Nhân giống dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào - Đặng Ngọc Hùng

Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 47 NHÂN GIỐNG DÒNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Đặng Ngọc Hùng1*, Lê Đình Khả2 1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 2Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Nghiên cứu nhân giống dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (Eucalyptus Urophylla và E. exserta) bao gồm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng HgCL2 và Ca(OCL)2 thấy rằng với HgCl2 nồng độ 0,1% trong 10 phút có kết quả tốt nhất ở cả hai dòng. Kết quả khử trùng đạt được là cao nhất có mẫu sống UE35:12,53- 15,76 và UE56:13,10-16,05. Môi trường thí nghiệm nhân chồi nách cây Bạch đàn là: Litvay; WPM; MS*; MS; WV3 kết quả là môi trường MS* là môi trường có số chồi sống và hệ số nảy chồi tốt nhất so 4 loại môi trường còn lại với các chỉ tiêu lần lượt dòng UE35 là 213 chồi, HSNC 1,18 và UE56 là 211 chồi; HSNC 1,17 lần. Chất kích thích sinh trưởng được bổ sung là BAP; NAA; IAA; Kinetin. Kết quả thấy rằng BAP+ NAA+Kinetin có tác dụng nhân nhanh chồi tốt hơn sử dụng riêng BAP hay Kinetin là: BAP 2.0mg/l+ NAA 1.0 + Kinetine 0,5mg/l UE35; 1,0 mg/l UE56, bổ sung Kinetin nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l chồi sinh trưởng tốt, lá có mầu xanh non. Ra rễ thích hợp cho UE35 và UE56 là sự kết hợp IBA 2,0 mg/l + ABT1 0,5 ng/l dòng UE35 (tỷ lệ chồi ra rễ đạt 82,2%; số rễ trung bình 2,58; chiều dài trung bình của rễ là 1,29; dòng UE56 tỷ lệ chồi ra rễ đạt 81,7%, số rễ trung bình là 2,59 rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ là 1,16, đầu rễ trắng, mập và đều. Từ khóa: Bạch đàn, nhân giống, nuôi cấy mô tế bào, nảy chồi, B5, chất kích thích nhân nhanh, chất kích thích ra rễ, dòng UE35 và UE56 ĐẶT VẤN ĐỀ* Ứng dụng của công nghệ tế bào trong nhân giống cây rừng ngày càng rộng rãi. Nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được coi là giải pháp khoa học có hiệu quả trong nhân giống cây rừng. Bằng kỹ thuật nhân giống vô tính, ngoài việc tạo ra số lượng lớn cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt mà vẫn giữ được những đặc tính di truyền quý hiếm, đáp ứng tốt nhu cầu phát triển và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đất rừng. Trong những năm gần đây Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện nghiên cứu lâm nghiệp Việt Nam đã tạo ra hàng loạt tổ hợp lai giữa các loài Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla), Bạch đàn caman (E. camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta). Khảo nghiệm tại một số lập địa đã thấy nhiều tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh gấp 1,5 – 2 lần, thậm chí một số tổ hợp lai có thể gấp 3-4 giống bố mẹ lần [3]. Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có quyết định số 4356 (ngày * Tel: 0973-555-249; Email: hungtuaf@gmail.com 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U29E1, U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 [3,4]. Qua khảo nghiệm một số năm đã thấy các tổ hợp trên đều có một số dòng có năng suất cao như tổ hợp lai U29E2 và U29E4. Dòng UE35 là giống được nhân từ cây trội số 101 và được công nhận giống của U29E2, là dòng có sinh trưởng trung bình khá tại Tam Thanh (Phú Thọ). Dòng UE56 là giống được nhân từ cây trội số 27 của dòng U29E4 song chưa được đưa vào khảo nghiệm [6]. Nhân giống bằng nuôi cấy mô cho các dòng cây lai này là một trong những khâu quan trọng để tạo đủ giống có số lượng đủ lớn cho các