Nông nghiệp - Chương 5: Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng

tiva L. (châu Á), O. glaberrima (châu Phi) Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài hay khác loài phụ. Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai giữa loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale. 5.1.2. Các phƣơng pháp lai hữu tính a) Lai đơn (single cross) A x B Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA) hoặc A - B ( theo CIMMYT). b) Lai ba (three-way cross) (A x B) x C Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc A - B x C (theo CIMMYT). c) Lai kép (double cross) (A x B) (C x D) Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI) hoặc A – B x C- D ( theo CIMMYT). d) Lai đỉnh (topcross) Dòng 1 Dòng 2 Tester Dòng 3 * * * Dòng n Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 2 e) Lai dialen (dialen cross) A B C D A A x A A x B A x C A x D B B x A B x B B x C B x D C C x A C x B C x C C x D D D x A D x B D x C D x D Griffing (1956) đƣa ra 4 phƣơng pháp lai nhƣ sau: Phƣơng pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2 Phƣơng pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2 Phƣơng pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1) Phƣơng pháp 4: Lai một chiều không tự phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)/2 f) Lai thuận nghịch (reciprocal cross) A♀ x B♂ B♀ x A♂ Lai thuận Lai nghịch g) Lai trở lại (backcross) h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing- MAB) MAB có nhiều mức: Mức thứ nhất: chọn lọc các gen hay QTL điều khiển tính trạng có lợi, nhƣng tính trạng đó khó đánh giá dựa trên kiểu hình hoặc do gen lặn điều khiển. Giảm bớt các gen không mong muốn liên kết kéo theo trong quá trình lai trở lại. Mức thứ hai: sử dụng hai marker liên kết hai đầu của locus mục tiêu để chọn lọc phối hợp, tối thiểu gen kéo theo và yêu cầu quần thể lớn tùy thuộc vào khoảng cách của hai marker với locus mục tiêu. Yêu cầu này rất quan trọng khi thể cho (donor) là giống địa phƣơng. Mức thứ ba: chọn lọc nền di truyền, sử dụng marker không liên kết để chọn donor tƣơng phản, lấy lại nhanh genome của bố mẹ nhận gen. Sử dụng kỹ thuật này có thể tiết kiệm 2, 3 thậm chí 4 thế hệ lai trở lại. i) Lai hồi quy (Conservatative cross) j) Lai nhiều bậc (convergent cross) Alpha x Xaroza Albidum-24 x Liutexen55/11 Xaratopca-29 Beloturca x Potapca Hình 5.7. Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P. Sekhudin) Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 3 k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization) l) Lai quy tụ gen dựa trên marker phân tử (Marker-Assisted Gene Pyramiding) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1211 TGST ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1211 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1211 Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O. longistaminata Thời gian sinh trưởng ngắn Năng suất cao Kháng rầy nâu và bạc lá Lƣu ý: Để tiến hành đƣợc phƣơng pháp này, các nghiên cứu cần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line). Sau đó, các dòng NIL này đƣợc tiến hành lai với nhau. Chọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kết với các gen mong muốn để chọn. m) Lai tế bào soma (Somatic hybridization) Các bƣớc lai tế bào soma: Bƣớc 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của cây con, tinh sạch Bƣớc 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào lai Bƣớc 3: Tái sinh cây Bƣớc 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai tế bào soma 5.1.3. Kỹ thuật lai hữu tính a) Nguyên lý chọn cặp bố mẹ Nguyên lý 1: Chọn cặp bố mẹ dựa trên loại hình sinh thái và xa cách di truyền Nguyên lý 2: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng kết hợp Nguyên lý 3: Chọn cặp bố mẹ dựa trên khả năng chống chịu bệnh Nguyên lý 4: Chọn cặp bố mẹ dựa trên năng suất và yếu tố tạo thành năng suất Nguyên lý 5: Dựa trên chỉ thị phân tử chọn bố mẹ có các tính trạng mục tiêu. b) Gieo trồng, chăm sóc vƣờn cây bố mẹ và chọn cây bố mẹ Các dòng, giống bố mẹ đƣợc trồng ở ruộng riêng, có sơ đồ bố trí để thuận tiện cho công tác chăm sóc cũng nhƣ chọn cây để lai. Các kỹ thuật nhƣ thời vụ, phân bón, tƣới nƣớc và phòng trừ sâu bệnh cỏ dại tối ƣu đối với loài cây trồng để cây lai sinh trƣởng phát triển tốt, cơ quan sinh sản (hoa) phát triển hoàn chỉnh thuận tiện cho thao tác khử đực và thụ phấn. Bố trí thời điểm gieo bố và mẹ để bố mẹ nở hoa trùng nhau, trong trƣờng hợp bố mẹ lệch nhau có thể sử dụng kỹ thuật điều chỉnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất c) Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai Trƣớc khi thực hiện thao tác lai, cây lai cần đƣợc chọn kỹ và chuẩn bị chu đáo: cắt bỏ các cây không dùng cho lai, dọn sạch lá chết, lá vàng úa, cắt bỏ các hoa không khử đực là những hoa đã nở đầu, hoa cuối trên bông và cành hoa. Ví dụ, cây lúa đƣợc chọn làm vật liệu lai sẽ đƣợc đánh trồng trong chậu, cắt bỏ các bông thừa chỉ để lại từ 3 - 4 bông, dọn sạch lá chết. Tiến hành cắt bỏ các hoa đã nở và hoa non chỉ để lại khoảng 15 - 20 hoa thành thục để khử đực. Dụng cụ lai cần thiết gồm panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách li bằng giấy bóng kính, lọ mầu đen đựng hạt phấn, ghim, bút chì hoặc bút dầu viết trên bao cách li không bị phai Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 4 e) Thụ phấn và đánh dấu Thu hoa của cây bố tách bao phấn lấy phấn và thụ hoa mẹ đã đƣợc khử đực. Thu hoa bố trên các cây khỏa mạnh, không sâu bệnh và thời gian thu khi hoa nở rộ thƣờng vào buổi sáng. Một số loài cây phấn hoa dính để tách lấy phấn phải hong khô nhƣ cà chua, khoai tây. Những loài cây giao phấn, hoa đơn tính thì có thể thu nhận hạt phấn vào lọ tối sau đó thụ phấn cho từng hoa. Dùng panh gắp bao phấn đƣa lên đầu nhụy của hoa mẹ đã khử đực bóp nhẹ để bao phấn vỡ tung phấn lên đầu nhụy, dùng bút lông chấm vào cốc phấn rồi chấm lên đầu nhụy, đƣa phấn lên ngón tay hoặc vật phẳng rồi vít đầu nhụy chấm vào phấn bố Quá trình thụ phấn cần lặp lại vài lần để đảm bảo thụ phấn thành công. d) Khử đực và bao cách li Có 4 phƣơng pháp sau: Khử đực bằng tay: áp dụng với cây trồng có hoa đủ lớn, bộ phận đực và cái trong thời điểm khử đực phân biệt rõ ràng nhƣ lúa, cà chua, thuốc lá, đậu, vừng Khử đực bằng máy: máy hút chân không đƣợc sử dụng để khử đực ở lúa. Khử đực bằng hoá chất: các loài cây có hoa rất nhỏ (kê, rau dền, hành). Các hoá chất thƣờng dùng để khử đực có hiệu quả cao là các hydrazid của axit malic và ester thơm, sodium methyl arsenate, Maleic hydrazide, NAA, IAA, FW450, Ethrel, RH531, MSMA, ZMA. Khử đực bằng nƣớc nóng: Nhiệt độ và thời gian khử đực tuỳ thuộc vào loài cây trồng (lúa sử dụng nhiệt độ 430C trong 5 phút; lúa miến sử dụng nhiệt độ 47 - 480C trong 10 phút). Hình 5.13. Bao cách ly và ghi thông tin sau khi thụ phấn trong lai tạo giống lúa f) Chăm sóc và thu hoạch hạt lai Sau khi lai, cây lai phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để ngăn chặn kịp thời côn trùng và động vật phá hoại quả và hạt lai. Cây yếu cần đƣợc bón thêm phân kali hydrophotphat (KH2PO4) để hạt lai đƣợc chắc, sức sống cao. Hạt lai đã chín cần thu hoạch kịp thời, phơi khô vào bảo quản tránh mất sứ nảy mầm. Hạt lai bảo quản trong các túi ghi đầy đủ thông tin, cất trữ trong nhiệt độ thấp và khô để sử dụng trong giai đoạn tiếp theo của quá trình chọn tạo giống. 5.1.4. Lai xa a) Một số ứng dụng của lai xa Tạo ra loài mới: kết quả lai xa giữa lúa mì và lúa mạch đen, lƣỡng bội hoá nhiễm sắc thể của con lai F1 đã tạo ra loài mới triticale. Chọn tạo giống cây trồng mới Tạo biến dị mới, những tính trạng, đặc điểm mới mà dạng bố mẹ chƣa có. Tạo giống kháng bệnh và kháng sâu vào cây trồng Tạo giống cây trồng chống chịu với điều kiện bất thuận phi sinh học Tạo giống lai có ƣu thế lai cao Tạo dòng đơn bội, tạo con lai tế bào và đa dạng các loại bất dục tế bào chất Trƣờng hợp 2: Con lai không kết hạt (thu đƣợc hạt lai F1 nhƣng con lai F1 bất thụ) Nguyên nhân: Do bố mẹ sai khác quá lớn về di truyền và sinh lý; Hệ thống sinh sản của con lai bị phá vỡ. Biện pháp khắc phục: Kéo dài thời gian sinh trƣởng của con lai; Kỹ thuật canh tác và chăm sóc phù hợp; Xử lý đa bội thể. 7/18/15 5 b) Những khó khăn khi lai xa và biện pháp khắc phục Trƣờng hợp 1: Cây lai không kết hạt Nguyên nhân do: Môi trƣờng trên đầu nhụy hoa của cây mẹ không phù hợp cho hạt phấn nảy mầm. Ống phấn ngắn không thực hiện đƣợc quá trình thụ tinh hoặc khả năng xuyên của ống phấn phát triển chậm dẫn đến khi thụ tinh trứng đã mất sức sống. Sai khác quá lớn về di truyền không hình thành đƣợc hợp tử, phôi hoặc hình thành phôi nhƣng không phát triển hoặc tiêu biến. Biện pháp khắc phục: Thụ phấn bổ sung Lai trung gian Cứu phôi 5.2. ĐỘT BIẾN TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN 5.2.1. Khái niệm và ý nghĩa Đột biến là thuật ngữ chỉ sự thay đổi về vật chất di truyền của tế bào (gene và nhiễm sắc thể). Theo định nghĩa trong từ điển thuật ngữ khoa học cây trồng là sự thay đổi di truyền trong vật chất di truyền của tế bào, ở mức lớn hơn là phá vỡ hoặc sắp xếp lại bộ nhiễm sắc thể, đột biến có thể di truyền lại cho con cái ở các thế hệ sau. Hugo de Vries (1980) đƣa ra “Học thuyết đột biến” bao gồm những nội dung chính có ý nghĩa sau: (i)Đột biến xảy ra đột ngột, không qua bƣớc trung gian nào; (ii)Các dạng đột biến mới xuất hiện có thể hoàn toàn ổn định, bền vững; (iii)Đột biến tạo nên những biến đổi rời rạc, không tập trung; (iv)Đột biến xảy ra ngẫu nhiên, có thể có lợi hoặc có hại; (v)Sự xuất hiện đột biến phụ thuộc vào số lƣợng cá thể; (vi)Một đột biến có thể lặp lại nhiều lần. Bảng 5.1. Đột biến tạo giống thành công trên một số cây trồng ở Brazil Cây trồng Đặc điểm và tính trạng cải tiến Thuốc lá Kháng virus; khắc phục khó khăn khi lai xa khác loài Cam quýt Kiểu cây gọn, chín tuần tự, không hạt Đậu co ve Hàm lƣợng protein cao hơn; màu vở hạt mới, tập tính sinh trƣởng, kháng virus khảm vàng đậu Chuối Giảm chiều cao cây, chịu mặn Hoa cúc Màu sắc hoa mới, thấp cây, nhiều canh hoa hơn Lúa mỳ Kháng rỉ sắt thân; rỉ sắt lá; thân mềm; chín sớm; thấp cây; chống chịu chua phèn Lúa Thời gian chín ngắn; chín sớm; thấp cây; cải tiến chất lƣợng hạt Đậu tƣơng Lá hẹp, lá rộng, nhiều màu sắc, hạt to, chín sớm... Cà chua Quả ôvan; màu quả xanh đậm, chín chậm, giảm kích thƣớc cây, tăng độ Brix và giảm độ Brix... Ý nghĩa của đột biến: Tạo ra nguồn biến dị di truyền phong phú cho chọn giống. Đặc biệt là những tính trạng mong muốn mà nguồn biến dị tự nhiên không có. Có khả năng tạo ra giống mới, nhanh, ổn định, không phân ly, có nhiều đặc tính, tính trạng quý nhƣ chín sớm, không cảm quang (tám thơm đột biến), năng suất cao, chống chịu sâu bệnh, tăng hàm lƣợng protein, lipid, glucid trong sản phẩm; các dòng bất dục đực dùng trong tạo giống ƣu thế lai Có thể tạo ra các biến dị mới cho một số loài cây trồng sinh sản bằng con đƣờng vô tính hay nhóm cây sinh sản vô tính nhƣ đột biến khảm đƣợc ứng dụng trong tạo giống hoa cây cảnh. Làm mất đi mối liên kết cũ, xây dựng mối liên kết mới dẫn đến làm tăng khả năng tổ hợp của gen. Hạn chế của đột biến: Tạo biến dị không định hƣớng; Không xác định đƣợc vị trí, số lƣợng gene đột biến; Phần lớn các đột biến là những biến dị có hại, tỉ lệ biến dị có lợi thấp (10-6). Ngày nay, công nghệ gene có thể khắc phục đƣợc những khó khăn này. 5.2.2. Phân loại đột biến a) Đột biến ở mức phân tử ADN Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN đƣợc gọi là “đột biển điểm” hay “đột biến gen” ở nhiều mức khác nhau: Đột biến điểm (Point Mutation) là đột biến làm thay đổi một cặp cơ bản trên phân tử ADN, thay một nucleotide này bằng một nucleotide khác. Đột biến mất đoạn (Deletion mutation) là đột biến làm mất một hay nhiều hơn các nucleotide trên gen hoạch nhiễm sắc thể. Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) là đột biến lồng thêm ít nhất một nucleotide và chuỗi ADN. Ngoài ra còn có các đột biến tạo ra gen chức năng hoặc không có chức năng, đột biến gây ra sắp xếp ADN trở dạng hoang dại của chúng, đột biến phá vỡ gen quyết định dẫn đến gây chết cơ quan sông đang phát triển 7/18/15 6 b) Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể: Bao gồm thay đổi cấu trúc NST và số lƣợng NST Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn. Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể”. Mức độ thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể nhƣ tăng hay giảm số lƣợng nhiễm sắc thể tạo ra các thể đa bội, đơn bội hay lệch bội. Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể”. c. Đột biến thể khảm (Chimaras): Theo R. Daniel Lineberger: “Một cây đƣợc gọi là đột biến thể khảm khi các tế bào có trên một kiểu gen đƣợc tìm thấy ở các mô sinh trƣởng liền kề nhau của cây”. Các cây có đốm màu khác nhau có thể là dạng chung nhất để nhận biết đột biến thể khảm. Thể khảm có ý nghĩa quan trọng trong chọn tạo giống cây sinh sản vô tính, cây hoa, cây cảnh. Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm ra ở đỉnh sinh trƣởng phát triển ở các lớp khác nhau và phân thành 3 loại khảm chính là: Khảm từng phần Khảm quạt Khảm vòng. Hình 5.15. Hình thành và phát triển của khảm 5.2.3. Các tác nhân gây đột biến a) Tác nhân vật lý Tác nhân Đặc điểm Tia X Bƣớc sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ vài mm đến vài cm Tia Gamma (γ) Bƣớc sóng rất ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh hơn tia X nhƣng không mang điện nên chỉ có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện. Trong sinh học thƣờng sử dụng tia γ là đồng vị phóng xạ Co60 và Ce137 Neutron (nhanh, chậm, nhiệt) Tạo ra từ lò phản ứng nhiệt hạch, rất nguy hiểm, mức đâm xuyên mạnh. Tia alpha (α) Đƣợc hình thành từ hạt nhân của nguyên tử helium (He), gồm 2 proton và 2 nơtron. tia α có khả năng xuyên sâu 0,07mm trong mô sinh vật. Tia tử ngoại UV Bƣớc sóng 200 – 400nm (nanomet). Photon của tia UV có năng lƣợng thấp, không xuyên sâu nên không tác động đến tế bào nằm sâu trong cơ thể sinh vật nhƣng có tác dụng khi xử lý hạt phấn và noãn. Tần số gây đột biến của tia này khá cao vì bƣớc sóng của nó trùng với bƣớc sóng DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm). b) Tác nhân hoá học Trình tự tác động của các tác nhân hoá học: Trước hết, chúng đi vào các bộ phận tế bào, gây chấn thương ở mức phân tử; Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với các sản phẩm trung gian trong tế bào và cùng với sản phẩm của tương tác tác động vào ADN. Đây là giai đoạn tiền đột biến. Cuối cùng, các liên kết hoá học làm sai lệch thông tin đã gây ra đột biến. Các tác nhân gây đột biến gồm: Các chất oxy hoá khử và các gốc tự do: H2O2, HNO2, các aldehyd, các muối kim loại nặng. Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea (NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat (DES), dimethylsunphat (DMS), Các chất đồng đẳng của base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU), aminopurin, các hợp chất chứa halogen Các chất cảm ứng với base: ethylurethan, 5-aminouracin, teobromin Các chất nhóm acridin (C13H9N): proflavin đƣợc dùng nhiều trong nghiên cứu đột biến gene. Ngoài ra còn một số chất hóa học: H2S2O7, Na2CO3, Na3PO4, ... 7/18/15 7 c) Tác nhân sinh học: Virus là nhóm sinh học có thể mang gen lạ, xâm nhập vào cơ thể cây trồng để gây đột biến. Đây là một trong những công cụ của phƣơng pháp chuyển gen. 5.2.4. Vật liệu và phƣơng pháp xử lý đột biến a) Vật liệu xử lý là những bộ phận có khả năng hoạt động sống Các bộ phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ƣớt, mầm, bộ phận sinh dƣỡng, hạt phấn, tế bào, phôi, calus trong nuôi cấy mô. b) Phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất của các tia, liều lƣợng, loại hoá chất, nồng độ. Khi xử lý đột biến cần chú ý đến đặc tính sinh lý của cây, thời gian và bộ phận cây trồng đƣợc xử lý. Liều lƣợng và nồng độ hoá chất căn cứ vào liều lƣợng gây chết (lethal dose) - giá trị LD50. LD50 đƣợc xác định bằng nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân và vật liệu xử lý. Liều lƣợng xử lý bằng TNVL đƣợc đo bằng các đơn vị Rad, Kr hay Gray. Đơn vị tiêu chuẩn thống nhất là Gray viết tắt là Gy (Gray (Gy) = 1 Joule = 100rad, rad = 100erg/g vật chất), Nồng độ xử lý bằng tác nhân hóa học có đơn vị là mM hoặc ppm. Bảng 5.3. Liều lƣợng và thời gian xử lý đột biến đối với hạt lúa khô Tác nhân đột biến Liều lƣợng và thời gian xử lý Neutrons nhanh 3 - 8 Gy X-rays X-rays 95 - 250 Gy Tia gamma gamma rays 100 – 350 Gy MNH (MNU) MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – 5 h) ENH (ENU) ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - 5 h) EMS EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h) NaN3 NaN3 (0,5 – 2 mM) x (3-5 h) c) An toàn trong xử lý đột biến Phải tuân thủ các quy tắc, quy định an toàn và đảm bảo hiệu quả xử lý. Việt Nam đã ban hành luật “Luật năng lƣợng nguyên tử” năm 2008. Một số nguyên tắc cơ bản là: Phải có phòng thí nghiệm chuyên dụng đủ tiêu chuẩn an toàn, hoặc khu vực xử lý an toàn. Cán bộ thực hiện phải đƣợc đào tạo Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho ngƣời thực hiện Sau khi sử lý phải có phƣơng pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ hay độc tố mới đƣợc sử dụng Hình 5.16. Cánh đồng xử lý đột biến ở Viện Đột biến tạo giống (IRB) quốc gia Nhật Bản 5.2.5. Chọn lọc sau đột biến Vật liệu xử lý đột biến là thế hệ M0 đƣợc gieo trồng và thu hoạch gieo trồng M1 và thu hoặc trồng quần thể M2. Bắt đầu từ quần thể M2 phân thành hai khu chọn lọc, một khu vực tiếp tục chọn lọc các thế hệ phân ly, một khu vực khác đánh giá các dòng đã thuần để phát triển giống mới hoặc làm vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp tạo giống khác nhƣ lai, chuyển gen Chọn lọc sau đột biến đối với cây sinh sản sinh dƣỡng phân thành 2 nhóm, (i)Nhóm cây cần tách đột biến riêng rẽ ra khỏi thể khảm sử dụng nhân và ghép vô tính tạo thành các dòng vô tính ở thế hệ sau. Qua một số thế hệ chọn lọc đánh giá độ thuần và các đặc điểm nông sinh học khác để phát triển thành giống mới. (ii)Nhóm cây không cần tách đột biến ra khỏi thể khảm nhƣ hoa và cây cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vô tính phát triển thành giống mới. 7/18/15 8 Chọn lọc sau đột biến với cây sinh sản hữu tính: tƣơng tự nhƣ chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt là có thể chọn lọc một quả, một bông để hình thành dòng ở thế hệ sau mà không nhất thiết từ một cây hay một khóm nhƣ chọn lọc sau lai. Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ƣớc lƣợng độ lớn quần thể M1 theo Brock (1971). 1log(1 p )N log(1 )    Trong đó: N là số cá thể M1 sống sót để tạo gia đình M2; µ là tỉ lệ đột biến; p1 là xác suất ít nhất xảy ra một đột biến. Bảng 5.4. Yêu cầu số cá thể của gia đình M2 đảm bảo xuất hiện đột biến Tỉ lệ đột biến Số gia đình M2 p1 = 0,90 p1 = 0,99 10-2 233 465 10-3 2.326 5.652 10-4 23.260 46.520 10-5 232.600 465.200 5.3. ĐA BỘI THỂ 5.3.1. Khái niệm và ý nghĩa đa bội trong chọn giống Khái niệm: “Đa bội thể là những sinh vật trong tế bào sinh dƣỡng có số lƣợng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)”. - Một số dạng đa bội Bảng 5.5. Đa bội ở một số loài cây trồng Loài cây trồng Đơn bội (n) Đa bội Họ cà 6 hoặc 12 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108 Lúa nƣớc 12 24, 48 Cải bẹ 8, 9, 10 16, 18, 20 Mía 40 80, 120 Đặc điểm dạng đa bội Sinh trƣởng, phát triển mạnh hơn nên khả năng thích ứng tốt nhƣ cây chuối Thân lá to nên năng suất xanh cao Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n. Nhiều trƣờng hợp bất dục hoàn toàn Hàm lƣợng các chất cao nhƣ đƣờng, methol bạc hà Những điểm hạn chế ở cây đa bội Đa bội thể cao (6n, 8n) có hiện tƣợng sinh trƣởng phát triển không bình thƣờng, cây thấp đi do tế bào dầy không phát triển chiều dài. Hiện tƣợng bất dục khó khăn đối với lấy hạt. Trong trƣờng hợp nhân giống hữu tính, quá trình sản xuất hạt giống rất khó khăn 5.3.2. Phân loại đa bội thể a) Đa bội cùng nguồn (autopoly ploidy) Đa bội cùng nguồn hay còn đƣợc gọi là đồng nguyên đa bội, tự đa bội là hiện tƣợng đa bội thể đƣợc tạo nên từ bộ nhiễm sắc thể giống nhau của cùng một loài - Tam bội - Autotriploidy (3x) - Tứ bội - Autotetraploidy (4x) - Ngũ bội - Autopentaploidy (5x) - Lục bội - Autohexaploidy (6x) b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy) - Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2) - Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3) - Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4) Hình 5.17. Những con đƣờng chủ yếu hình thành đa bội 7/18/15 9 c. Đa bội lệch (aneuploid) Đa bội lệch là sự thay đổi bộ NST không bằng bội số mà từng NST riêng biệt Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST) Đa bội lệch đƣợc phát hiện ở nhiều loài cây trồng: lúa mì, ngô, cà chua, bông, thuốc lá Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống kém do mất cân bằng bộ NST, không phân bào đƣợc nên bất dục, không hoặc ít có giá trị trong chọn giống mà chỉ có thể sử dụng để xác định nhóm gen liên kết. 5.3.3. Phƣơng pháp tạo đa bội thể Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội có thể dùng tác nhân lí, hoá học... tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào đang phân chia dẫn đến phân chia không bình thƣờng và hình thành đa bội. Các phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp gây chấn thƣơng: có hiệu quả nhất ở cây họ cà. Phƣơng pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột. Phƣơng pháp hoá học: xử lý bằng chất colchicine, idol axetic axit, sunfamit... Phƣơng pháp tạo đa bội thể bằng colchicine (C22H25NO6) Colchicine là một chất hoá học đƣợc chiết từ cây (Colchicum autumnale) có nhiều ở vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể, màu trắng tan trong rƣợu và benzen, không tan trong nƣớc. Nồng độ và thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu và loài cây trồng, nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10 giờ. Một số loài cây trồng khi xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác nhƣ DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH3)2SO). Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trƣởng của cây trên đồng ruộng thời gian ngắn hơn và lặp lại một vài ngày. Sau khi xử lý phải rửa sạch bằng nƣớc vô trùng 30 phút Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào từng trƣờng hợp cụ thể Tiêm vào đỉnh sinh trƣởng Dùng bông thấm đặt lên đỉnh sinh trƣởng cây con khi lá mầm mở Nhúng đỉnh sinh trƣởng hoặc đỉnh rễ vào dung dịch colchicine Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trƣởng của cây con Tạo đa bội thể bằng lai Các thể đa bội có thể tiến hành lai với nhau nhƣ lai giữa dạng tứ bội (4n) và nhị bội (2n) tạo ra dạng tam bội (3n). Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công ở một số loài cây trồng nhƣ dƣa hấu tam bội, dâu tằm tam bội. Sử dụng các vật liệu đa bội theo các hƣớng sau: Chọn lọc sử dụng trực tiếp. Tạo giống lai làm vật liệu cho các tổ hợp lai. Khắc phục hiện tƣợng bất dục trong lai xa. 5.4. ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP 5.4.1. Khái niệm Đơn bội (Haploid) là thực vật có bộ nhiễm sắc thể n = 1 nhƣ một giao tử đực là hạt phấn hoặc giao tử cái là tế bào trứng. Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có bộ nhiễm sắc thể 2n giống hệt nhau do nhân lên từ bộ NST đơn bội và có thể hình thành từ tế bào trứng hoặc hạt phấn. Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) là một kiểu gen đƣợc đƣợc hình thành khi các tế bào đơn bội trải qua quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể. 5.4.2. Giá trị của cây đơn bội và đơn bội kép Để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng. Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro Đến nay, số lƣợng các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi và 34 họ thực vật hạt kín đã đƣợc tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn. H.H. Geiger và G.A. Gordillo (2010) cho rằng tiến bộ chủ yếu của dòng DH trong chọn tạo giống ngô lai là (i)biến di di truyền tối đa, (ii)đồng hợp hoàn toàn, (iii)nhanh thƣơng mại, (iv)đơn giản, (v)giảm chi phí (vi)(vi) tối ƣu cho ứng dụng marker. 7/18/15 10 5.4.3. Phƣơng pháp tạo đơn bội (Haploid) và đơn bội kép (DH) Phƣơng pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn Một số kỹ thuật tạo đơn bội nhƣ: Chiếu xạ hạt phấn Trì hoãn thụ phấn Sử dụng tế bào chất lạ hoặc tác nhân thụ phấn Lai xa Tạo đa phôi Ghép cây con Xử lý hóa chất Các bƣớc nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội: Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Bƣớc 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản Bƣớc 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Bƣớc 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất và đánh giá chọn lọc dòng. Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Kiểu gen là dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự do hoặc con lai F1 đƣợc chọn để trồng cây cho phấn. Bƣớc lựa chọn kiểu gen rất quan trọng, quyết định khả năng nuôi cấy thành công. Kiểu gen của mỗi loài cây trồng phản ứng khác nhau với nuôi cấy bao phấn. Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn ở lúa (Ozyza sativa L.) gặp khó khăn là khả năng tạo calus của hạt phấn rất thấp và sai khác lớn khi tái sinh cây Loài phụ Japonica khả năng tạo calus tốt hơn loài phụ Indica Kết quả nuối cấy tạo ra cây đơn bội, cây lƣỡng bội và cây tam bội, sau nuôi cấy tiến hành đánh giá và chọn lọc cây đơn bội. Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây Trồng và chăm sóc cây lấy bao phấn trong điều kiện phù hợp với loài, trong một số trƣờng hợp trồng trong nhà kính, nhà lƣới và trong chậu vại. Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy bao phấn trên môi trƣờng MS cơ bản, một số loài cây trên môi trƣờng N6 của Chu (1978). Môi trƣờng nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen. Ví dụ đối với lúa loài phụ Indica môi trƣờng N6 bổ sung thêm galactose (0,1M), lactose (0,1M), nƣớc dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), L- glutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) và các chất điều tiết sinh trƣởng Loài phụ Japonica môi trƣờng SK-I hiệu quả cao hơn. Môi trƣờng MS bổ sung thêm 2,4D và BAP hiệu quả đối nuôi cấy bao phấn cây họ thập tự. Các nhà khoa học Úc cho rằng môi trƣờng B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9% sucrose phù hợp cho cây họ đậu. Bƣớc 4: Thu nụ hoa, khử trùng và tách bao phấn nuôi cấy Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa khi bông vẫn trong bẹ lá đòng, khoảng cách giữa lá đòng và tai lá cuối cùng là 3cm). Sau khi thu hoa, phƣơng pháp nhuộm màu để xác định thời điểm nuôi cấy phù hợp, một số hóa chất nhuộm màu sử dụng nhƣ iron - alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol dichloride) với bao phấn cây họ cam quýt. Thu hoa khử trùng và bảo quản trong nhiệt độ thấp Sau khi bảo quản, tách bao phấn ra khỏi hoa đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy trên đĩa petri Số lƣợng nuôi cấy tùy theo loài, cơ sở vật chất. Bình quân số lƣợng bao phấn nuôi cấy trên mỗi đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy tổng số 100 bao phấn cho một kiểu gen. Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa trên môi trường MS hoặc N6 cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen. Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng và hóa chất khác (xem bước chuẩn bị môi trường). Điều kiện buồng nuôi cấy thường ở nhiệt độ 25 ± 1oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa). Một số loài cây trồng yêu cầu môi trường tạo calus và môi trường tái sinh cây khác nhau như: lúa sau khi tạo calus 3 tuần chuyển sang môi trường tái sinh cây là môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA (Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat và 15% CM. Điều kiện nuôi cấy giống như nuôi cấy tạo calus nhưng cường độ ánh sáng tăng lên 2000lux. 7/18/15 11 Bƣớc 6: Chuyển cây ra ngoài giá thể hoặc ngoài đất đánh giá chọn dòng Trồng cây tái sinh ra chậu chứa đất và dinh dƣỡng phù hợp, hoặc ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới đánh giá các đặc điểm nông sinh học và xác định độ bội. Ví dụ đối với lúa: xác định độ bội bằng xử lý đỉnh rễ trong dung dịch 8- hydroxyquinoline tại 18oC trong 3 giờ, cố định trong dung dịch ethanol-acetic axít (3:1 v/v) qua đêm và nhuộm màu bằng kỹ thuật Feulgen squash và quan sát trên kính hiển vi. Những tiến bộ trong khoa học đã có các thiết bị mới có thể xác định độ bội nhanh và tiết kiệm chi phí hơn nhƣ máy đo độ bội hoặc sử dụng marker phân tử. Phƣơng pháp 2: tạo đơn bội bằng kích tạo đơn bội tự nhiên Phƣơng pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn gọi là phƣơng pháp tạo đơn bội kép (DH) in vivo. Geiger (2009) đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô có kiểu gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer), cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định có phôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam bội. Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng thuần trong tạo giống ngô lai thƣơng mại. Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô đƣợc trình bày trong hình 5.20. Sau khi thu hạt đơn bội có thể lƣỡng bội hóa tạo dòng đơn bội kép ngay từ thế hệ đầu tiên. Hình 5.20. Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô băng Phƣơng pháp in vivo * Lƣỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép (DH): Phƣơng pháp lƣỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến nhất là sử dụng colchicine. Chất alkaloid này hoạt động cản trở quá trình phân chia tế bào và dẫn đến không giảm số lƣợng nhiễm sắc thể khi phân chia. Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sử dụng một số chất khác thay thế là thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide gas (Kato, 2002), nhƣng những chất thay thế này không phù hợp xử lý một số lƣợng lớn. 5.4.4. Ứng dụng của đơn bội và đơn bội kép trong cải tiến giống cây trồng Phƣơng pháp phát triển dòng thuần truyền thống bằng thụ phấn cƣỡng bức của chính cây đó (tự phối) qua 8 - 10 thế hệ thu đƣợc dòng thuần, tuy nhiên không thể tạo đồng hợp hoàn toàn. Tỉ lệ đồng hợp tăng qua các thế hệ tự thụ phấn. Giả sử lai 2 bố mẹ đồng hợp AA x aa thu đƣợc con lai F1 (Aa), bắt đầu từ F1 cho thụ phấn hoàn toàn tỉ lệ đồng hợp và dị hợp thu đƣợc qua các thế hệ nhƣ sau: Bảng 5.6. Tỉ lệ đồng hợp qua các thể hệ tự thụ phấn Thế hệ tự thụ phấn Tỉ lệ (%) Đồng hợp Dị hợp F1 100 F2 50 50 F3 75 25 F4 87,5 12,5 F5 93,75 6,25 F6 96,88 3,12 F7 98,44 1,56 F8 99,32 0,78 5.5. TẠO BIẾN DỊ BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Nuôi cấy mô tế bào tạo ra một lƣợng lớn biến dị di truyền ở các loài thực vật, những biến dị di truyền này có thể sử dụng trong các chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. Bằng chọn lọc in vitro các đột biến về đặc điểm nông sinh học có lợi, chống chịu mặn, hạn và chống chịu sâu bệnh có thể phân lập đƣợc trong một thời gian ngắn. Biến dị soma tạo thành giống mới thành công ở một số cây trồng nhƣ cải, lúa và cây trồng khác (S. Mohan Jain, 2001). 