Nuôi cấy Lysine

LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ thầy cô trường CĐ Kỹ Thuật Công Nghệ Đồng Nai đã xây dựng những kiến thức căn bản cần thiết để giúp em thực hiện tốt bài báo cáo thực tập này Xin chân thành cảm tạ Th.S Trần Thanh Đại và cô Nguyễn Thị Ngân là giảng viên khoa Công Nghệ Thực Phẩm & Môi Trường – Trường CĐ Kỹ Thuật Công Nghệ Đồng Nai đã trực tiếp hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực tập. Chân thành cảm ơn BLĐ công ty CPHH VEDAN VIET NAM và toàn thể cán bộ công nhân viên , đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi được thực tế tại công ty trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm ơn các anh chị Phòng Thí Nghiệm Nuôi Cấy Vi Sinh – Trung Tâm Nghiên Cứu & Phát Triển – Công Ty CPHH VEDAN VIETNAM đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức thực tế vô cùng quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại công ty. Đây là lần đầu tiên tiếp xúc với thực tế, do kiến thức và thời gian có hạn nên khó tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong sự thông cảm và đóng góp ý kiến của các anh chị, thầy cô cùng toàn thể các bạn để em củng cố thêm được nhiều kiến thức và kinh nghiệm cho bản thân. Em xin chân thành cảm ơn ! Biên hòa tháng 08 năm 2010 Sinh viên thực hiện Vũ Đình Bính MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY CPHH VEDAN VIETNAM Lịch sử thành lập và phát triển nhà máy Chiến lược kinh doanh và phát triển Mục tiêu kinh doanh Năng lực sản xuất Sản phẩm VeDan Tuyển dụng và phát triển nguồn nhân lực Văn hóa công ty Chính sách môi trường Vinh dự công ty Cơ cấu tổ chức hành chánh. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LYSINE 2.1. Khái niệm Lysine 2.2. Các phương pháp tổng hợp Lysine 2.3. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy Lysine 2.4. Cơ chế tổng hợp Lysine CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM NUÔI CẤY LYSINE CÔNG TY CPHH VEDAN VIETNAM 3.1. Mục đích thí nghiệm nuôi cấy 3.2. Nguyên liệu sử dụng 3.3. Dụng cụ và hóa chất 3.4. Sơ đồ khối quy trình sản xuất và thuyết minh quy trình CHƯƠNG 4: SẢN PHẨM VÀ ỨNG DỤNG CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 5.2. Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU SƠ ĐỒ HÌNH VẼ Hình 2.1.a – Cấu trúc không gian L-Lysine Hình 2.4.a – Cơ chế tổng hợp L - Lysine Hình 3.4.a – Sơ đồ cấu tạo bồn nuôi cấy L- Lysine Hình 3.4.b – Sơ đồ quy trình nuôi cấy L - Lysine Hình 3.4.c - Ảnh hưởng của pH lên năng suất lên men L-Lysine Hình 3.4.d - Ảnh hưởng của nhiệt độ lên năng suất lên men L – Lysine Hình 3.4.e – Đường cong sinh trưởng nuôi cấy vi sinh vật Hình 4.a – Sản phẩm ứng dụng Lysine LỜI MỞ ĐẦU Lysine là một trong chín loại amino acid mà cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được, là một trong 12 axit amin thiết yếu cần có trong bữa ăn hàng ngày. Lysine là thành phần của nhiều loại protein, là yếu tố quan trọng trong việc duy trì hệ miễn dịch, nó giúp tăng cường hấp thụ và duy trì canxi, phát triển men tiêu hóa. Tuy nhiên, cơ thể chỉ tổng hợp được Lysine qua con đường thực phẩm như lòng đỏ trứng gà, thịt, cá, các loại đậu và sữa tươi hoặc dưới dạng thuốc. Nhưng việc cung cấp Lysine qua con đường thực phẩm rất dễ bị phá hủy trong quá trình đun nấu. vì vậy, cách cung cấp Lysine hiệu quả nhất là sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn, có bổ sung Lysine với liều lượng thích hợp, vừa đủ cho nhu cầu của cơ thể. Lysine được tổng hợp từ công nghệ hóa học, tiếp đó là công nghệ tách chiết và phổ biến hiện nay là công nghệ lên men vi sinh vật. về công nghệ sản xuất lysine trên thế giới, lysine đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp ở các nước như Mỹ, Nhật Bản, Đông Âu. Công nghệ lên men Lysine ngày càng mở rộng với hiệu suất quá trình lên men tương đối cao. Tại Việt Nam, hàng năm lysine được nhập khẩu vào với số lượng tương đối lớn. Tuy nhiên chỉ duy nhất công ty VeDan là đã đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp, ngoài ra các nghiên cứu ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, giống vi sinh vật chưa đạt chuẩn. Đề tài thực tế tại phòng nuôi cấy vi sinh vật công ty CPHH VeDan VietNam, nhằm giới thiệu về quy trình công nghệ sản xuất Lysine bằng phương pháp lên men quy mô phòng thí nghiệm. Thí nghiệm trước sẽ làm tiền đề cho thí nghiệm sau, từ đó giúp chúng ta tìm ra phương pháp và điều kiện nuôi cấy tối ưu để áp dụng vào sản xuất ở quy mô công nghiệp, nhằm mang lại giá trị kinh tế cao nhất. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY CPHH VEDAN VIETNAM Lịch sử thành lập Tên công ty: Công ty CPHH VEDAN VIETNAM Công ty Vedan vietnam xây dựng nhà máy vào năm 1991 tại xã phước thái, huyện long thành, tỉnh đồng nai. Nằm ở đông nam Thành Phố Hồ Chí Minh, tổng diện tích 120 hecta. Đến nay, các hạng mục được đưa vào sản xuất gồm: nhà máy xút-clo, nhà máy bột ngọt, nhà máy tinh bột, nhà máy tinh bột biến đổi, nhà máy lysine, nhà máy phát điện và hơi, ba hệ thống sử lý nước thải hiện đại, hồ chứa nước cho sản xuất 60.000m3, cảng Phước Thái vedan, đường giao thông chuyên dụng, các khu làm việc, sinh hoạt, vui chơi. Hiện nay, VeDan Viet Nam đã có thể thay thế cho VeDan Dai Loan và trở thành nhà máy sản xuất lớn nhất trên thế giới. chiến lược kinh doanh và phát triển Với mục tiêu, kinh doanh lâu dài tại việt nam, cùng sáng tạo tương lai. Công ty VEDAN VIETNAM liên tục đầu tư, áp dụng công nghệ tiên tiến, tích cực thực hiện các kế hoạch nghiên cứu, phát triển. thường xuyên hợp tác rộng rãi với các cơ quan, hiệp hội nghiên cứu và các tổ chức để đào tạo bồi dưỡng nguồn nhân lực có đầy đủ tiềm năng để hoàn thành xuất xắc công việc, đồng thời tạo ra bước đầu tốt đẹp cho việc nghiên cứu phát triển của việt nam. Để đáp ứng nhu cầu và tính cạnh tranh trên thị trường, công ty vedan viet nam liên tục tuyển dụng các chuyên gia trong và ngoài nước. Liên tục nghiên cứu và phát triển những sản phẩm mới, tất cả những thành quả trí tuệ của sự nổ lực không ngừng của toàn thể cán bộ công nhân vedan đã được đền đáp bằng sự khẳng định chất lượng và uy tín dòng sản phẩm vedan trên thị trường trong và ngoài nước. Mục tiêu kinh doanh Đồng tâm hiệp lực, phát triển lâu dài Nhắm toàn cầu, làm tại chỗ Lớn mạnh, lớn mạnh hơn nữa. năng lực sản xuất Ngay từ khi mới thành lập, công ty VEDAN VIÊT NAM đã không ngừng đổi mới công nghệ và nâng cao chất lượng sản phẩm bằng việc đầu tư thay thế các thiết bị cũ, lạc hậu, năng suất thấp bằng thiết bị tiên tiến. Trong suốt những năm qua, công ty đã không ngừng tuyển dụng và đào tạo nên những nhân viên ưu tú để đáp ứng với những nhu cầu mở rộng sản xuất và kinh doanh của mình. Với số lượng hiện tại khoảng 2700 nhân viên, trong đó hơn 30% là trình độ trung cấp trở lên, Vedan đã – đang – và sẽ tạo ra nhiều sản phẩm chất lượng hơn nữa để có thể đáp ứng những nhu cầu của người tiêu dùng. Đồng thời Vedan luôn nỗ lực nghiên cứu và phát triển các sản phẩm mới để đáp ứng những đòi hỏi và nhu cầu của thị trường trong và ngoài nước. sản phẩm Vedan 1.5.1. bột ngọt Sản phẩm bột ngọt của công ty vedan đã khẳng định được uy tín và chất lượng sản phẩm đối với người tiêu dung trên toàn thế giới trong suốt những năm qua. Sản phẩm đã được chứng nhận chất lượng ISO 2002, với độ thuần khiết đạt trên 99% đạt mọi tiêu chuẩn của nhà nước về an toàn vệ sinh thực phẩm. 1.5.2. Acid glutamate Là loại acid amin được tổng hợp trong cơ thể người, chúng được sử dụng rộng rãi trong trị bệnh và bổ sung sinh trưởng cho thực vật. ngoài ra acid glutamic có hai gốc hydroxyl và một gốc amin, nó là một chất lưỡng tính mang cả tính acid và kiềm, có thể làm nguyên liệu cho các loại thực phẩm, hóa phẩm và mỹ phẩm. 1.5.3. Axít amin Trong hơn 20 loại acid amin cấu tạo nên các tổ chức cơ thể, trong đó có 8 loại cơ thể không thể tự tổng hợp được mà phải tiếp nhận chúng từ thực phẩm. do yêu cầu đặc biệt đó, Vedan đã cho ra đời sản phẩm Lysine được áp dụng rộng rãi trong thực phẩm như chất tăng cường dinh dưỡng, chất phụ gia thực phẩm, dịch truyền amin..v.v. 1.5.4. Tinh bột khoai mì Tinh bột khoai mì vedan được sử dụng rộng dãi trong nghành thực phẩm như làm chất độn, chất kết nối, chất ổn định, chất làm đặc. ngoài ra nhà máy chế biến tinh bột biến tính của vedan cũng nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ tinh bột được ứng dụng trong các nghành công nghiệp khác như: dệt, sản xuất giấy hay xây dựng ..v.v. 1.5.5. Thức ăn chăn nuôi Qua thời gian dài nghiên cứu, Vedan đã sản xuất loại thức ăn động vật mới, chất bổ sung thức ăn chăn nuôi vedan mật rỉ lên men cô đặc, sản phẩm phụ từ dung dịch lên men của mật sau khi đã lên men, không những có các thành phần dinh dưỡng của mật mà còn có thêm protein. Sản phẩm đã được sử dụng rộng rải ở các nước Âu, Mỹ. 1.5.6. Phân bón hữu cơ Phân bón hữu cơ Vedagro được chế biến từ tinh