khảo nghiệm trên hiện trường, tuy nhiên các giống mới này chưa hoặc mới đang trong quá trình đưa vào sản xuất. Để rút ngắn thời gian ứng dụng kết quả chọn giống, nhanh chóng đưa các giống mới có năng suất cao vào trồng rừng sản xuất, việc nghiên cứu công nghệ nhân nhanh một số giống Bạch đàn có năng suất cao đảm bảo tính khoa học, hiện đại và đáp ứng được mục tiêu trồng rừng sản xuất trên diện rộng lá hết sức cần thiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 48 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là mẫu xử lý từ chồi đỉnh và chồi bên của cây đầu dòng UE35 và UE56. Đây là những cây lai đã được chọn lọc trong các tổ hợp lai giữa Eucalyptus urophylla x E. exserta). Địa điểm nuôi cấy Các thí nghiệm thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào Thực vật-Viện Khoa học Sự sống- Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Điều kiện nuôi cấy: Các thí nghiệm được tiến hành trong phòng vô trùng, nhiệt độ nuôi cấy trong phòng là 250 (± 2), độ ẩm không khí 60-70% và cường độ ánh sáng nuôi cấy là 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày [2]. Nội dung và phương pháp nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1% và Ca(OCL)2 đối với 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56, 180 mẫu/công thức/3 lần nhắc lại. sau 20 ngày đo đếm. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1% và Ca(OCL)2 đối với 2 dòng Bạch đàn lai UE35 180 mẫu/công thức/3 lần nhắc lại. Sau 20 ngày đo đếm. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 0,1% và Ca(OCL)2 đối với 2 dòng Bạch đàn lai UE56 180 mẫu/công thức/3 lần nhắc lại. Sau 20 ngày đo đếm Chỉ tiêu theo dõi: Chồi sống, chồi nẩy mầm Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ sống của 2 dòng Bạch đàn lai UE. Tổng số 180 mẫu/CT/3 lần nhắc lại/môi trường, sau 25 ngày đo đếm. Thí nghiệm 1: Thời gian được thay đổi và kết hợp với môi trường tốt nhất (đã được tìm ra ở nội dung 1). Thí nghiệm bao gồm 6 công thức: CT1: tháng 1-3, CT2:4-6; CT3:7- 9; CT4:10-12. Sau 20 ngày nuôi cấy theo dõi và đo đếm số liệu: Chồi sống, chồi nhiễm, chồi chết. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Bạch đàn dòng UE 35 và UE56. Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng là: 6-benzyl aminopurine (BAP), Kinetin (KI), α- napthylacetic (NAA), idole- buteric acid (IAA) [2;3]; với pH= 5,6 trước khi hấp khử trùng môi trường. Sau 25 ngày theo dõi và đo đếm. Ở giai đoạn nhân nhanh chồi, môi trường nuôi cấy với là môi trường MS* +30g Sucrose /l+ 5,5g agar/l có bổ sung các chất các vitamine B5. Các chỉ tiêu theo dõi trong giai đoạn này sau 25 ngày: Hệ số nhân chồi; số cặp lá/chồi; chiều cao chồi; tỷ lệ sống. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của của BAP đến khả năng nhân chồi Bạch đàn Thí nghiệm bố trí với 5 công thức (CT) từ CT1 đến CT6 với các nồng độ của BAP cho một lít môi trường là: CT1: 0mg; CT2: 1mg; CT3: 2mg; CT4: 3mg; CT5: 4mg trên 1 lít môi trường nuôi cấy. Các chỉ tiêu theo dõi trong giai đoạn này (sau 25 ngày): Hệ số nhân chồi; số cặp lá/chồi; chiều cao chồi; tỷ lệ sống. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của của BAP+NAA đến nhân nhanh Bạch đàn UE. Thí nghiệm bố trí sau khi đã tìm được nồng độ BAP tốt nhất sau đó kết hợp với IAA nồng độ được thay đổi với 5 công thức (CT) từ CT1 đến CT5, các nồng độ của IAA là: CT1: 0mg; CT2: 0,5mg; CT3: 1mg; CT4: 1,5mg; CT5: 2mg trên 1 lít môi trường nuôi cấy. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP+NAA+Kinetin (KI) đến nhân nhanh Bạch đàn UE. Thí nghiệm gồm 5 công thức (CT) từ CT1 đến CT5 tổ hợp của Cytokinin (BAP+NAA+Kinetin) tốt nhất sẽ kết hợp với các nồng độ của KI thay đổi cho một lít môi trường là: CT1: 0mg; CT2: 0,5mg; CT3: 1 mg; CT4: 1,5mg; CT5: 2.0mg trên 1 lít môi trường nuôi cấy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 49 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng chất k ích thích ra rễ đối dòng Bạch đàn UE35 và UE56 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA+ABT1; Thí nghiệm bố trí với 5 công thức (CT) từ CT1 đến CT5 nồng độ của IBA tốt nhất sẽ kết hợp với các nồng độ của ABT1 (là một loại Auxin khác để xem khả năng kết hợp giữa chung và tìm ra nồng độ tốt nhât là: CT1: 0mg; CT2: 0,5 mg; CT3: 1.0g; CT4: 1.5mg; CT5: 2.0mg trên 1 lít môi trường nuôi cấy. Sau 15 ngày theo dõi và đo đếm. Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel [7]. - Tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel. - Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố theo phần mềm SPSS 11.5. Tiêu chuẩn Duncan được dùng để phân nhóm và tìm công thức thí nghiệm tốt nhất là: Giả thiết H0: nhân tố A có tác động một cách đồng đều (ngẫu nhiên) đến kết quả thí nghiệm khi đó: α1= α2=...= αa = 0 hoặc µ1= µ2 = ..= µa = µ Giả thiết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các cấp khi đó có ít nhất là có một αi ≠ 0. Nếu giá trị Sig của F< 0,05 thì chấp nhận H0. Sig của F > 0,05 thì chấp nhận H1 với: n A Va VanF )1( )( − − = Trong đó: - VA: là biến động giữa các trị số trung bình mẫu: cxnVVV a i iiNTA −=−= ∑ =1 2 - VT là biến động toàn bộ của n trị số quan sát: cXV a ji n Þ ijT i −= ∑∑ − =1 2 - VN là biến động giữa các trị số quan sát cùng một mẫu. ∑∑∑ = − = = −−− 1 2 1 2 i ii a li ni Þ ijN cXnaXV Với những thí nghiệm có phương sai tổng thể không bằng nhau thì không dùng so sánh phương sai mà chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Tamhane,s T2 để xác định sự sai khác. Với tiêu chuẩn này nếu 2 công thức có sự sai khác sẽ được được đánh dấu * ở kết quả phân tích số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khử trùng mẫu cấy Hiện nay, HgCl2 đang được sử dụng để khử trùng mẫu trong nhân giống in vitro cây Bạch đàn ở nhiều phòng thí nghiệm. Hầu hết, khi khử trùng bằng HgCl2 đều cho tỷ lệ mẫu sống cao, tuy nhiên đây là chất được xếp vào nhóm chất độc hại số 1 đối với cơ thể con người. Trong khi đó Ca(OCl)2 cũng được một số tác giả sử dụng để khử trùng mẫu và ít độc hại cho con người [8]. Nghiên cứu sử dụng 2 loại hoá chất là HgCl2 và Ca(OCl)2. Kết quả trên bảng 1a cho thấy việc tạo vật liệu khởi đầu có khử trùng từ chồi nách của dòng UE35 là tương đối khó, mẫu có tỷ lệ nhiễm cao. Khử trùng bằng Ca(OCl)2 khi tăng thời gian khử trùng thì mẫu nhiễm giảm, số mẫu chết tăng do quá thời gian khử trùng. Tỷ lệ mẫu cao nhất là 40 phút (mẫu sống 32,2%), mẫu nhiễm cao nhất là thời gian 20 phút (67,8%), bên cạnh đó thì thời gian khử trùng ảnh hưởng yếu đến tỷ lệ mẫu sống. Từ kết quả đó thấy Ca(OCl)2 là chất khử trùng bề mặt yếu đối với dòng UE35 (tỷ lệ mẫu chết thấp, tỷ lệ mẫu nhiễm cao dẫn đến tỷ lệ mẫu sống rất thấp). Khử trùng bằng HgCl2: với thời gian khử trùng tăng (8, 10, 12 phút) tỷ lệ mẫu nhiễm đối với dòng UE35 giảm từ 61,7 xuống 31,1% và bên cạnh đó thì mẫu chết lại tăng từ 10,0% đến 38,9%. Tỷ lệ mẫu sống và tái sinh tăng khi thời gian từ 10-12 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 50 Bảng 1a. Kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 Hoá chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) % mẫu chết % mẫu