7/18/15 12 5.5.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trƣớc khi nuôi cấy mô in vitro Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế bào, một số thay đổi di truyền xảy ra và đƣợc tích luỹ trong các tế bào soma. Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây đƣợc tái sinh từ tế bào soma sẽ là các đột biến. Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thƣờng của hạt và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo ra sản phẩm đột biến. Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt các loại biến dị dƣới đây: Biến dị dòng tế bào mô sẹo (calusoclonal variation): khi cây biến dị tái sinh từ mô sẹo (calus). Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - khi cây biến dị tái sinh từ tế bào trần. Những biến dị di truyền xảy ra và đƣợc phát hiện trong quá trình nuôi cấy in vitro gọi chung là đột biến dòng tế bào. 5.5.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro Auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy. Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến do các chất đột biến gây ra. Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen. Thay đổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là đa bội thể. Đột biến tế bào soma xảy ra ở các gen trong tế bào chất (ty thể và lục lạp). Đột biến tế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều cây trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì. 5.5.3. Ứng dụng của biến dị tế bào soma Biến dị và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro cung cấp một số lƣợng lớn biến dị và có thể ứng dụng rất đa dạng: Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, Ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra. Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo đƣợc giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý các điều kiện cực đoan từ một giống lúa không có khả năng chống chịu. 5.6. TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN Ứng dụng công nghệ gen tạo biến dị di truyền ở mức phân tử ADN, locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay từng gen, sau đây gọi chung là kỹ nghệ di truyền. Chuyển gen là một kỹ nghệ di truyền và là một công cụ mới bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài cây trồng mong muốn. Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen, một số gen hay một QTL mà phƣơng pháp truyền thống rất khó thực hiện. Khái niệm cây trồng chuyển gen theo J. Machex (1997): “Cây trồng chuyển gen là cây đƣợc chuyển một hay nhiều gen mới từ đó ta thu đƣợc thêm một hay nhiều đặc điểm mới. Các gen đƣợc chuyển vào cây không phải bằng con đƣờng lai hữu tính giữa hai bố mẹ mà đƣợc chuyển bằng kỹ thuật di truyền”. 5.6.1. Chuyển gen trực tiếp Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp các gen đã đƣợc thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ giới. Chuyển gen trực tiếp sử dụng một số kỹ thuật sau: a) Chuyển gen bằng xung điện Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh. Khi các tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi. Sự thay đổi này kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng hình thành lỗ hổng. Một loạt các lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế bào gắn vào bộ máy di truyền. Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh cây và đánh giá cây chuyển gen. Một tế bào thực vật có thể tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon) PEG là một phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất này ngƣời ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi cùng với phân tử PEG và tế bào trần. Các ADN bị hút vào các đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau đó PEG bị tế bào trần hút về phía nó. Các ADN trên đầu PEG đi vào tế bào trần theo cơ chế nuốt amip. Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tƣợng đầu tiên đƣợc sử dụng cho chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của PEG. Nhƣợc điểm lớn nhất khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng xung điện và nhờ xử lý PEG là việc tái sinh cây hữu thụ tốn rất nhiều thời gian, công sức mà kết quả phụ thuộc vào kiểu gen của loài cây trồng. Ngoài ra, vấn đề về các biến dị soma, có nhiều bản sao gắn trong hệ gen, tái sinh cây bạch tạng là những trở ngại cho việc chuyển gen khi sử dụng hai phƣơng pháp này ở cây hoà thảo (cây lúa). 7/18/15 13 c) Chuyển gen bằng vi tiêm Ngƣời ta sử dụng vi kim và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào trần hay tế bào nguyên. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣợc đƣa vào tế bào một cách chính xác. Phƣơng pháp này cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị. Vật liệu chuyển gen là tế bào trần, hoặc qua ống phấn. Khi hạt phấn rơi trên đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn sẽ nảy mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm ADN mong muốn đã tách đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái, ADN cần chuyển kết hợp hình thành hợp tử có mang gen cần chuyển. Phƣơng pháp này khá thành công trên cây lúa và cây bông, tuy nhiên hạn chế của phƣơng pháp là kỹ thuật cao và tốn kém. d) Chuyển gen bằng bắn gen Lịch sử và thành tựu chuyển gen bằng bắn gen: Phƣơng pháp chuyển gen bằng bắn gen đƣợc Klein T.M., Wolf E.D. và Sanford J.C công bố lần đầu tiên năm 1987 với tiêu đề vi đạn tốc độ cao đƣa nucleic axít vào tế bào sống đăng trên tạp chí Nature số 327. Các nhà khoa học sử dụng hạt tungsten có kích thƣớc nhỏ, khối lƣợng phân tử lớn, bay với vận tốc nhanh khi xuyên qua thành và màng tế bào không gây chết tế bào sống. Các tác giả cho rằng phƣơng pháp này có thể khắc phục những khó khăn của phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vì phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn bị hạn chế phạm vi ký chủ. Nguyên lý chung chuyển gen bằng bắn gen: Thiết kế vector mang ADN cần chuyển, kết tủa ADN lên bề mặt vi đạn, sử dụng áp lực khí He (helium) bắn vi đạn bay đi xuyên qua mô tế bào. Các ADN trên bề mặt vi đạn đƣợc giữ lại trong mô tế bào và gắn vào bộ máy di truyền, tái sinh cây và đánh giá tế bào và cây chuyển gen. Vi đạn là các loại vi đạn là vàng, tungsten (Wolfram). Vật liệu sử dụng chuyển gen bằng bắn gen: Vật liệu sử dụng bắn chuyển gen có thể là mô tế bào, phôi, mô hạt, calus tế bào huyền phù trong nuôi cấy mô tế bào. Các bƣớc chuyển gen bằng bắn gen gồm: chọn kiểu gen, tách mô, thiết kế vector chuyển gen, xử lý mô, thiết kế quá trình bắn gen (kết tủa ADN trên bề mặt vi đạn, nuôi cấy tạo mô chuyển gen, nạp đạn và vi đạn), tái sinh cây, đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen. Hình 5.21. Sơ đồ các bƣớc bắn gen vào mô thực vật Bƣớc 1: Chọn kiểu gen và tách mô Kiểu gen sử dụng chuyển gen là dòng, giống ƣu tú cần cải tiến một hoặc một số tính trạng nào đó. Tách mô và khử trùng đƣa vào nuôi cấy in vitro tạo vật liệu chuyển gen. Ví dụ, chuyển gen CBF3 biểu hiện tăng cƣờng tính chịu lạnh, chịu mặn và chịu hạn ở cây Arabidopsis, thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và lúa mỳ (Triticum aestivum L.) vào ngô bằng hạt cho nảy mầm trên môi trƣờng MS + vitamin B5 bổ sung thêm 9 µmol L –1 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid, Sigma, St. Louis, MO) trong 3 đến 4 ngày. Bƣớc 2: Chuẩn bị vector chuyển gen Cấu trúc mang gen có nhiều loại khác nhau gọi là vector chuyển gen. Vector chuyển gen là plamid một phân tử ADN mạch đôi dạng vòng có kích thƣớc 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). Ví dụ: vector chuyển gen vào mô hạt ngô của Diaa Al-Abed và cs. năm 2007. Plasmid pC1301 mang vùng không phiên mã intron ß- glucuronuridase (GUS) của Australia (Black Mountain, ACT, Australia). The GUS intron sử dụng để kiểm tra nhanh và xác định điều kiện biểu hiện trong bao mầm và mô phân sinh chồi. ADN cần chuyển đƣợc gắn vào vector trƣớc khi kết tủa lên bề mặt vi đạn. Mỗi loài cây trồng, vật liệu chuyển gen thiết kế vector chuyển gen phù hợp có ý nghĩa quan trọng để bắn gen thành công. 7/18/15 14 Bƣớc 4: Chọn lọc và tái sinh cây Xác định kết quả chuyển gen đối với vector gắn GUS có thể nhận biết mô chuyển gen thành công nhờ sử dụng nhuộm màu trong dung dịch X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid) sau bắn gen 48 giờ và quan sát trên kính hiển vi. Các mô xác định chuyển gen thành công chuyển vào môi trƣờng nuôi cấy để tái sinh cây. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tùy thuộc loài cây trồng. Ví dụ đối với nuôi cấy mô ngô chuyển gen trên môi trƣờng MSI trong 4 ngày, nhiệt độ 26oC và điều kiện ánh sáng 16/8 giờ sáng/tối, tiếp theo chuyển sang môi trƣờng MSI chọn lọc bổ sung thêm 25 mg/l hygromycin, thay môi trƣờng sạch hai tuần một lần trƣớc khi chuyển sang môi trƣờng tạo rễ là môi trƣờng MS có chứa 3,2 μmol/ L NAA (1-naphthaleneacetic acid), bổ sung thêm 10 mg/ l hygromycin trƣớc khi chuyển ra ngoài giá thể và ngoài đất. Bƣớc 3: Bắn gen Thiết kế bắn gen cần quan tâm đến các điều kiện nâng cao hiệu quả của bắn gen nhƣ: áp lực khí He Theo nghiên cứu của Diaa Al-Abed và cs. (2007) áp lực khí He là 10,69 MPa hiệu quả nhất Theo Elina Helenius và cs. (1996) kết quả tối ƣu nhất với Arabidopsis là 75psi, nhƣng tối ƣu với thuốc lá và bạch dƣơng là 200psi. Kích thƣớc vi đạn vàng tối ƣu là 0,6µm và lƣợng ADN trên vi đạn là 1 µg tối ƣu cho cả 3 cây. Khoảng cách từ súng bắn gen đến mô từ 6 – 9cm là phù hợp. Bƣớc 5: Trồng đánh giá và chọn lọc cây chuyển gen Cây chuyển gen đƣợc chuyển ra giá thể tiếp nhận, khi cây khỏe mạnh chuyển ra ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới, nhân cây và đánh giá. Trên cơ sở gen chuyển để thiết kế thí nghiệm đánh giá. Thí nghiệm đánh giá cây chuyển gen kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo, chống chịu bất thuận bằng gây bất thuận nhân tạo... Ngày nay nhờ marker phân tử, có thể đánh giá và nhận biết cây chuyển gen nhanh và chính xác hơn. Một số hạn chế của phƣơng pháp là các mô bị phá huỷ dẫn tới khả năng phục hồi và khả năng tái sinh thấp, khả năng tái sinh ra những cây không hoàn chỉnh, nhiều bản sao đƣợc chuyển vào trong tế bào gây khó khăn cho việc phân tích, hiệu quả chuyển gen thấp. 5.6.2. Chuyển gen gián tiếp Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp là gen đƣợc chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thƣờng là vi khuẩn hoặc virus. * Chuyển gen nhờ virus: Virus cũng đƣợc coi là một vectơ trong chuyển gen thực vật. Tiêu chuẩn để virus làm vectơ chuyển gen: Có cấu trúc ADN Không gây hại hoặc có độ gây hại thấp Có phổ ký chủ rộng Có khả năng mang gen Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào. Có hai loại virus đảm nhận vai trò làm vectơ chuyển gen là: Caulifower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải Geninivirus: nhóm virus này gây hại trên phổ ký chủ rộng (cây 1 lá mầm và cây 2 lá mầm). * Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium: Hai chủng đƣợc sử dụng phổ biến để chuyển gen là A. tumefaciens và A. rhizogenes. Những nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào cây Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. đầu tiên của các nhà nghiên An, G. và cs. (1986), Lloyd, A. và cs. (1986), Sheikholeslam, S. N. & Weeks, D. P. (1987). Đến nay phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn thành công ở hầu hết các loài cây trồng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng Nguyên lý của phƣơng pháp: dựa trên hiện tƣợng nhóm vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật gọi là Ti-plasmid nhƣ mô tả trong hình 5.23. Ghi chú:(a) Ti- plamid chứa T-DNA ở vai phải (RB) và vai trái (LB), trong vùng phiên mã của virulence (vir); (b) Các T-DNA khoảng 25bp lặp lại và cung cấp điểm tiếp hợp để cắt DNA của endonuclease VirD2–VirD1. Nó cắt giữa nucleotides thứ ba và thứ tƣ của trình tự hai vai; (c) Bản sao của T-DNA phóng thích phân tử DNA sợi đơn (T-strand) có phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’. Chuỗi còn lại của T- DNA có chức năng sinh học không dài, thƣờng sử dụng nhƣ điểm định hƣớng và toàn vẹn của T-DNA trong tế bào thực vật; T- DNA tổ hợp vào bộ genome của ký chủ; (d) độ dài đầy đủ của sợi đơn; (e) phân tử T- DNA bị cắt; (f) nhân bản phân tử T-DNA. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 15 Cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thƣơng tạo thành khối u, khối u tiếp tục phát triển khi không có mặt của vi khuẩn do nó đã truyền một đoạn ADN của Ti-plasmid (T-ADN) vào bộ gen của cây. Ti-plasmid là ADN mạch vòng kép có cấu trúc đƣợc chia thành bốn vùng chính gồm hai vùng tác động trực tiếp đến sự hình thành khối u là vùng T-ADN và vùng vir, hai vùng còn lại có chức năng của quá trình tiếp hợp và tái bản Ti-plasmid của vi khuẩn. Trong đoạn T-ADN gắn vào bộ gen có chứa ít nhất 3 gen tổng hợp các phytohormon auxin và cytokinin nên liên quan đến việc sản sinh hay duy trì sự phân chia tế bào liên tục tạo thành các khối u ở cây trồng. Quá trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào trải qua 10 bƣớc là: Bƣớc 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật; Bƣớc 2 và 3: kích thích sự biểu hiện của vùng vir bằng tín hiệu đặc thù của ký chủ; Bƣớc 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động của protein VirD1 và VirD2; Bƣớc 5: tế bào vi khuẩn tồn tại T-DNA nhƣ một phức hợp protein ADN với một phân tử VirD2 gắn ở đầu 5’ của T-strand và có một số protein vir khác chuyển vào tế bào ký chủ bằng hệ thống VirB/D4, mỗi bƣớc yêu cầu có tƣơng tác của T-pilus với 1 protein đặc thù của ký chủ; Bƣớc 6: bên trong tế bào chất của tế bào ký chủ T-DNA tồn tại một chút T- complex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ là một số phân tử VirE2. Những phân tử này là T-DNA cấu trúc và protein cần thiết cho vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, đây là bƣớc chính trong quá trình biến nạp di truyền; Bƣớc 7: thâm nhập vào nhân; Bƣớc 8: vận chuyển trong nhân; Bƣớc 9: T- DNA không vỏ bọc; Bƣớc 10: hòa hợp với di truyền ký chủ. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc vào một số yếu tố liên quan đến vi khuẩn và thực vật. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: Chủng vi khuẩn, Mật độ vi khuẩn, Thời gian lây nhiễm, Hoạt tính của gen vir, Khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ. Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm: Loại cây, kiểu gen, Dạng mẫu mô, Khả năng phân bào của các tế bào đích và TP môi trƣờng Các bƣớc chuyển gen nhờ vi khuẩn Bƣớc 1: Tách và nhân vi khuẩn Vi khuẩn A. tumefaciens là vi khuẩn gram âm trong đất (hình 5.24), phân lập và nuôi cây nhân vi khuẩn là bƣớc đầu tiên phục vụ công việc chuyển gen. Nuôi cấy, nhân vi khuẩn thông thƣờng trên môi trƣờng L-broth (LB), trong điều kiện 28oC, máy lắc 200 vòng phút, bổ sung kháng sinh phù hợp từ 8-12 giờ. Kháng sinh bổ sung trong nuôi nhân vi khuẩn, thƣờng là kanamycin nồng độ 50 mg/ml, carbenicillin nồng độ 50 hoặc 100 mg/ml, và tetracycline nồng độ 2 mg/ml. Sau khi nhân tách dịch khuẩn bằng ly tâm và nhân vi khuẩn để sử dụng chuyển gen. Hình 5.24. Vi khuẩn A.tumefaciens Bƣớc 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti - plamid của vi khuẩn Các kỹ thuật chủ yếu của bƣớc này là tách ADN cần chuyển bằng ezime, tách Ti - plamid của vi khuẩn và cắt đoạn ADN tƣơng ứng tại vị trí nhân gen của plamid (Multiple cloning site - MCS). Đƣa DNA và Ti - plamid đã cắt đoạn tƣơng ứng và enzyme T4 - Ligase vào môi trƣờng đệm T4 để nối ghép DNA với Ti - plamid trong điều kiện nhiệt độ thấp qua đêm, kết quả thu đƣợc Ti - plamid đã gắn gen DNA cần chuyển dạng vòng. Bƣớc tiếp theo kiểm tra Ti - plamid trên E.coli xác định các Ti - plamid chuẩn đƣợc tách chuyển vào vi khuẩn A. tumefaciens, bƣớc tiếp theo lây nhiễm vào mô, tế bào thực vật chuyển gen. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/ 7/18/15 16 Hình 5.25. Vị trí nhân gen của Ti-plamid vi khuẩn A. tumefaciens Bước 3: Tách mô chuyển gen Vật liệu chuyển gen nhờ vị khuẩn có thể bằng đĩa lá, mô, calus, mô hạt được tách từ kiểu gen mong muốn cần chuyển gen, khử trùng, đưa lên môi trường nuôi cấy in vitro. Chuyển gen vào mô hạt khá phổ biến ở nhiều loài cây trồng như lúa, ngô, cây họ thập tự. Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn đã gắn plamid vào mô tế bào Lây nhiễm để chuyển gen bằng trộn vi khuẩn với vật liệu nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, môi trường chọn lọc là môi trường có kháng sinh. Những tế bào nhận gen chuyển đồng thời nhận được cả promoter và gen kháng kháng sinh sẽ sống sót các tế bào khác bị chết trên môi trường chọn lọc. Những tế bào nhận gen sống sót phát triển thành calus và đưa sang môi trường tái sinh cây. Bƣớc 5: Tái sinh cây chuyển gen Môi trƣờng tái sinh cây là môi trƣờng cơ bản MS, có cải tiến đặc thù với mỗi loài cây trồng bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trƣởng, vitamin và các hợp chất hữu cơ khác. Sau khi tái sinh cây in vitro chuyển cây ra giá thể tiếp nhận hoặc ngoài đất, nhân cây và đánh giá cây chuyển gen. Bảng 5.7. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen nhờ A. tumafaciens (Theo Sambrook và cs., 1989; Frame và cs., 2002) Thành phần LBa IM CCM ReM SeM RM N6/MS - N6 N6 N6 N6 MS Sucrose (g/l) - 30 20 20 20 20 Glucose (g/l) - 60 10 10 10 L-proline (g/l) - 0,7 0,7 0,7 MES (g/l) - 0,5 0,5 2,4-D (mg/l) - 2 2 1 pH 7,0 5,2 5,8 5,8 5,8 5,8 Phytagel (g/l) - 3 3 3 3 AgNO3 (1mg/l) - 0,85 0,85 0,85 AS (mM) - 200 200 Cefotaxime (mg/l) - 250 250 250 Myo-inositol (g/l) - 1 Paromycin (mg/l) - 100 100 Hóa chất khác Cao nấm men: 5g; Trypton: 10g; NaCl: 10g; Agar 15g Bước 6: Đánh giá cây chuyển gen Đánh giá cây chuyển gen thực hiện bằng các thí nghiệm đồng ruộng, thí nghiệm đánh giá trong nhà kính, nhà lưới. Thí nghiệm đánh giá kiểu hình kết hợp với marker phân tử để đánh giá nhanh và chính xác hơn. Cây trồng biến đổi gen trước khi đưa ra sản xuất đại trà cần được đánh giá rủi ro về an toàn sinh học, an toàn với sức khoẻ con người và an toàn với môi trường. Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/