bột mì và rỉ đường bằng công nghệ vi sinh hiện đại. Sản phẩm được hội đồng khoa học bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận là tiến bộ kỹ thuật, cho phép sử dụng trên các loại cây trồng cạn. 1.5.7. Acid clo hydric/ xut Nhà máy xút-clo của công ty có quy trình sản xuất tiên tiến và chế độ quản lý chặt chẽ, do vậy sản phẩm thuần khiết, đạt tiêu chuẩn thực phẩm. Acid clohydric, xút lỏng và Hypoclorite của công ty không những được dung trong nhà máy sản xuất bột ngọt, còn là nguyên liệu cơ bản cho các nghành sản xuất. hiện nay, các nhu cầu của thị trường phát triển mạnh mẽ, đòi hỏi vedan phải cố gắng không ngừng để phát triển kinh tế và xã hội Việt Nam. 1.5.8. Hypochlorite NaClO. Là một chất oxi hóa mạnh, tồn tại trong dung dịch cô đặc, không có tính kiềm. gặp ánh sáng và nhiệt độ sẽ nhanh chóng phân hủy.được ứng dụng trong tẩy trắng vài, quần áo, tinh bột, tái sinh giấy, xử lý nước thải, xử lý vệ sinh..v.v. tuyển dụng và phát triển Nhân tài bao giờ cũng là vốn qúi không thể thiếu được đối với một doanh nghiệp năng động, vì vậy Vedan luôn tuyển dụng và tạo cơ hội cho mỗi nhân viên của mình theo đuổi mục tiêu và phát triển nghề nghiệp. Tiêu chuẩn tuyển dụng của Vedan là những nhân viên có đạo đức và kinh nghiệm công tác. Trong môi trường cạnh tranh xí nghiệp mang tính toàn cầu hiện nay, Vedan đã không ngừng vươn lên, hoàn toàn nhờ vào kế hoạch đào tạo phát triển nguồn nhân lực, tăng cường quản lý, dẫn dắt công ty ra sức phấn đấu thành công bước vào thế kỷ mới. Đến với Vedan, các nhân viên sẽ có cơ hội trổ hết tài năng, niềm đam mê công việc trong nghiên cứu sáng tạo, và được làm việc trong môi trường năng động. Ngoài ra các nhân viện còn được hưởng những phúc lợi xã hôi khác, nhằm nâng cao tinh thần hăng hái và kích thích năng lực tự phát của bản thân. văn hóa công ty Ngày nay, văn hóa công sở được xem như là yếu tố căn bản tạo nên sự khác biệt của một thương hiệu. các giá trị này được hình thành từ tính cách, mong muốn của người lãnh đạo, đóng góp của toàn thể nhân viên trong quá trình sản xuất kinh doanh. Luôn tích lũy, điều chỉnh theo thời gian cùng với sự phát triển của công ty. Môi trường văn hóa Vedan được xây dựng phong phú, với nhiều bản sắc, gắn kết các cá nhân trong một tập thể nhằm xây dựng môi trường phát triển mạnh mẻ, bền bỉ và là giá trị phát triển trường tồn của một tổ chức. nó tạo nên một hình ảnh khác biệt của Vedan. Văn hóa thể hiện qua: Cách ứng xử hằng ngày của mỗi công nhân viên. Giữa cấp quản lý với nhân viên của mình, và giữa nhân viên với nhau. Văn hóa sinh hoạt hằng ngày như ăn uống, giao tiếp, công việc… Tất cả các yếu tố văn hóa trên đã được hình thành và phát triển theo sự lớn mạnh của Vedan. Nó đã tạo nên hình ảnh tốt đẹp của Vedan trong mắt moi người. Chính sách môi trường Bảo vệ môi trường và phát triển bền vững là hai yếu tố không thể tách rời nhau đối với quá trình phát triển của một nền kinh tế - xã hội hiện đại. Vì vậy trong quá trình kinh doanh lâu dài của mình, Vedan luôn nỗ lực duy trì và thực hiện liên tục. Vedan luôn cố gắng phấn đấu trở thành doanh nghiệp phát triển bền vững gắn liền với bảo vệ môi trường trong thời gian tới, đó cũng là mục tiêu lâu dài của công ty CPHH VEDAN VIET NAM. Chính sách hệ thống quản lý môi trường ISO 14001 : 2004 đã được Vedan lấy làm nền tảng để thiết lập nên hệ thống quản lý môi trường, đồng thời định hướng chung cho tòan thể nhân viên của công ty VeDan luôn đề cao khái niệm về yêu quí môi trường. Vedan cũng định hướng cho nhân viên của mình đề cao quan niệm An toàn và sức khỏe nghề nghiệp, đề phóng phát sinh các rủi ro mà gây ra nguy hại cho nhân viên, tổn thất tài sản và thiệt hại cho môi trường làm việc, thông qua Chính Sách An Toàn Và Sức Khỏe Nghề Nghiệp OHSAS 18001 :2007 P “Công Ty An Toàn, Mọi Người Khỏe Mạnh”. vinh dự công ty Với những nỗ lực phấn đấu và phát triển không ngừng của tập thể cán bộ công nhân Vedan. Năm 1999, công ty Vedan đã được chứng nhận đạt tiêu chuẩn ISO 9002 và được chủ tịch nước tặng thưởng Huân chương lao động hạng 3 vào ngày 08/11/2000 về những đóng góp xuất xắc của công ty ở Việt Nam. Bộ thương mại nước CHXHCN Việt Nam tặng thưởng bằng khen cho công ty vào ngày 19/07/2001 về thành tích xuất xắc trong nhập khẩu. Với những thành tựu đã đạt được của mình, ngày 11/10/2009, Công ty CPHH Vedan đã được trao giải thưởng “ Doanh nghiệp ứng dụng hệ thống quản lý xuất sắc và Top 100 sản phẩm vì an toàn sức khỏe cộng đồng”. Cơ cấu tổ chức hành chánh Tổ chức giữ những chức năng chung là quản lý các hoạt của các bộ phận trong tổ chức, bao gồm các khối, các cấp, văn phòng hay xưởng (tức là quan hệ hàng dọc) để đảm nhận những hoạt động cần thiết, xác lập các mối quan hệ về nhiệm vụ quyền hạn và trách nhiệm giữa các bộ phận đó. Mục tiêu của chức năng tổ chức là tạo nên một môi trường nội bộ thuận lợi cho mỗi cá nhân, mỗi bộ phận phát huy được năng lực và nhiệt tình của mình, đóng góp tốt nhất vào việc hoàn thành mục tiêu của tổ chức. Mỗi một bộ phận trong cơ cấu tổ chức đóng một chức năng riêng và chịu sự giám sát của cấp trên mình. Sơ đồ cơ cấu tổ chức: KHỐI QUẢN LÝ HÀNH CHÁNH KHỐI QUẢN LÝ SẢN XUẤT KHỐI QUẢN LÝ KINH DOANH VP. TỔNG GIÁM ĐỐC KHỐI QUẢN LÝ TÀI VỤ KHỐI ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG & NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN TỔNG GIÁM ĐỐC X.NHIỆT ĐIỆN P.CƠ KHÍ P.THÍ NGHIỆM X.XÚT - AXÍT X.THỰC NGHIỆM X.TINH BỘT PHƯỚC THÁI P.CÔNG VỤ X.TINH BỘT PHƯỚC LONG KHỐI QUẢN LÝ SẢN XUẤT X.LÊN MEN LYSINE X.THU HỒI VÀ TINH CHẾ LYSINE X.THU HỒI BỘT NGỌT P.KẾ HOẠCH SẢN XUẤT X.GIA CÔNG SẢN PHẨM PHỤ X.ĐÓNG GÓI BỘT NGỌT X.LÊN MEN BỘT NGỌT X.TINH CHẾ BỘT NGỌT X.PGA X.XỬ LÝ NƯỚC THẢI P.KINH DOANH HIỆN ĐẠI P.KD SẢN PHẨM HÓA HỌC ĐẶC BIỆT P.KINH DOANH TINH BỘT P.KẾ HOẠCH TIÊU THỤ P.K D AXIT AMIN THỰC PHẨM KHỐI QUẢN LÝ KINH DOANH X.TINH BỘT BÌNH THUẬN X.TINH BỘT HÀ TĨNH P.HÓA NGHIỆM TRUNG TÂM TT. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN P.ĐẢM BẢO PHÁT TRIỂN KHỐI ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN P.TÀI VỤ P.THUẾ QUAN VÀ XNK P.KẾ TOÁN P.VI TÍNH P.PHÂN TÍCH KINH DOANH KHỐI QUẢN LÝ TÀI VỤ P.VẬN TẢI P.PHÚC LỢI CÔNG NHÂN VIÊN P.TỔ CHỨC HÀNH CHÁNH P.THU MUA P.QUẢN LÝ KHO KHỐI QUẢN LÝ HÀNH CHÁNH P.BẢO VỆ BAN QUẢN LÝ NGUYÊN LIỆU BAN DỰ ÁN P.KIỂM TOÁN NỘI BỘ BAN CÔNG TÁC ĐỐI NGOẠI P.PHÁP CHẾ BAN THƯ KÝ VP.TỔNG GIÁM ĐỐC CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LYSINE 2.1. Khái niệm Lysine Hình 2.1.a – cấu trúc không gian L-Lysine Tên quốc tế: 2,6 – diminohexanoic acid Công thức hóa học : C6H14N2O2 Khối lượng phân tử gam : 146.188 g/mol Công thức cấu tạo : NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH NH2 Lysine là một a-amino acid. Là acid amin thuộc họ aspartat, có chứa 2 nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH). Lysine tổng hợp qua con đường trao đổi chất phân nhánh, qua con đường này còn có metionin, treonin, izoloxin cũng được tạo thành. 2.2. Các phương pháp tổng hợp Lysine Phương pháp thủy phân Phương pháp tổng hợp hóa học Phương pháp kết hợp Phương pháp tổng hợp axit amin bằng công nghệ vi sinh vật : Thu nhận axit amin dạng L Năng xuất cao Giá thành sản phẩm thấp Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm. 2.3. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy Lysine 2.3.1. Giống vi sinh vật Trong nuôi cấy Lysine. Người ta thường sử dụng chủng Corynebacterium glutacium vì: Có khả năng tổng hợp Lysine với mức độ cao nhất, ở đây người ta sử dụng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum đột biến. Sống được trên môi trường chứa hàm lượng methionine cao và threonine thấp. Tương đối dể nuôi và áp dụng vào công nghệ lên men ở quy mô công nghiệp. Đặc điểm của giống: Hình thái khuẩn lạc: tròn, trơn, bóng Màu sắc: vàng chanh 2.3.2. nguyên liệu và môi trường nuôi cấy Rỉ đường ( mía hoặc củ cải đường), dung dịch đường thu được sau quá trình thủy phân tinh bột sắn, bột ngô có hàm lượng đường khoảng 10-20%. Đường của rì đường bao gồm: 25-40% sacaroza, 15-25% đường khử( glucoza và fructoza), 3-5% đường không lên men được. các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp Lysine đều có khả năng đồng hóa glucose, fructose, maltose, pentose, rafinose. Nguồn nitơ: Dùng các loại muối chứa NH4+ như: NH4CL, NH4OH, (NH4)2SO4, NH4HPO4 hay khí NH3 hoặc urue làm nguồn cung cấp Nitơ. Trong nuôi cấy công nghiệp thường sử dụng NH3 dưới dạnh lỏng hoặc khí. Có thể sử dụng urue, khi sử dụng urue cần quan tâm tới nồng độ ban đầu vì khả năng chịu đựng của mỗi loại sinh vật khác nhau. Muối khoáng: Muối khoáng được sử dụng nhiều nhất là các dạng muối photpho. Nồng độ thích hợp là 0.008-0.02mg/l, trong sản xuất người ta phải bổ xung thêm MgSO4.7H2O với hàm lượng 0.03-0.5%. Vitamin: Biotin, Nicotinic, pantothenic acid, thiamine HCL… 2.4. Cơ chế tổng hợp Lysine Dextrose … Piruvat β-Aspartat-photphat Oxalatetat Lysine Aspactat-β-sinial dehyd Homogerium Treonin Methionin Hình 2.4.a Từ sơ đồ 2.4.a ta nhận thấy, muốn vi khuẩn tạo ra nhiều L-Lysine thì sự tiến hóa phải theo nhánh α. Ở đây sử dụng chủng đột biến mất Enzylme homoserin dehydrogenase, do đó sẽ không tạo thành tronin và methionin. Kết quả L-Lysine được tổng hợp. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM NUÔI CẤY LYSINE CÔNG TY CPHH VEDAN VIETNAM 3.1. Mục đích thí nghiệm nuôi cấy Thí nghiệm được thực hiện trên môt loại vi sinh vật đã đột biến, nhằm kiểm tra những điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để áp dụng vào quy mô nuôi cấy công nghiệp hiệu quả hơn. Lấy thí nghiệm trước làm tiền đề cho thí nghiệm sau Trong quá trình nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng được thay đổi nhưng các điều kiện khác vẫn tuân theo những yêu cấu về kỹ thuật. Vì vậy chúng ta có thể so sánh được môi trường nuôi cấy phát triển tối ưu cho vi sinh vật và mang lại giá trị kinh tế cao hơn. Từ đó xây dựng được biểu đồ sinh trưỡng ở những điều kiện khác nhau. 3.2. nguyên liệu sử dụng Dextrose tỉ lệ 2.5%Sucrose Rỉ đường : mol thai, mol viet nam, Indo… bao gồm 25 – 40% sacaroza, 15-25% đường khử ( glucoza và fructoza), 3-5% đường không lên men được. Nguồn nitơ: NH3, (NH4)2SO4. Muối khoáng: các dạng muối photpho, MgSO4.7H2O Vitamin: biotin, nicotinic, pantothenic acid, thiamine HCL, Ca. pantothenate Nước siêu thuần.. 3.3. dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ Bồn nuôi cấy 5l Máy đo OD Nồi autoclave Nồi gia nhiệt Bếp Bình tam giác Máy đo ph Máy khuấy từ. Pipet Cân điện tử Máy lắc Máy ly tâm… b. Hóa chất sử dụng Na2HPO4 KH2PO4 Acid Citric MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O CuSO4.7H2O H3PO4 ZnSO4.7H2O (NH)2SO4 HCL 1N H2SO4 30% Dịch A: CUSO4, KIO3, C4H4KNaO6, Na3PO4. Dịch B: KI, K2C2O4 Dịch C: H2SO4 97% Dịch D: Na2S2O3 Chất phá bọt: dầu phộng 3.4. Sơ đồ khối quy trình sản xuất và thuyết minh quy trình 3.4.1. Sơ đồ khối quy trình sản xuất L- Lysine ( hình 3.4.a). 3.4.2. Thuyết minh quy trình 3.4.2.1. chuẩn bị bồn không Cấu tạo chung và chức năng của bồn không: Thân bồn Ống dẫn OL: ống dẫn chất phá bọt Ống dẫn đường FD: dẫn môi trường dinh dưỡng để bổ xung trong qua trình nuôi cấy. Vách khuấy ( vách cản dòng): có tác dụng đánh rối môi trường nuôi cấy. Ống gió: gồm van một chiều và thiết bị lọc gió, tại đây không khí được thổi vào cùng NH3 Trong quá trình nuôi cấy nhằm cung cấp oxi và nitơ cho quá trình lên men hiếu khí, đồng thời giúp ổn định PH cho môi trường nuôi cấy. Khí cung cấp vào phải sạch về vi sinh vật và các tạp chất khác. Hình 3.4.a – sơ đồ cấu tạo bồn nuôi cấy L-Lysine Máy làm mát Máy sấy gió Bình NH3 gas Van tổng Đồng hồ đo áp suất van dẫn khí NH3 vào thiết bị điều khiển máy điều khiển hệ thống phân tích CO2 van điều chỉnh lưu lượng khí đồng hồ đo áp suất van thải Ống dẫn khí thải Thiết bị ngưng tụ Motor Ống tiếp môi trường Đường ống dẫn nước vào Đường ống dẫn nước ra Đường ống dẫn khí vào bồn lên men Lọc Van một chiều Ống lấy mẫu Trục khuấy Cánh khuấy Điện cực PH Nhiệt kế Tấm chắn Ống chứa nước tiêu độc Ống dẫn nước vào Bồn lên men Thiết bị làm mát Ống dẫn nước ra Đường ống FD PUMP Đường ống tiếp giống Ống tiếp giống Ống lấy mẫu kiểm tra Ống cắm thanh điện cực: giúp nhận biết PH Ông đo nhiệt độ trong bồn nuôi cấy. Cánh khuấy: Thực hiện quá trình khuấy đảo nhằm: Làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật, từ đó làm tăng khả năng trao đổi chất. khả năng tiếp xúc càng nhiều thì trao đổi chất càng mạnh. Trong khi tiến hành trao đổi chất, các chất sau đồng hóa và dị hóa sẽ tạo ra một lớp quanh tế bào. Khi cánh khuấy hoạt động, lớp bao quanh này bị phá bỏ. vì vậy mức độ xâm nhập cùa chất dinh dưỡng vào tế bào mạnh hơn. Lên men trong điều kiện hiếu khí, cánh khuấy làm tăng khả năng hòa tan của oxy, các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển động của môi trường. như vậy, khả năng hòa tan của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn Cánh khuấy làm tăng khả năng tách các khí CO2, H2S, NH3… sinh ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm ảnh hưởng xấu của các laọi khí này đến vi sinh vật. Cánh khuấy làm tăng nhanh quá trình sản xuất của con giống, do tác động cơ học mà các tế bào dễ dàng tách ra và sống độc lập. Ống dẫn khí CO2: giúp kiểm soát được sự tạo thành CO2 trong quá trình nuôi cấy. lượng vi sinh vật càng cao thì CO2 thải ra càng nhiều. Ống dẫn Màn hình máy tính: hiển thị các thong số kỹ thuật của bồn lên men, giúp kiểm soát được môi trường nuôi cấy theo đúng yêu cầu kỹ thuật. 3.4.2.2. Sát trùng bồn không Bồn không được lắp ráp với các ống dẫn silicon . sát trùng ở 1210C +/-20C, 1kg/cm2 thời gian sát trùng từ 30-60 phút. Tùy theo yêu cầu thực nghiệm. Trong quá trình sát trùng, tất cả các van khóa ống dẫn silicon và thiết bị phải được mở để hơi nóng có thể di chuyển trong toàn bộ thiết bị và tiệt trùng triệt để. 3.4.2.3. Điều chế môi trường Môi trường nuôi cấy gồm các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển của sinh vật. Gồm hai loại môi trường: Môi trường nuôi dưỡng và môi trường đường FD bổ xung nuôi cấy.Cân và hòa tan nguyên liệu trong môi trường: Môi trường nuôi dưỡng sản xuất lysine có các thành phần: Dextrose 2.5%, (NH4)2SO4, NH3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CuSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, Na2HPO4.12H2O, biotin, bổ sung thêm khoáng chất , duy trì PH = 7.0 bởi NH3 khí. Môi trường được điều chế và thay thế nguyên liệu theo yêu cầu thực nghiệm. hiệu chỉnh PH từ 6.8 – 7.2 theo đặc tính của từng loại giống. Môi trường FD: NH4)2SO4 hòa tan. Đường hòa tan. Các loại vitamin. SA. (NH4)2SO4 được hòa tan và sát trùng ờ 121+/-20C, 1kg/cm2, thời gian là 25 phút( tùy thuộc vào yêu cầu thực nghiệm). Vitamin đuợc bơm trực tiếp vào môi trường nuôi dưỡng, hoặc bình SA đã được làm nguội. Ở đây, vitamin được bơm vào bình SA qua thiết bị lọc. Biotin: có vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy. biotin có tác dụng kích thích sinh trưởng và tích lũy L-Lysine. Khi đủ biotin, sinh vật sinh trưỡng vừa phải, diễn biến lên men đều và L-Lysine tạo ra nhiều. khi thừa biotin, vi khuẩn sinh trưỡng mạnh mẽ, tiêu hao đường và sinh rất ít L-Lysine. Lượng biotin bổ sung vào để thích hợp cho sự tạo thành Lysine tùy thuộc vào từng chủng giống. ở đây ứng với 1000ml là: 0.023grs. 3.4.2.4. sát trùng môi trường Môi trường nuôi dưỡng sau khi điều chế, tiến hành hiệu chỉnh PH đạt 6,8 – 7,2. Sát trùng ở 121+/-20C, 1kg/cm2, 25 phút. Tùy theo yêu cầu thực nghiệm. Trong quá trình sát trùng môi trường, các van và khóa bồn phải được đóng, không được để môi trường trào ra khỏi bình lên men, vì dễ gây tạp nhiễm. CHUẨN BỊ BỒN KHÔNG SÁT TRÙNG BỒN KHÔNG SÁT TRÙNG MÔI TRƯỜNG ĐIỀU CHẾ MÔI TRƯỜNG LÊN MEN ĐƯỜNG FD CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG FD GIỐNG B.O Hình 3.4.b – Quy trình nuôi cấy L-Lysine 3.4.2.5. Giống và tiếp giống Giống được phân lập, chọn lọc và được nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm, nhân giống cấp 2 trong bình tam giác chứa dịch nuôi cấy. Lắc giống cấp 2 trong bình tam giác từ 13-16h ( tùy từng loai giống). Tiếp giống: Tất cả các thông số kỹ thuật trong bồn nuôi cấy phải đạt yêu cầu: gió, áp suất, nhiệt độ, PH… Giống được tiếp từ bình tam giác vào bồn nuôi cấy bằng bơm lưu lượng. Tiến hành cấy tạp khuẩn từ giống cấp 1, cấp 2 trước ( trước khi tiếp giống) và dịch lên men sau khi tiếp giống. Nếu trên môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tạp khuẩn, dịch được cấy vào có phát hiện khuẩn lac. Chứng tỏ giống nhiễm tạp khuẩn. 3.4.2.6. Lên men 3.4.2.6.1. Điều kiện lên men Nhiệt độ trong quá trình lên men duy trì từ 32-340C PH : 6.8 – 7.2 Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị có cánh khuấy, và thổi khí liên tục. vì vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng của cột môi trường. vì vậy, phải thực hiện yêu cầu về khuấy đảo và sục khí. Sau khi giống được tiếp vào, tiến hành nuôi cấy từ 68-72 giờ. Quá trình lên men, dưới sự khuấy đảo liên tục. trong bồn lên men sẽ có hiện tượng xâm thực( sự va đập của dịch lên men vào thiết bị kim loại), và quá trình sinh khí của vi sinh vật. xuất hiện nhiều bọt khí có khuynh hướng trào ra khỏi bồn lẹn men, dễ gây tạp nhiễm. vì vậy, cần kiểm soát lượng bọt và tìm cách phá hủy chúng. Ngoài ra, bọt khí cũng cản trở sự tiếp xúc của tế bào với môi trường dinh dưỡng. L-Lysine được cấu thành từ các phân tử C, H,O,N. vì vậy, môi trừng nuôi cấy phải đáp ứng đủ các yếu tố cần thiết để hình thành cấu trúc vi sinh vật. Phân tích và kiểm tra: Trong quá trình lên men, môi trừờng nuôi cấy sẽ có sự thay đổi do những phản ứng xảy ra làm thay đổi môi trường. vì vậy, phải kiểm tra theo định kì về các thông số như: T/S, OD, MV, PH… từ 1- 4 giờ/ 1 lần. PH: mỗi loại vi sinh vật thích nghi với một môi trường nuôi cấy. trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm, khiến PH của môi trường không còn thích hợp với môi trường sống của mình. Vì vậy, cần phải thường xuyên theo dõi và điều chỉnh PH trong suốt quá trình nuôi cấy. Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng tối ưu ở PH từ 6.8 – 7.2. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy, môi trường có ảnh hưởng nhiều tới năng suất Lysine. Thực nghiệm được trình bày theo biểu đồ sau: Lượng lysine(g/l) 6,5 7,2 8,0 pH Hình 3.4.c - ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến năng suất lysine Lưu ý: việc kiểm tra PH phải được tiến hành ngay sau khi lấy mẫu, vì nếu kéo dài thời gian thì kết quả kiểm tra sẽ không chính xác. Nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật và hiệu quả của quá trình lên men. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ khác nhau ( ở đây nhiệt độ từ 32 – 340C). Trong quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt rất mạnh, nên nhiệt độ trong các thiết bị lên men thường có xu hướng gia tăng vượt ngưỡng nhiệt độ thích hợp đối với hoạt động sống của vi sinh vật đó. Vì vậy, phải thường xuyên theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men ( 32 – 340C). Để đạt được nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men. Bồn lên men được trang bị hệ thống làm nóng và làm nguội bằng nước chảy quanh đáy bồn dưới dạng ống ruột gà làm nguội. Qua khảo sát thực tế ở các mức nhiệt độ, kết quả được xây dựng theo biểu đồ sau: Lượng Lysine (g/l) 20 25 30 35 40 t(oC) Hình 3.4.d - ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên men đến năng suất Lysine Từ nghiên cứu lý thuyết đến thực nghiệm ta thấy, nhiệt độ môi trường từ 30 – 400C lượng lysine sinh ra cao hơn, đặc biệt ở nhiệt độ từ 32 – 340C. Vì vậy trong sản xuất và thí nghiệm chúng ta chọn nhiệt độ này ( 32 – 340C). Phân tích T/S: Mục đích: kiểm tra hàm lượng đường và điều chỉnh phù hợp. Hóa chất sử dụng: dịch A, dịch B, dịch C,dịch D. Tiến hành: lấy mẫu từ bồn nuôi cấy Hút 10ml dịch mẫu cần phân tích Hút 1ml hoặc 2ml H2SO4 30% ( tùy thuộc vào độ tuổi của mẫu): Mẫu thử đạt 20 – 40 tuổi dùng 1ml H2SO4 30% Mẫu thử đạt 40 – 72 tuổi dùng 2ml H2SO4 30% Cho vào ống nghiệm và định mức bằng PH=1 tới 30ml. Tiến hành gia nhiệt trong 30 phut để thủy phân hoàn toàn hàm lượng đường trong dịch mẫu. sau khi gia nhiệt, tiến hành làm nguội và điều chỉnh PH của mẫu đạt từ 6,5 – 7,3. Định mức tới 100 ml bằng nước siêu thuần. Cho vào bình tam giác (250 ml ) 20 ml dịch A. Hút 2ml hoặc 5ml dịch mẫu ( nếu T/S lần kiểm tra trước từ 3.00 trở lên thì hút 2ml, nếu dưới 3.00 thì hút 5ml), cho vào dịch A, đun sôi trên bếp 3 phút và làm nguội. Thêm vào 10ml dịch B, 10ml dịch C. Tiến hành chuẩn độ bằng dịch D tới khi đổi màu, thêm 3 giọt chỉ thị vào và tiếp tục chuẩn tới khi đổi màu hoàn toàn. Dựa vào thể tích dịch D, xác định T/S theo công thức: %TS = ( Vo – V1)xFx1.449 x 0.2 Hoặc %TS = ( Vo – V1)xFx1.449 x 0.5 Vo: số ml chuẩn mẫu trắng V1: số ml chuẩn mẫu thử F: hệ số dung dịch D. Đo MV: xác định vi sinh vật và sinh lhối của vi sinh vật ở dạng thô. Tiến hành: căn cứ theo MV của lần kiểm tra trước hoặc mẫu kiểm tra mà tiến hành đo MV Nếu MV của lần kiểm tra trước cao hoặc dịch quá đặc, khó có thể nhận biết được thì tiến hành pha loãng mẫu. hút 10 ml dịch mẫu , ly tâm trong 10 phút ( 3000 vòng/ phút). Đo OD: xác định độ đục của mẫu, từ đó xác định mật độ vi sinh vật có trong dịch mẫu. Hút 1ml dịch mẫu, định mức tới 100ml và đo mẫu bằng máy đo quang ở bước sóng 660nm. 3.4.2.7. B.O Quá trình nuôi cấy kết thúc trong khoảng thời gian 68 – 72 giờ. Thời gian kết thúc quá trình nuôi cấy dựa vào : Dựa vào đường cong sinh trưỡng nuôi cấy vi sinh vật đã được thiết lập trong các thí nghiệm. Dựa vào kết quả phân tích TS, MV, OD của lần phân tích cuối để xác định thời điểm B.O. Thu nhận sản phẩm, tiến hành lấy mẫu phân tích và kiểm tra PH, TS, OD, MV. Tùy thuộc vào nhu cầu nuôi cấy mà sản phẩm được sấy khô, tinh chế , phục vụ nhu cầu sản xuất khác hoặc khử trùng xả bỏ. Lượng tế bào Pha cân bằng Pha lũy thừa Pha tiềm ẩn pha suy vong 68h 72h thời gian Hình 3.4.e – đường cong sinh trưỡng nuôi cấy vi sinh Thời điểm thu nhận sản phẩm có thể ở giai đoạn cuối của pha lũy thừa hoặc đầu hoặc giữa pha cân bằng. Tuy nhiên, nên B.O tại thời điểm cuối pha lũy thừa vì ở pha cân