nhiễm % mẫu sống HgCl2 0,1 8 10,0 61,7 28,3 10 13,0 40,6 46,4 12 38,9 31,3 30,0 Ca(OCl)2 3.0 20 7,8 67,8 24,4 30 13,3 58,9 27,8 40 18,9 48,9 32,2 Bảng 1b: Kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) Hoá chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) % mẫu chết % mẫu nhiễm % mẫu sống HgCl2 0,1 8 13,3 54,4 32,3 10 18,9 35,0 46,1 12 43,3 29,4 27,3 Ca(OCl)2 3.0 20 11,1 61,7 27,2 30 16,1 55,6 28,3 40 21,1 44,4 34,5 Từ bảng 1.b, ta thấy tỷ lệ mẫu nhiễm chiếm 35% của HgCl2 và 44,4% Ca(OCl)2, qua đó thấy việc khử trùng đối với dòng UE56 là tương đối khó. Với HgCl2 tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 54,4% xuống 35,0% và 29,4% số mẫu chết tăng từ 13,3% đến 19,8% và 43,3%. Tỷ lệ tái sinh của mẫu và mẫu sống tăng trong khi thời gian khử trùng lên 10 phút và giảm ở thời gian khử trùng là 12 phút. Qua hai bảng của hai dòng UE35 và UE56 thấy HgCl2 có tính khử trùng mạnh hơn Ca(OCl)2 do đó dung dịch khử trùng này cũng gây tổn thương mạnh đến mô nuôi cấy, đồng thời tỷ lệ chết cao hơn và tỷ lệ chồi sống sót cũng cao hơn rất nhiều. Với HgCl2 nồng độ 0,1%, ở thời gian 10 phút có kết quả tốt nhất ở cả hai dòng. Vậy chọn khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian 10 phút thích hợp cho cả 2 dòng nói trên. Kết quả ảnh hưởng 5 loại môi trường đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây Bạch đàn còn hạn chế, thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có độ tin cậy cao cho dòng Bạch đàn lai. Do vậy, thử nghiệm một số môi trường, sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên cứu hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56. Số liệu ở bảng 2 cho thấy rằng: HSNC cao nhất ở môi trường MS*, với dòng UE35 là 1,18 lần và 1,17 lần ở dòng UE56, thấp nhất ở môi trường MS (dòng UE35=0,96 và dòng UE56= 0,92). Môi trường MS* là môi trường nuôi cấy cây thân gỗ nói chung, môi trường này đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhóm tác giả Đoàn Thị Mai và cs của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu môi trường này thành công cho cây Keo lai, một số dòng Bạch đàn lai [1,2], Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam [2] đã sử dụng môi trường này để nhân giống cây Trầm qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sau khi đã so sánh với môi trường MS. Một số tác giả cũng đã sử dụng để nuôi cấy chồi đối với một số loài Thông [8]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 51 Bảng 2. Kết quả ảnh hưởng 5 loại môi trường đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 Loại môi trường Dòng UE35 Dòng UE56 Số chồi thu được HSNC (lần) Số chồi thu được HSNC (lần) Litvay 200 1,11 192 1,07 WPM 184 1,02 170 0,94 MS* 213 1,18 211 1,17 MS 173 0,96 165 0,92 WV3 195 1.08 186 1,03 (MS*: là môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm một số vitamin và khoáng chất) Bảng 3. Kêt quả ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi dòng UE35 và UE56 Nồng độ BAP (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) 0,0 258 49 1,43 19,0 246 43 1,37 17,5 + 1,0 327 72 1,82 22,0 332 64 1,84 19,3 + + 2,0 388 94 2,16 24,2 363 81 2,02 22,3 + + + 3,0 353 66 1,96 18,7 320 51 1,78 15,9 + + 4,0 344 43 1,91 12,5 294 38 1,63 12,9 + Ghi chú: +. Sinh trưởng kém, ++. Sinh trưởng trung bình, +++. Sinh trưởng tốt Phương sai tổng thể của HSNC ở hai dòng đều > 0,05 (dòng UE35 có Sig = 0,139; dòng UE56 = 0,378) điều này cho thấy phương sai của các biến ngẫu nhiên ở dòng UE35 là bằng nhau và dòng UE56 cũng bằng nhau. Phân tích phương sai với cả hai