ sung NAA và IBA đều có sự tăng sinh rễ tơ sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường MS có bổ sung NAA cho tăng sinh rễ tơ nhiều hơn môi trường có bổ sung IBA. Với nồng độ NAA 0,5 mg/l bổ sung vào môi trường MS cho trọng lượng rễ tăng sinh là 2,018 g/cụm (bảng 3). Rễ tơ in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung IBA tạo sợi rễ mảnh và nhỏ hơn so với rễ tơ được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung NAA. Môi trường kết hợp kinetin cho thấy không có tác động đến quá trình tăng sinh rễ tơ. Môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh rễ tơ in vitro cây đinh lăng là môi trường MS + 0,5 mg/l NAA. Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng javen và thời gian khử trùng mẫu đến khả năng khử trùng mẫu lá cây đinh lăng Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ vô trùng Javen (50%) 10 4,7 a 96,3 a 15 20,4 b 79,6 b 20 16,4 b 83,6 b Javen (100%) 10 20,3 c 79,7 c 15 24,2 d 75,8 d 20 48,6 e 51,4 e Bảng 2. Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA đến quá trình tạo rễ tơ đinh lăng Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l) Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm) NAA 0,5 0,309 b NAA 1,0 0,322 a NAA 1,5 0,296 c NAA 2,0 0,263 d Bảng 3. Ảnh hưởng của NAA, IBA và 2,4-D đến quá trình tăng sinh rễ tơ đinh lăng Nồng độ chất ĐHST ngoại sinh (mg/l) Trọng lượng tươi rễ tơ (g/cụm) NAA 0,3 1,977 b NAA 0,5 2,018 a NAA 1,0 1,985 b NAA 0,3 + KI 1,0 1,979 b NAA 0,5 + KI 1,0 1,988 b NAA 1,0 + KI 1,0 1,965 c IBA 0,3 1,808 g IBA 0,5 1,854 e IBA 1,0 1,864 d IBA 0,3 + KI 1,0 1,803 g IBA 0,5 + KI 1,0 1,823 f IBA 1,0 + KI 1,0 1,857 d Các số liệu được theo sau bởi các ký tự khác nhau rất có ý nghĩa khác biệt với độ tin cậy 95%. Hình 1. Định lượng oleanolic acid và saponin trong mẫu rễ tơ tăng sinhbằng HPLC Định lượng saponin trong mẫu rễ tơ Phân tích định lượng bằng HPLC cho thấy hàm lượng oleanolic acid 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g tích lũy trong mẫu rễ tơ (hình 1). KẾT LUẬN Nồng độ khử trùng mẫu lá đinh lăng thực sinh thích hợp là dung dịch javen nồng độ 50%, trong 10 phút. Môi trường MS bổ sung 1 mg/l NAA thích hợp cho nuôi cấy mô lá tạo rễ tơ. Sự tăng sinh rễ tơ mạnh mẽ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA. Rễ tơ in vitro tạo ra từ môi trường nuôi cấy tăng sinh có chứa hợp chất oleanic acid 40,1 µg/g và saponin 396 µg/g tích lũy. TÀI LIỆU THAM KHẢO Asada Y., Li W., Yoshikawa T., 1998. Isoprenylated flavonoids from hairy root cultures of Glycyrrhia glabra. Phytochemistry, 47: 389-392. Chử Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Kiều Anh, Trịnh Thị Nhung, Nguyễn Huy Văn, Lâm Thị Bích Hồng, 2012. Nghiên cứu định lượng acid oleanolic trong cao khô đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học, 457(10): 34-38 25-30 Đỗ Huy Bích và nnk, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc. Nxb. Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Trang 793-796. Fukui H., Hasan A. F. M. F., Ueoka T., Kyo M., 1998. Formation and secretion of a new brown benzoquinone by hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon. Phytochemistry, 47: 1037-1039. Gupta S. K., Kuo C. L., Chang H. C., Chan H. S., Chen E. C. F., Chueh F. S., Tsay H. S., 2012. In vitro propagation and approaches for metabolites production in medicinal plants. Advances in Botanical Research, 62: 49-55. Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải, 2013. Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms). Tạp chí Dược học, 450(10): 25-30. Jung K. H., Kwak S. S., Choi C. Y., Liu J. R., 1994. Development of two stage culture process by optimization of inorganic salts for improving catharanthine production in hairy root cultures of Catharanthus roseus. J Fermentation and Bioengineering, 77(1): 57-61. Kwon B. M., Ro S. H., Kim M. K., Nam J. Y., Jung H. J., Lee I. R., Kim Y. K., Bok S. H., 1997. Polyacetylene analogs isolated from hairy roots of Panax ginseng, inhibit acyl-CoA-cholesterol. Planta Medica, 63: 552-553. LaCaille-Dubois M. A., Wagner H., 1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, 2(4): 363-386. Liu C. Z., Wang Y. C., Ouyang F., Ye H. C., Li G. F., 1997. Production of artemisinin by hairy root cultures of Artemisia annua L. Biotechnology Letters, 19(9): 927-929. Murashige T., Skoog R., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., (15): 431-497. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Nguyễn Thới Nhâm, 2001. Tác dụng dược lý cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá đinh lăng (Polyscias fruticosa L.Harms Araliacea). Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000 Viện dược liệu, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật. Trang 241-244. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nxb. Đại học quốc gia, tp Hồ Chí Minh, trang 137. Nguyễn Thị Mai Phương, Trịnh Tất Cường, Trần Thị Nhung, Dương Thị Nụ, Đặng Ngọc Quang, 2013. Xây dựng mô hình sàng lọc chất kháng viêm thông qua thụ thể toll like 4 (TLR4) trên màng tế bào macrophage chuột. Tạp chí Dược học, 443(3): 5-10. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Đặng Trọng Lương, 2014. Nghiên cứu đa hình di truyền tập đoàn các giống Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) có ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí Dược học, 457(5): 25-30. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Nguyễn Văn Thiện, Hoàng Tuyết Minh, Phạm Thị Thùy, 2014. Nghiên cứu phát triển nguồn gen cây đinh lăng lá nhỏ Polyscias fruticosa (L.) Harms ở miền Đông Nam Bộ. Tạp chí Dược học, 462(10): 30-35. Phạm Hoàng Hộ, 2003. Cây cỏ Việt Nam, quyển II. Nxb Trẻ, trang 668. Routa G. R., Samantarayb S., Dasa P., 2000. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnology Advances, 18: 91-120. Shahzad A., Sahai A., 2013. In vitro conservation protocols for some endangered medicinal-plant. Recent Trends in Biotechnology and Therapeutic Applications of Medicinal Plants, pp305-321. Shanks J. V., Morgan J., 1999. Plant ‘hairy root’ culture. Current Opinion in Biotechnology, 10: 151-155. Trần Công Luận, 1996. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất polyacetylen trong lá đinh lăng (Polyscias Fruticosa L. Hamrs, Alariaceae). Trung tâm nghiên cứu sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh. Toivonen L., 1993. Utilization of hairy root cultures for production of secondary metabolites. Biotechnology Progress, 9(1): 12-20. Võ Duy Huấn, Yamamura S., Ohtani K., Kasai R., Yamasaki K., Nguyễn Thới Nhâm, Hoàng Minh Châu, 1998. Oleanane saponins from Polyscias fruticosa. Phytochemistry, 47(3): 451-457. CULTIVATION OF LEAF-TISSUE OF Polyscias fruticosa (L.) Harms FOR QUANTITY OF SAPONIN ACCUMULATION Nguyen Trung Hau1, Le Thi Nhu Thao2, Tran Van Minh3 1University of Industry HCM 2University of Agriculture and Forestry HCM 3International University, VNU-HCM SUMMARY Polyscias fruticosa (L.) Harms is the medicinal plant, popularly cultivated in south-east asia and using as functional-foods. Besides of plantlets micropropagation for area development, hairy-root culture was the techniques manipulated for saponin accumulation. The leaves of young Dinh lang 1-year trees were used as culture materials. Sterilisation with javel water diluted to 50% in 10 minutes gave good results. MS medium supplemented with 1 mg/l NAA was favored for hairy-root induction from leaves tissue cultivation. Treatments with 2.4-D showed that hairy-root was not performed and induced callus strongly. Hairy-root was proliferation strongly in the MS medium supplemented with 0.5 mg/l NAA. Hairy-root cultivated on medium supplemented with IBA was weakly and thin in comparison with NAA. Kinetin was not affected on hairy-root proliferation. Quantity of oleanolic acid and saponin in proliferated hairy-root by HPLC method to show oleanolic acid 40,1 µg/g and saponin 396,2 µg/g accumulation. Keywords: Polyscias fruticosa, accumulation, hairy-root, proliferation, saponin. Ngày nhận bài: 22-10-2014