bằng ( tỉ lệ vi sinh vật sinh ra bằng với tỉ lệ sinh vật chết), số lượng vi sinh vật chết có thể gây ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm. CHƯƠNG 4 : SẢN PHẨM Sản phẩm Lysine được ứng dụng để bổ sung cho thức ăn gia súc, khẩu phần ăn và phổ biến nhất trên thị trường hiện nay là bổ sung vào các thực phẩm chức năng như sữa pedia plus, siro unikids … ngoài ra, sản phẩm Lysine còn được bổ sung vào cơ thể dưới dạng thuốc. Các sản phẩm ứng dụng sử dụng Lysine : Hình 4.a – Sản phẩm ứng dụng Lysine Sản phẩm của quá trình lên men trực tiếp tại công ty VeDan VietNam là L-Lysine dạng thô. Sau khi thu nhận sản phẩm L-Lysine thô, có thể tùy vào nhu cầu thực tế mà L-Lysine được sấy khô, hoặc chuyển qua tinh chế tại phân xưởng tinh chế Lysine. Tuy nhiên, do điều kiện hiện tại ở nước ta, nhất là vấn đề xử lý chất thải và sản phẩm phụ sau tinh chế gặp khó khăn nên hiện tại VeDan đã dừng nhà máy tinh chế Lysine, các sản phẩm L-Lysine thô sản suất hiện tại chủ yếu được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Tiến hành thí nghiệm trong điều kiện môi trường bổ sung dinh dưỡng khác nhau, lấy thí nghiệm trước làm tiền đề cho thí nghiệm sau. Từ đó xây dựng môi trường nuôi cấy tối ưu nhất và kinh tế nhất. Chủng vi sinh vật sử dụng trong nuôi cấy là chủng Corynebacterium glutamicum đột biến. Có khả năng tổng hợp lysine với mức độ cao nhất. Hàm lượng đường trong môi trường dinh dưỡng và môi trường bổ sung dinh dưỡng ảnh hưởng rất nhiều tới năng suất nuôi cấy. Khảo sát môi trường nuôi cấy thực nghiệm về các chỉ tiêu pH, nhiệt độ, áp suất, nồng độ ( tùy theo yêu cầu thực nghiệm môi trường nuôi cấy). Nhận thấy môi trường lên men tối ưu nhất : pH 6,8 – 7,2 ; pH duy trì trong quá trình nuôi cấy là 7,0 ; nhiệt độ 32 – 340C .. Môi trường FD bổ sung tốt và sản phẩm đạt chất lượng cao là đường Dextrose so với các loại rĩ đường khác. Tất cả các yếu tố đều ảnh hưởng tới năng suất của quá trình nuôi cấy. Trong suốt quá trình lên men, phải đảm bảo môi trường không nhiễm tạp khuẩn. Thường xuyên theo dõi và kiểm tra theo định kì. Khi môi trường nuôi cấy nhiễm tạp khuẩn hoặc vi sinh vật không sinh trưỡng phải tiến hành B.O ngay. 5.2. Kiến nghị Do thời gian thực tập tại công ty có hạn, vì vậy không cho phép tìm hiểu sâu về các số liệu thực tế tại công ty. Vì vậy các số liệu nêu trên đều mang tính khái quát chung về yêu cầu của một quy trình lên men sản xuất L - Lysine. Tuy nhiên qua thực nghiệm tại công ty, tôi đề nghị một số vấn đề trong quy trình nuôi cấy : Nhu cầu trên thị trường ngày càng cao, vì vậy sản phẩm Lysine phải được đa dạng hóa về mục đích sử dụng và chất lượng sản phẩm. Trong quá trình nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm, việc nhiễm tạp khuẩn bồn nuôi cấy lên men thường xảy ra. Trong trường hợp đó, bồn nuôi cấy sẽ được sát trùng và xả bỏ. Tuy nhiên, đó là nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm, nếu trường hợp nhiễm tạp khuẩn ở quy mô nuôi cấy công nghiệp thì thiệt hại rất lớn vì vậy : Nên tập trung phân tích những nguyên nhân dẫn tới việc nhiễm tạp khuẩn. Do thao tác của con người, thiết bị, nguyên vật liệu hay các yếu tố về môi trường tác động.v.v. . từ đó tìm cách khắc phục. Phân tích giống tạp khuẩn bị nhiễm, có trong môi trường hay từ bên ngoài đưa vào Phân tích môi trường dinh dưỡng của loại tạp khuẩn đó và tìm cách ức chế sự sinh trưỡng và phát triển của nó… Tại hai phòng cấy vi sinh của xưởng thực nghiệm, nên thiết kế hệ thống quạt gió tại cửa vào. Khuyến khích nhân viên tham gia cải tiến tại khu vực làm việc của mình, bắt đầu cải tiến từ những chi tiết nhỏ nhất như : sắp xếp dụng cụ, vị trí đặt dụng cụ thí nghiệm … nhằm giúp nhân viên thao tác thuận tiện và dễ dàng nhất. Trong suốt thời gian làm việc tại công ty, tất cả nhân viên hầu như thao tác rất thuần thục trong công việc. Tuy nhiên điều đó dẫn tới việc các nhân viên sẽ thao tác trong công việc không theo đúng trình tự. Chính vì điều này mà dẫn tới chất lượng của sản phẩm. Vì vậy, cần có một quy định bắt buộc về thao tác trong công việc bằng văn bản. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguỵễn đức Lượng – Công Nghệ Vi Sinh – Nhà xuất bản đại học quốc gia TPHCM, 2006 Nguyễn Xuân Thành – Giáo Trình Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp – Nhà xuất bản giáo dục, 2004 Lê Xuân Phương – Vi Sinh Vật Công Nghiệp – Nhà xuất bản xây dựng hà nội, 2000 www.vedan.com.vn