dòng thu được giá trị Sig của F đều bằng 0,00 < 0,05. Như vậy, HSNC ở các công thức môi trường có sự khác nhau rõ rệt. - Bảng phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy môi trường MS* nằm trong nhóm tốt nhất, trong 5 công thức thí nghiệm với cả hai dòng UE35 và UE56 với α = 0,05 (độ tin cậy 95%). Như vậy môi trường MS* thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi cho 2 dòng bạch đàn này. Môi trường này được đề tài sử sụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi Quá trình nhân nhanh chồi là giai đoạn quyết định đến số lượng cây trong nuôi cấy mô tế bào. Số lượng chồi hay gọi là hệ số nhân chồi (HSNC) lớn thì việc đáp ứng nhu cầu cung cấp cây con giống sẽ lớn. Để nhân giống thành công cần có sự tác động bổ sung đồng thời các yếu tố như vật lý, hoá học, kỹ thuật cắt tạo mẫuvv. Với quá trình bổ sung chất hóc môn sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy thích hợp được coi là yếu tố rất quan trọng, trong đó BAP có tác dụng kích thích sự hình thành chồi mới. Đây cũng là chất được sử dụng cho rất nhiều loại cây, do đó việc nghiên cứu sử dụng BAP để bổ sung cho môi trường nuôi cấy ở giai đoạn nhân nhanh với nhiều nồng độ khác nhau là cần thiết và phù hợp với 1 số nghiên cứu trước đây [1,2,4,8]. Từ bảng 3 ta thấy khi bổ sung IAA vào môi trường thấy rằng HSNC và TLCHH của dòng UE35 là 2,16 và 24,2%, dòng UE35 là 2,07 lần và 22,0%, khi tăng nồng độ IAA lên 0,5 mg/l thì hệ số nhân chồi hữu hiệu tăng không đáng kể dòng UE35 là 2,34 lần, 22,4%, dòng UE56 là 2,18 lần và 22,6%. Nhưng khi tăng nồng độ từ 1,5 - 2,0 thì HSNC và TLCHH đều giảm mạnh. Qua quan sát thấy khi bổ sung IAA nồng độ 0,5 mg/l chồi sinh trưởng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 52 và phát triển tốt, thân chồi mập, lá xanh và hình thái cây khoẻ hơn khi không bổ sung IAA, bên cạnh đó thì ở nồng độ cao từ 1,0 - 2,0 mg/l chồi sinh trưởng kém, chiều cao thấp, phiến lá xoăn và dày, xuất hiện nhiều rễ ở thân chồi. Phân tích bằng thống kê toán học cho thấy, với dòng UE35: giá trị Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances của chỉ tiêu HSNC = 0,353 > 0,05, TLCHH = 0,579 > 0,05. Như vậy thấy rằng các biến ngẫu nhiên của 2 chỉ tiêu trên có phương sai bằng nhau. HSNC và TLCHH ở các công thức nồng độ BAP có sự khác nhau với giá trị Sig của chỉ tiêu HSNC và TLCHH trong bảng Anova thu được đều bằng 0,00 < 0,05. - Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy nồng độ BAP bằng 2,0 mg/l tốt nhất cho HSNC (2,16 lần) và TLCHH (24,4%) với độ tin cậy 95%. - Tương tự với nồng độ BAP 2,0 mg/l đối với dòng UE56 ta có: HSNC (2,02 lần) và TLCHH (22,3%) với độ tin cậy 95%. Như vậy với nồng độ BAP là 2,0 mg/l là thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh 2 dòng UE35 và UE56. Với môi trường được sử dụng là: MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 5,0 g/l agar, pH = 6,0 cho giai đoạn nhân tiếp theo. Qua bảng 4 ta thấy, tổ hợp BAP + NAA có tác động tích cực rõ hơn tổ hợp BAP + IAA đến HSNC và TLCHH, chỉ tiêu theo dõi tăng ở nồng độ 0,5 - 1,0 mg/l (dòng UE35 là 2,43 lần, 2,67%; dòng UE56 là 2,31 lần, 25,5% và dòng UE35 là 2,61 lần, 28,3 %; dòng UE56 là 2,43 lần, 27,2%). Môi trường có bổ sung với nồng độ NAA là 1,5 - 2,0 mg/l thì HSNC và TLCHH đều giảm rõ rệt so với nồng độ 1,0 mg/l, điều này chứng tỏ với nồng độ NAA cao sẽ tác động hạn chế đến tỷ lệ nhân chồi của 2 dòng Bạch đàn lai nói trên. Phân tích phương sai về ảnh hưởng của NAA đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 cho thấy: Giá trị Sig trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể của 2 chỉ tiêu HSNC = 0,171 > 0,05, TLCHH = 0,510 > 0,05. Như vậy, các biến ngẫu nhiên của 2 chỉ tiêu trên có phương sai bằng nhau. Giá trị Sig trong bảng phân tích phương sai thì HSNC và TLCHH đều bằng 0,00 < 0,05, vậy các công thức có bổ sung nồng độ NAA thấy khác nhau rõ rệt với 2 chỉ tiêu được đánh giá có mức độ tin cậy 95%. - Bảng phân nhóm Duncan cho thấy HSNC cao nhất ở nồng độ 1,0 mg/l, TLCHH ở 2 nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l là một nhóm cao nhất, với độ tin cây 95%. Tương tự với dòng UE56 ta thấy: phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau, phân tích phương sai thu được kết quả HSNC và TLCHH ở các công thức là khác nhau rất rõ. Nồng độ 1,0 mg/l với HSNC và TLCHH lần lượt là: 2,43 lần và 27,2% với độ tin cậy 95%. Bảng 4. Kết qủa ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP 2,0mg + NAA đến nhân nhanh chồi dòng UE35 và UE56 Nồng độ NAA (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Chồi hữu hiệu Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ (%) Số chồi thu được Chồi hữu hiệu Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ (%) 0 396 97 2,20 24,5 369 84 2,05 22,8 ++ 0,5 438 117 2,43 26,7 416 106 2,31 25,5 ++ 1,0 470 133 2,61 28,3 437 119 2,43 27,2 +++ 1,5 392 73 2,18 18,6 382 66 2,12 17,3 + 2,0 363 44 1,02 12,1 354 40 1,97 11,3 + Ghi chú: +.sinh trưởng kém, ++. sinh trưởng trung bình, +++. sinh trưởng tốt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 53 Với kết quả phân tích từ bảng biểu trên, môi trường MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, pH = 6,0 là tốt nhất cho nhân chồi 2 dòng UE35 và UE56. Môi trường này được thí nghiệm tiếp cho nhân nhanh chồi tiếp theo. Bảng 5. Kết quả sự phối hợp nồng độ BAP, NAA + Kinetin đến nhân nhanh chồi dòng UE35 và UE56 Nồng độ Kinetin (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Chồi hữu hiệu Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ (%) Số chồi thu được Chồi hữu hiệu Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ (%) 0 480 134 2,67 27,9 436 119 2,42 27,3 ++ 0.5 541 165 3,01 30,5 466 128 2,59 27,5 +++ 1,0 510 152 2,83 29,8 488 138 2,71 28,3 +++ 1,5 478 87 2,66 18,2 435 78 2,42 17,9 + 2,0 447 70 2,48 15,7 381 48 2,12 12,6 + Ghi chú: +.sinh trưởng kém, ++. sinh trưởng trung bình, +++. sinh trưởng tốt Từ kết quả của nghiên cứu trên thấy rằng Kinetin có ảnh hưởng tích cực đến quá trình nhân nhanh chồi, nhưng tổ hợp BAP + Kinetin cho HSNC và TLCHH thấp hơn so với BAP + NAA. Vậy nên đề tài nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của sự phối hợp Kinetin với tổ hợp BAP + NAA. Kinetin được bổ sung vào môi trường thí nghiệm là: MS* + 2,0 mg/l + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,0, với nồng độ Kinetin là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Theo dõi quá trình phát triển của chồi cho thấy khi bổ sung Kinetin nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l chồi sinh trưởng tốt, lá có mầu xanh non. Nhưng khi tăng nồng độ lên 1,5 mg/l, 2,0 mg/l xuất hiện nhiều cụm chồi nhỏ, mảnh, mướt các đốt của đoạn chồi dài không rõ thân lá và ngọn. Kết quả của một số chất kích thích ra rễ đến quá trình hình thành rễ 2 dòng Bạch đàn Giai đoạn ra rễ là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đủ thân, lá và rễ. Giai đoạn này các chất có tác dụng kích thích tạo chồi và vươn cao của chồi được loại bỏ. Thay vào đó là các chất có tác dụng kích thích ra rễ, do vậy các chất auxin thường được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô tế bào. Giai đoạn này không cần sự sinh trưởng về chiều cao mà chỉ cần tạo rễ cho chồi nên nồng độ auxin, đường, các chất dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy cũng được giảm xuống 1/2. [1,2] Với ABT1 cho hiệu quả tốt nhất là 1,0 mg/l với dòng UE35 tỷ lệ chồi ra rễ đạt 82,1%, số rễ trung bình là 2,85 rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ là 1,29 cm. Còn dòng UE56 các chỉ số là 81,7%, 2,59 rễ/cây, chiều dài trung bình 1,16 cm. Ở những nồng độ cao hơn tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ đều giảm mạnh ở cả 2 dòng, quan sát thấy khi tăng nồng độ lên 1,5 và 2,0 mg/l xuất hiện nhiều rễ bị đen, chiều dài rễ ngắn hơn so với nồng dộ 1,0 mg/. - Phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của dòng UE35 thấy: Chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig = 0,457 > 0,05 trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể nên đề tài sử dụng so sánh phương sai để đánh giá sự sai khác. Chỉ tiêu số rễ trung bình/cây có Sig = 0,03 < 0,05 nên đề tài sử dụng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 để so sánh. - Kết quả phân tích phương sai trong bảng Anova thấy tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig của F= 0,00 < 0,05 vậy tỷ lệ ra rễ ở các công thức có sự sai khác rõ rệt. Chiều dài trung bình của rễ cũng thay đổi rõ rệt, bảng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 cho thấy số rễ trung bình/cây ở các công thức nồng độ có sự sai khác rõ rệt. Sai khác có độ tin cậy với α = 0,05. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 54 Bảng 6. Kết qủa ảnh hưởng của IBA 2,0+ ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 Nồng độ ABT1 (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Hình thái rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB (rễ/cây) Chiều dài rễ TB (cm) Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ TB (rễ/cây) Chiều dài TB rễ (cm) 0 75,6 2,60 1,09 75,0 2,39 1,06 Đầu rễ đen 0,5 82,2 2,85 1,29 81,7 2,59 1,16 Đầu rễ trắng, mập và đều 1,0 66,7 2,54 0,91 65,6 2,44 0,88 Đầu rễ trắng, dài 1,5 59,4 2,50 0,74 55,0 1,97 0,69 Đầu rễ đen, mảnh, dài 2,0 42,2 2,01 0,65 45,0 1,80 0,58 Đầu rễ đen, ngắn - Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thu được công thức có nồng độ ABT1 bằng 0,5 mg/l là tốt cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ với độ tin cậy 95%. - Phân tích tương tự như trên, ở dòng UE56 được tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dai trung bình của rễ ở các công thức có nồng độ khác nhau rõ rệt với α=0,05. Nồng độ 0,5 mg/l ABT1 là tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình rễ với độ tin cậy 95%. KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu về 2 dòng Bạch đàn UE35 và UE56 thấy rằng sinh trưởng và phát triển của 2 dòng trên chịu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Thành phần và nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng ảnh hưởng mạnh và rõ đến hiệu quả quá trình nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. - Chất khử trùng mẫu cho 2 dòng Bạch đàn UE35 và UE56 tốt nhất là HgCl2 nồng độ 0,1%, thời gian khử trùng là 10 phút. - Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp cho dòng UE35 là: MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin + 30 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH=6,5. - Môi trường tạo chồi và nhân chồi thích hợp cho dòng UE56 là: MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l Kinetin + 30 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH=6,5. - Môi trường tạo cây hoàn chỉnh ra rễ với cả 2 dòng là 1/2MS* + 2,0 mg/l IBA + 0,5 ng/l ABT1 + 15 g/l đường Sucrose + 5 g/l agar, pH = 6,5. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000), “Kết quả bước đầu về nhân giống Bạch đàn lai bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh”, Tạp chí Lâm nghiệp, (số 10/2000), tr. 46-47. 2. Đoàn Thị Mai và cộng sự (2005), “Bước đầu ứng dụng công nghệ mô - hom trong nhân giống Trầm hương”, Tạp chí NN&PTNT (số 2), tr. 57-67. 3. Lê Đình Khả và Nguyễn Việt Cường, (1998). Ưu thế lai về sinh trưởng và tính chống chịu của một số tổ hợp lai khác loài ở Bạch đàn, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 41- 43. 4. Lê Đình Khả, (2008), Khảo nghiệm giống và nhân giống một số giống keo lai và Bạch đàn lai mới cho một số vùng sinh thái chính. 5. Nguyễn Đức Thành, (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. tr 13- 19 6. Lê Đình Khả và Nguyễn Việt Cường, (2000a).R eseach on hybrid isation of some Eucalyptus spesies in Viet Nam. Hybrid Breeding and Genetics of Forest Trees 7. Andrew I. (1991), “Thiết kế đơn giản cho các thí nghiệm lâm nghiệp”, Bản tin, Viện Nghiên cứu lâm nghiệp (số 71), 39 trang. 8. Darus H. Amad (1994), Multiplication of Acacia mangium by stem cutting and tissue culture techliques. Advances in tropical acacia research, p 32-34 9. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A resied medium for rapid growth and bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol. Plant (15), pp. 473-495. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Đặng Ngọc Hùng và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 108(08): 47 - 55 55 SUMMARY PROPAGATATION OF EUCALYPTUS HYBBRID CLONES UE35 AND UE56 BY PLANT TISSUE CULTURE Dang Ngoc Hung1*, Le Dinh Kha2 1 College of Agriculture and Forestry – TNU 2Vietnamese Academy of Forestry sciences The research on UE35 and UE56 (Eucalyptus urophylla and E. exserta) including the studying of effects of concentrati Eucalyptus hybrid breeding on disinfectants HgCL2 and Ca(OCL)2 found that: HgCl2 concentration of 0.1%, 10 minutes with the best results in both lines. Disinfection results achieved is the highest form of living UE35: 12.53 to 15.76 and UE56: 13.10 to 16.05. Environmental testing of axillary buds Eucalyptus trees are: Litvay; WPM; MS*; MS; WV3 resulting MS* environment is the environment of live shoots and best bud coefficient than the remaining four types of environments with turn indicators UE35 detector is 213 shoots, HSNC 1.18 and UE56 of 211 buds; HSNC 1.17 times. Growth stimulants added to the BAP; NAA; IAA; Kinetin. The results show that BAP + NAA + Kinetin works better shoot multiplication use BAP own or Kinetin is: BAP 2.0mg/l + NAA 1.0mg/l + Kinetine 0.5mg/l UE35; 1.0mg/l UE56 supplement Kinetin concentrations of 0.5mg and 1.0 mg/l bud grows well, young green leaves. Appropriate root for UE35 and UE56 is a combination of IBA 2.0mg/l + ABT1 0.5mg/l line UE35 (shoots rooting rate reached 82.2%; roots average 2.58; dimensional The average length of roots is 1,29; UE56 line shoots rooting rate reached 81.7%, an average of 2.59 roots/plant, the average length of the roots is 1.16, the fat white roots and. Key words: Eucalyptus breeding, tissue culture cells, stimulants multiplication, rooting stimulants. Clones UE35 and UE56, propagation, tissue culture, Autoclave, Cytokinin; Auxin * Tel: 0973-555-249; Email: hungtuaf@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên