Nghiên cứu về mật độ coliform và escherichia coli trên tôm sú nguyên liệu khi bảo quản ở nhiệt độ dương thấp - Mai Thị Tuyết Nga

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 NHA TRANG UNIVERSITY • 91 NGHIÊN CỨU VỀ MẬT ĐỘ COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI TRÊN TÔM SÚ NGUYÊN LIỆU KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ DƯƠNG THẤP STUDYING ON THE COUNTS OF COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI IN BLACK TIGER SHRIMP DURING LOW TEMPERATURE STORAGE Mai Thị Tuyết Nga1 Ngày nhận bài: 05/4/2016; Ngày phản biện thông qua: 03/8/2016; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016 TÓM TẮT Nghiên cứu theo dõi mật độ Coliform và Escherichia coli (E.coli) trong quá trình bảo quản lạnh tôm sú ở 5 chế độ nhiệt độ ổn định (1, 4, 9, 15 và 19 ± 1 °C) và 3 chế độ nhiệt độ biến động mô phỏng phần cuối của chuỗi cung ứng. Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng Coliform ban đầu trong tôm sú nguyên liệu dao động trong khoảng rộng từ 1.100 MPN/g, trong khi lượng E.coli ban đầu chỉ ở mức 3 MPN/g. E.coli không phát triển được ở 1 và 4 ± 1°C. Khi hết thời hạn bảo quản, mật độ Coliform trên tôm sau 4 ngày ở 1 ± 1°C là 84 MPN/g; sau 2 ngày ở 4 ± 1°C là 23 MPN/g; sau 1,5 ngày (36 giờ) ở 9 ± 1°C là 7,7 MPN/g; sau 1,3 ngày (32 giờ) ở 15 ± 1 °C là 3 MPN/g; và sau 0,8 ngày (19 giờ) ở 19 ± 1°C là 3 MPN/g; còn mật độ E.coli ở các mốc thời gian và nhiệt độ tương ứng trên đều nằm dưới mức giới hạn cho phép. Ở 3 chế độ nhiệt độ biến động, lượng Coliform tăng khi có sự tăng đến nhiệt độ của môi trường xung quanh, cả Coliform và E.coli đều bị ức chế trong thời gian đầu (1-2 ngày) bảo quản ở 1 ± 1°C và thời gian cuối bảo quản ở 9 ± 1°C, lượng E.coli cũng nằm trong giới hạn cho phép khi kết thúc quá trình bảo quản. Từ khóa: Coliform, E.coli, tôm sú, bảo quản lạnh ABSTRACT This study monitored the counts of Coliform and E.coli during low temperature storage at 5 stable temperature regimes (1, 4, 9, 15, and 19 ± 1°C) and 3 dynamic ones stimulating the end of supply chains. The results showed that the initial counts of Coliform were in a large range from 1,100 MPN/g, while those of E.coli were as low as 3 MPN/g. E.coli did not grow at 1 and 4 ± 1°C. At the end of the shrimp shelf life, the counts of Coliform after 4 storage days at 1 ± 1°C, 2 days at 4 ± 1°C, 1.5 days (36 hours) at 9 ± 1°C, 1.3 days (32 hours) at 15 ± 1°C, and 0.8 days (19 hours) at 19 ± 1°C were 84 MPN/g, 23 MPN/g, 7.7 MPN/g, 3MPN/g, and 3 MPN/g, respectively; while the counts of E.coli at corresponding times and temperatures were well below the acceptable limit. At the 3 dynamic temperature regimes, Coliform counts raised when there was an increase in storage temperature till ambient environment, both Coliform and E.coli were inhibited at the beginning (1-2 days) of storage at 1 ± 1°C and at the latter time of storage at 9 ± 1°C, the counts of E.coli were still within the acceptable limit at the storage ends. Keywords: Coliform, E.coli, black tiger shrimp, low temperature storage 1 Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC 92 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Sản lượng thủy sản tăng trưởng liên tục trong những năm qua, bình quân đạt 9,07%/ năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước. Nhờ vậy mà nước ta trở thành một trong những quốc gia xuất khẩu tôm hàng đầu thế giới, sản phẩm tôm đã có mặt trên 91 quốc gia và vùng lãnh thổ. Trong năm 2015 kim ngạch xuất khẩu mặt hàng tôm đạt 2,95 tỷ USD và chiếm 44% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam, trong đó xuất khẩu tôm sú đạt 963 triệu USD [9]. Từ số liệu này cho thấy tôm nói chung và tôm sú nói riêng là mặt hàng rất quan trọng. Do đó việc đảm bảo chất lượng của tôm nguyên liệu là yếu tố quyết định đến giá trị sản phẩm. Tôm sú thường được xuất khẩu dưới dạng đông lạnh, ở điều kiện này hầu hết các vi sinh vật bị ức chế sinh trưởng. Tuy nhiên, việc bảo quản nguyên liệu sau thu hoạch trước chế biến đông hoặc bảo quản tôm bán thành phẩm, thành phẩm vào cuối chuỗi cung ứng ở điều kiện nhiệt độ dương thấp tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Vì vậy việc nghiên cứu sự biến đổi chất lượng của tôm trong quá trình bảo quản lạnh là cần thiết, trong đó phải kể đến sự biến đổi của các vi sinh vật gây bệnh hiện diện và lây nhiễm trên tôm sú. An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề được xã hội rất quan tâm hiện nay. Ngộ độc thực phẩm và các bệnh do thực phẩm gây ra không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe của con người mà còn gây thiệt hại về kinh tế và xã hội. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trên thế giới hàng năm cứ 10 người thì có 1 người bị ốm do nguyên nhân ngộ độc thực phẩm và 420.000 ca tử vong, trong đó Châu Phi và Đông Nam Á là hai khu vực có tỉ lệ ngộ độc thực phẩm cao nhất, và vi khuẩn gây bệnh E.coli là nguyên nhân chính của nhiều vụ tiêu chảy [13]. Mỗi năm nước ta có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100-200 ca tử vong, trong số đó ngộ độc do vi sinh vật gây bệnh chiếm 33-49%, và một trong những vi khuẩn gây bệnh thường gặp là E.coli [2]. Coliform và E.coli là hai chỉ tiêu vi sinh vật chỉ thị vệ sinh y tế, theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế thì lượng E.coli trong thủy sản đông lạnh, tươi cần chế biến nhiệt trước khi ăn là không quá 100 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam (CFU/g) [1]. Do đó, tiến hành nghiên cứu theo dõi mật độ của chúng trong quá trình bảo quản tôm sú nguyên liệu ở nhiệt độ dương thấp là rất cần thiết. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu Tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng trong thí nghiệm được thu mua từ các đìa nuôi tại Bình Định, cỡ 30-40 con/kg, tôm được ướp luân phiên với các lớp nước đá xay trong thùng xốp cách nhiệt kín và được vận chuyển về phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang trong vòng 5 giờ, nhiệt kế tự ghi được đặt bên trong thùng xốp để theo dõi nhiệt độ trong quá trình vận chuyển. Tại phòng thí nghiệm, tôm được rửa bằng nước lạnh (0-4 °C), để ráo, xếp khay xốp sạch, mỗi khay gồm 6 cá thể tôm sú (khoảng 150-200 gam), bọc kín bằng màng polyethylene (PE) mỏng. Các khay tôm được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh dân dụng (Sharp-284 lít), tủ được lắp thêm bộ phận cảm biến nhiệt để điều khiển nhiệt độ tủ bảo quản ở các chế độ nhiệt độ ổn định khác nhau: 1, 4, 9, 15 và 19 ± 1°C; 3 chế độ nhiệt độ biến động mô phỏng điều kiện thực tế. Tủ bảo quản mẫu được đặt tại phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm, mẫu vi sinh được phân tích tại phòng thí nghiệm vi sinh (tầng 4 - khu B3). Mỗi lẫn lấy mẫu kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gồm 1 khay (chứa 6 cá thể tôm sú, khoảng 150-200 gam), chuyển vào túi Polyamide (PA) sạch bằng panh vô trùng để làm nhỏ và đồng nhất bằng máy dập mẫu Smasher, sau đó dùng panh vô trùng lấy 25g Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 NHA TRANG UNIVERSITY • 93 mẫu cho vào túi PE tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật. Hóa chất và môi trường sử dụng gồm: EMB agar (Merck), Lauryl sulfate broth (Merck), Pepton from meat (Merck), Sodium hydroxide (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc), KH2PO4 (Trung Quốc), Pepton from casein (Merck), Kovac’s (Merck). 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Bố trí thí nghiệm 2.1.1. Bố trí thí nghiệm ở nhiệt độ ổn định Tôm sú sau khi được xử lý như mô tả bên trên được bảo quản ở 5 chế độ nhiệt độ ổn định là: 1, 4, 9, 15 và 19 ± 1°C. Thời gian bảo quản mẫu được bố trí dựa trên kết quả khảo sát của Trần Thị Thu Lệ (2015) [8]. Ở mỗi chế độ nhiệt độ, lấy 7 điểm mẫu để làm thí nghiệm và căn cứ vào thời gian bảo quản ở từng nhiệt độ, tiến hành lấy mẫu tôm tại những thời điểm cụ thể để kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật gây bệnh Coliform và E.coli. Ngoài ra còn kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng khác không thuộc phạm vi trình bày của bài báo này (như tổng vi sinh vật hiếu khí (TVC) và các vi sinh vật gây hỏng đặc trưng, tổng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N) và chất lượng cảm quan). Mục đích lấy 7 điểm mẫu tại mỗi chế độ bảo quản là để đủ dữ liệu phục vụ cho xây dựng mô hình biến đổi chất lượng tôm sú ở các nhiệt độ khác nhau theo thời gian bảo quản [10]. Thời điểm lấy mẫu ở các chế độ nhiệt độ khác nhau tùy thuộc vào thời gian bảo quản mẫu ở nhiệt độ đó, sao cho đảm bảo số điểm mẫu và tạo điều kiện để phát hiện được quy luật biến đổi (nếu có) của chỉ tiêu chất lượng nhất định [10]. 2.1.2. Bố trí thí nghiệm ở nhiệt độ biến động Tôm sú sau khi xử lý và xếp vào khay xốp được bảo quản ở 3 chế độ nhiệt độ biến động: nhiệt độ biến động 1, nhiệt độ biến động 2 và nhiệt độ biến động 3. Thí nghiệm được bố trí dựa trên kết quả khảo sát ở 3 chế độ nhiệt độ biến động của Trần Thị Thu Lệ (2015) [3]. Ở mỗi chế độ nhiệt độ lấy 7 điểm mẫu để làm thí nghiệm và căn cứ vào thời gian bảo quản ở từng chế độ nhiệt độ, tiến hành lấy mẫu tôm tại những thời điểm cụ thể để kiểm tra các chi tiêu vi sinh vật gây bệnh Coliform, E.coli. ● Biến động 1 (BĐ 1): tôm sú sau khi đến phòng thí nghiệm được xử lý và bao gói tương tự như tôm bảo quản ở nhiệt độ ổn định trong khay xốp sạch, mỗi khay 6 cá thể tôm, bao màng PE và đưa vào bảo quản ở (a) chế độ 1 ± 1oC trong 48 giờ, (b) nhiệt độ môi trường (30-32 oC) trong 2 giờ và (c) ở chế độ 9 ± 1 oC cho đến khi tôm hỏng. Đây là chế độ mô phỏng (a) việc tôm được bảo quản và bày bán tại siêu thị, (b) sau đó được người tiêu dùng mua, vận chuyển về và (c) cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh dân dụng. ● Biến động 2 (BĐ 2): tôm sú sau khi đến phòng thí nghiệm được rửa và làm ráo ở điều kiện tương tự như ở chế độ nhiệt độ ổn định, xếp vào thùng xốp loại 5 kg với các lớp nước đá xay luân phiên, đáy và mặt trên thùng đều có nước đá xay để duy trì nhiệt độ thấp, đậy kín nắp, dán kín thùng bằng băng keo vào bảo quản (a) bằng nước đá trong thùng xốp (nhiệt độ bên ngoài thùng 30-36 oC) trong 24 giờ. Sau đó lấy ra xếp khay xốp sạch bao màng PE, (b) bảo quản ở chế độ 1 ± 1oC trong 24 giờ, (c) nhiệt độ môi trường (30-32 oC) trong 2 giờ và (d) ở chế độ 9 ± 1 oC cho đến khi tôm hỏng. Chế độ này mô phỏng (a) việc tôm được vận chuyển từ các vùng nuôi về Nha Trang trong xe vận chuyển dân dụng ở điều kiện thường, (b) tiếp đến được bảo quản và bày bán tại siêu thị, (c) sau đó được người tiêu dùng mua, vận chuyển về và (d) cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh dân dụng. ● Biến động 3 (BĐ 3): tôm được xử lý và bao gói vào thùng xốp tương tự như ở chế độ biến động 2 và đưa vào bảo quản (a) bằng nước đá trong thùng xốp, nhiệt độ bên ngoài thùng 50-55 oC trong 12 giờ. Sau đó lấy ra xếp khay xốp sạch bao màng PE, (b) bảo quản ở chế độ 1 ± 1oC trong 24 giờ, (c) nhiệt độ môi trường (30 - 32 oC) trong 2 giờ và (d) ở chế độ 9 ± 1oC cho đến khi tôm hỏng. Chế độ này 94 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 mô phỏng (a) việc tôm được vận chuyển từ các vùng nuôi xa (Sóc Trăng, Cà Mau, ) về Nha Trang trong các hầm chứa đồ của xe vận chuyển dân dụng, (b) tiếp đến được bảo quản và bày bán tại siêu thị, (c) sau đó được người tiêu dùng mua, vận chuyển về và (d) cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh dân dụng. 2.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật 2.2.1. Xác định số lượng Coliform Số lượng Coliform được xác định theo TCVN 4882: 2007 [7]. Số lượng Coliform được xác định bằng phương pháp MPN, phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp, ủ và đọc số ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số vi khuẩn trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu. ● Chuẩn bị mẫu, đồng nhất mẫu: dùng panh vô trùng gắp các cá thể tôm cho vào túi PA vô trùng, đồng nhất mẫu ở máy dập mẫu Smasher, sau đó gắp 25 g mẫu cho vào túi PE vô trùng. Thêm vào 225 ml dung dịch đệm phosphat đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu. ● Pha loãng mẫu: dịch được đồng nhất xong tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipet có gắn đầu hút được hấp vô trùng hút 1 ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm đến độ pha loãng 10-3. ● Cấy mẫu: cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng từ 10-1 đến 10-3 (chọn tỷ lệ pha loãng thích hợp tùy thuộc vào mẫu, nếu nghi ngờ mẫu có mật độ vi sinh vật cao thì tăng nồng độ pha loãng) vào dãy 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml canh Lauryl sulphate (LSB) đã hấp vô trùng, ủ ở 37 °C và ghi nhận ống có sinh hơi sau ủ 24 giờ. Kết quả: tra bảng Mac Crandy để xác định tổng số Coliform trong 1 g mẫu. 2.2.2. Xác định số lượng E.coli Phương pháp định lượng E.coli được quy định theo TCVN 6846–2007 [8]. Chuẩn bị mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu, cấy mẫu tương tự như phương pháp định lượng Coliform. Từ kết quả ghi nhận ống LSB có sinh hơi sau ủ 24 giờ. Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB có sinh hơi sang đĩa petri chứa môi trường EMB đã được hấp vô trùng. Ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Đọc kết quả các đĩa petri có khuẩn lạc đỏ tím, ánh kim và dùng que cấy vòng cấy chuyển các đĩa có khuẩn lạc đỏ tím, ánh kim vào ống nghiệm chứa môi trường pepton casein đã hấp khử trùng. Ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Tiếp đến ta nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống pepton casein. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính (dịch chứa trong ống nghiệm phân thành 2 lớp, lớp trên màu đỏ, lớp dưới màu vàng). Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng Mac Crandy để xác định số lượng E.coli có trong 1 g mẫu. 2.3. Xử lý số liệu và vẽ đồ thị Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần độc lập với 3 lô tôm, lô đầu tiên là lô khảo sát. Số liệu được tính trung bình, độ lệch chuẩn trên 3 lần thí nghiệm và vẽ đồ thị bằng phần mềm Excel (Offi ce 2007, Microsoft, USA). Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Tukey được thực hiện trên phần mềm SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) với mức khác biệt có ý nghĩa α = 0,05. II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Biến đổi của Coliform trong quá trình bảo quản tôm sú ở nhiệt độ ổn định Theo nhiệt độ và thời gian bảo quản, sự biến đổi số lượng Coliform được trình bày ở Hình 1. Kết quả phân tích ANOVA cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mật độ Coliform giữa các ngày bảo quản ở nhiệt độ 1 ± 1 °C, cụ thể như sau: mật độ Coliform của ngày bảo quản 2 khác với tất cả các ngày còn lại trừ ngày 0; Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 NHA TRANG UNIVERSITY • 95 mật độ Coliform của ngày 4 khác với tất cả các ngày còn lại (p < 0,05); trong khi đó, mật độ Coliform của các ngày bảo quản 0, 6, 8, 9, 10 không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05). Ở nhiệt độ 4 ± 1°C, chỉ có mật độ Coliform của ngày 0 khác với tất cả các ngày bảo quản sau đó (p < 0,05). Không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về mật độ Coliform giữa các ngày bảo quản ở các nhiệt độ 9 ± 1°C và 15 ± 1°C. Ở nhiệt độ 19 ± 1°C, mật độ Coliform sau 1,3 ngày (30 giờ) bảo quản khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) với tất cả các ngày bảo quản trước đó. Hình 1. Mật độ Coliform trên tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh ở nhiệt độ ổn định Chữ cái khác nhau trên đồ thị mật độ Coliform ở mỗi nhiệt độ bảo quản thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) về mật độ Coliform trên tôm sú giữa các ngày bảo quản ở nhiệt độ tương ứng Lượng Coliform ban đầu dao động rất lớn từ 1.100 MPN/g, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của tất cả các lô nghiên cứu ở cả 5 chế độ nhiệt độ ổn định là 169 ± 356 MPN/g (Hình 1), cho thấy sự khác biệt lớn về lượng vi khuẩn ban đầu giữa các lô. Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với thực tế rằng lượng vi sinh vật ban đầu hiện diện và nhiễm vào thủy sản là khác nhau, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn gốc thủy sản và thực hành vệ sinh sau thu hoạch. Từ kết quả thực nghiệm ở Hình 1 cho thấy xu hướng biến đổi chung của lượng Coliform ở tất cả 5 nhiệt độ bảo quản ổn định là giảm nhẹ vào thời gian đầu bảo quản so với lượng vi khuẩn khi bắt đầu bảo quản. Chẳng hạn, khi bảo quản ở 1 ± 1°C lượng Coliform ban đầu là 169 MPN/g, đến ngày bảo quản thứ 4 là 84 MPN/g và có xu hướng tiếp tục giảm đến ngày bảo quản thứ 10 là 3,3 MPN/g. Ở 4 ± 1°C, lượng Coliform giảm đáng kể (p < 0,05) đến 23 MPN/g vào ngày bảo quản thứ 2. Ở nhiệt độ 9 ± 1°C, mật độ Coliform giảm xuống 23 MPN/g sau 1,2 ngày (28 giờ) và 7,7 MPN/g sau 1,5 ngày (36 giờ) bảo quản. Ở 15 ± 1°C, lượng Coliform giảm xuống 3 MPN/g tại các thời điểm 0,4 ngày (9 giờ), 0,6 ngày (15 giờ), 1 ngày và 1,3 ngày (32 giờ) bảo quản. Ở 19 ± 1°C, số lượng Coliform cũng giảm xuống mức 3 MPN/g sau 0,3 ngày (8 giờ) bảo quản và duy trì ở giá trị này đến tận 0,9 ngày (21 giờ) bảo quản. Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Smith (1985), Smith đã nhận định rằng ban đầu Coliform chưa thích nghi với nhiệt độ lạnh nên khả năng sinh trưởng bị ức chế [12]. Ở nhiệt độ dương thấp 1 và 4 ± 1oC, nhất là ở nhiệt độ 1 ± 1oC lượng Coliform hầu như không phát triển, ở 4 ± 1oC lượng vi khuẩn có xu hướng tăng nhẹ sau 3 ngày bảo quản nhưng không đáng kể (p > 0,05) (Hình 3). Kết quả này khác với kết quả nghiên cứu của Mai Thị Trang (2016) [5] khi tác giả này tìm ra xu hướng biến đổi của lượng Coliform ở 1 ± 1°C và 4 ± 1°C gần như tuân theo quy luật đường cong sinh trưởng qua các pha của vi sinh vật. Sự khác biệt về kết quả giữa hai nghiên cứu có thể là do khác biệt về phương pháp không gây nhiễm (ở nghiên cứu này) và gây nhiễm vi khuẩn vào tôm [5]. Ở nhiệt độ 9 ± 1oC, mật độ Coliform biến thiên không ổn định có thể là do tính cá thể của 96 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 mẫu tôm, nhưng xu hướng chung là tăng vào cuối thời gian bảo quản, sau 3 ngày đạt 551,5 MPN/g. Riêng ở nhiệt độ 15 ± 1°C và 19 ± 1°C thì có xu hướng giống nhau, ở những thời điểm đầu của quá trình bảo quản Coliform rất ít nhưng theo thời gian đến những thời điểm cuối cùng của quá trình bảo quản lượng Coliform tăng lên đột ngột, đạt 251,5 MPN/g sau 2 ngày bảo quản ở 15 ± 1°C, và 166,5 MPN/g sau 1 ngày bảo quản ở 19 ± 1°C. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Smith (1985) rằng sau một thời gian, Coliform quen với nhiệt độ lạnh, chúng sẽ phát triển [12]. Nếu căn cứ trên thời hạn bảo quản tôm dựa trên chỉ tiêu TVC (không vượt quá 106 CFU/g) [1, 8], khi đó lượng Coliform tương ứng như sau: sau 4 ngày ở 1 ± 1°C mật độ Coliform trên tôm là 84 MPN/g; sau 2 ngày ở 4 ± 1°C là 23 MPN/g; sau 1,5 ngày (36 giờ) ở 9 ± 1°C là 7,7 MPN/g; sau 1,3 ngày (32 giờ) ở 15 ± 1°C là 3 MPN/g; và sau 0,8 ngày (19 giờ) ở 19 ± 1°C là 3 MPN/g. 2. Biến đổi của E.coli trong quá trình bảo quản tôm sú ở nhiệt độ ổn định Theo nhiệt độ và thời gian bảo quản, sự biến đổi số lượng E.coli được trình bày ở Hình 2. Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về mật độ E.coli giữa các ngày bảo quản ở tất cả 5 chế độ nhiệt độ ổn định 1, 4, 9, 15 và 19 ± 1°C. Hình 2. Mật độ E.coli trên tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh ở nhiệt độ ổn định Từ kết quả thực nghiệm trên hình 4 cho thấy tại các chế độ bảo quản: 1 ± 1°C, 4 ± 1°C, 9 ± 1°C, 15 ± 1°C và 19 ± 1°C, lượng E.coli của các mẫu ban đầu đều bằng 3 MPN/g. Qua thời gian bảo quản gần như lượng E.coli không biến đổi hoặc biến đổi rất ít, dựa trên bảng chuyển đổi từ MPN/g sang cfu/g trong nghiên cứu của Chitov và Rattanchaiyanon (2010) [11], thấy rằng các giá trị đều thấp hơn 100 CFU/g. Riêng chế độ 9 ± 1oC lượng E.coli ở điểm mẫu cuối (sau 3 ngày bảo quản) cao và có độ lệch chuẩn lớn (121,5 ± 167,6 MPN/g), đó có thể là do tính cá thể của mẫu tôm và sự khác biệt về lô tôm. Giá trị 121,5 MPN/g không có trong bảng chuyển đổi của Chitov và Rattanchaiyanon (2010) [11], nhưng giá trị thấp hơn trong bảng 93 MPN E.coli/g đã tương ứng với 1,60.102 CFU/g, tức mức 121,5 MPN/g đã vượt quá giới hạn 100 CFU/g theo quy định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế [1]. Tuy nhiên, nếu xét trong thời hạn bảo quản cho phép theo chỉ tiêu TVC thì sau 4 ngày ở 1 ± 1°C /g; 2 ngày ở 4 ± 1°C; 1,5 ngày (36 giờ) ở 9 ± 1°C; 1,3 ngày (32 giờ) ở 15 ± 1°C; và 0,8 ngày (19 giờ) ở 19 ± 1 °C lượng E.coli trong tôm đều nằm trong giới hạn cho phép. Kết quả này cũng tương đồng với các kết quả nghiên cứu khác khi bảo quản tôm sú cùng cỡ ở nhiệt độ thấp 0-4 °C. Kết quả nghiên cứu của Dương Thị Phượng Liên và cộng sự (2011) không phát hiện thấy E.coli sau 8-10 ngày bảo quản tôm sú cỡ 30 con/kg ở 0-4°C [4]. Theo nghiên cứu gây nhiễm E.coli vào tôm sú của Mai Thị Trang (2016) thì ở nhiệt độ bảo quản 1 ± 1°C và 4 ± 1°C, vi khuẩn này cũng Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 NHA TRANG UNIVERSITY • 97 không phát triển hoặc biến đổi không đáng kể [5]. Như vậy, có thể khẳng định nhiệt độ dương thấp 1 ± 1°C và 4 ± 1°C không phù hợp cho sự phát triển của E.coli trên tôm. Tuy nhiên kết quả ở 9, 15 và 19 ± 1°C của nghiên cứu này khác với nghiên cứu gây nhiễm E.coli vào tôm sú cùng cỡ của Mai Thị Trang (2016) [5] khi tác giả này đã tìm ra được quy luật biến đổi theo đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. Sự khác biệt trong kết quả giữa hai nghiên cứu có thể là do sự khác biệt về lô, sự khác biệt giữa phương pháp gây nhiễm và không gây nhiễm (dẫn đến lượng vi khuẩn ban đầu khác nhau), cũng như sự khác biệt về phương pháp định lượng E.coli. 3. Biến đổi của Coliform trong quá trình bảo quản tôm sú ở nhiệt độ biến động Số lượng Coliform theo nhiệt độ và thời gian bảo quản được trình bày ở Hình 3. Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về mật độ Coliform giữa các ngày bảo quản ở tất cả 3 chế độ nhiệt độ biến động BĐ 1, 2 và BĐ 3. Từ kết quả thực nghiệm ở Hình 3 cho thấy ở cả 3 chế độ nhiệt độ biến động lượng Coliform biến đổi theo xu hướng chung là: khi có sự thay đổi về nhiệt độ bảo quản từ thấp (1 ± 1°C - mô phỏng quá trình bảo quản ở siêu thị ở chế độ BĐ 1 hoặc BĐ 3; hoặc ướp đá trong thùng xốp-mô phỏng quá trình vận chuyển ở chế độ BĐ 2) đến cao - xung quanh khoảng nhiệt độ phát triển thích hợp của Coliform (nhiệt độ môi trường - mô phỏng quá trình mua sắm của người tiêu dùng ở chế độ biến động 1 hoặc 3; hoặc thực hiện bao gói lại tại nhiệt độ thường ở chế độ BĐ 2) thì lượng vi khuẩn đều tăng mạnh, đạt 13 MPN/g sau 2 ngày ở chế độ BĐ 1, 13,3 MPN/g sau 1 ngày ở chế độ BĐ 2, và 23 MPN/g sau 1,4 ngày ở chế độ BĐ 3. Khi đưa mẫu trở về bảo quản ở nhiệt độ dương thấp (1 ± 1°C hoặc 9 ± 1°C) lượng vi khuẩn giảm mạnh và chưa có xu hướng tăng trở lại khi kết thúc thời gian bảo quản, đó có thể là do nhiệt độ biến động đột ngột làm cho Coliform chưa kịp thích nghi và chúng có thể bị tiêu diệt một phần. Xu hướng biến đổi này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Huỳnh Thị Ái Vân (2015) [6] về sự biến động của Coliform trên cá tra fi llet bảo quản ở chế độ nhiệt độ biến động tương tự chế độ BĐ 1. Hình 3. Mật độ Coliform trên tôm sú trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ biến động BĐ 1: chế độ nhiệt độ biến động 1; BĐ 2: chế độ nhiệt độ biến động 2; BĐ 3: chế độ nhiệt độ biến động 3 98 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05) về mật độ E.coli giữa các ngày bảo quản ở tất cả 3 chế độ nhiệt độ biến động BĐ 1, 2 và BĐ 3. Từ kết quả thực nghiệm ở Hình 6 cho thấy lượng E.coli ban đầu ở cả 3 chế độ nhiệt độ biến động cũng là 3 MPN/g, giống như ở các chế độ nhiệt độ ổn định bên trên. Ở cả 3 chế độ nhiệt độ biến động, lượng E.coli ít biến động hơn so với Coliform và có xu hướng ổn định theo thời gian bảo quản. Ở chế độ BĐ 1, xu hướng biến đổi của lượng E.coli tương tự như sự biến đổi của Coliform ở chế độ này, tức khi có sự thay đổi về nhiệt độ bảo quản từ thấp (1 ± 1°C) đến nhiệt độ môi trường thì lượng vi khuẩn tăng không đáng kể (p > 0,05), đạt 6,1 MPN/g; sau đó E.coli lại giảm và duy trì ở mức thấp khi đưa từ nhiệt độ môi trường về nhiệt độ 9 ± 1°C. Tương tự Coliform, E.coli là vi khuẩn ưa ấm, ở cả 3 nhiệt độ biến động thì nhiệt độ cao nhất là 30-32 °C kéo dài trong 2 giờ, trước và sau đó có sự thay đổi nhiệt độ đột ngột trong thời gian ngắn từ 1 ± 1°C và đến 9 ± 1°C, là những nhiệt độ không thích hợp cho sự phát triển của E.coli nên chúng bị bị ức chế. Kết thúc quá trình bảo quản ở cả 3 chế độ nhiệt độ biến động thì số lượng E.coli là 3 MPN/g. Dựa trên bảng chuyển đổi từ MPN/g sang CFU/g trong nghiên cứu của Chitov và Rattanchaiyanon (2010) [11], cho thấy các giá trị đều thấp hơn giới hạn cho phép 100 CFU/g [1]. III. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Nghiên cứu bước đầu đã cho thấy lượng Coliform ban đầu trong tôm sú nguyên liệu dao động trong khoảng rộng từ 1.100 MPN/g, trong khi lượng E.coli ban đầu chỉ ở mức 3 MPN/g. Lượng Coliform ở tất cả 5 nhiệt độ bảo quản ổn định 1, 4, 9, 15 và 19 ± 1°C giảm nhẹ vào thời gian đầu bảo quản, không phát triển ở 1 và 4 ± 1°C, nhưng tăng vào cuối quá trình bảo quản ở 9, 15 và 19 ± 1°C. Trong khi đó, E.coli không phát triển được ở 1 và 4 ± 1°C, duy trì ở mức thấp ở 9, 15 và 19 ± 1°C và cũng chỉ tăng vào cuối quá trình bảo quản. Khi hết thời hạn bảo quản theo chỉ tiêu TVC, mật độ Coliform trên tôm sau 4 ngày ở 1 ± 1°C là 84 MPN/g; sau 2 ngày ở 4 ± 1°C là 23 MPN/g; sau 1,5 ngày (36 giờ) ở 9 ± 1°C là 7,7 MPN/g; sau 1,3 ngày (32 giờ) ở 15 ± 1°C là 3 MPN/g; và sau 0,8 ngày (19 giờ) ở 19 ± 1°C là 3 MPN/g; còn mật độ E.coli ở các mốc thời gian và nhiệt độ tương ứng trên đều nằm dưới mức giới hạn cho phép. 4. Biến đổi của E.coli trong quá trình bảo quản tôm sú ở nhiệt độ biến động Số lượng E.coli theo nhiệt độ và thời gian bảo quản được trình bày ở Hình 4. Hình 4. Mật độ E.coli trên tôm sú trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ biến động BĐ 1: chế độ nhiệt độ biến động 1; BĐ 2: chế độ nhiệt độ biến động 2; BĐ 3: chế độ nhiệt độ biến động 3. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 NHA TRANG UNIVERSITY • 99 Ở 3 chế độ nhiệt độ biến động mô phỏng phần cuối của chuỗi cung ứng tôm, lượng Coliform tăng khi có sự tăng nhiệt độ xung quanh, cả Coliform và E.coli đều bị ức chế trong thời gian đầu (1-2 ngày) bảo quản ở 1 ± 1°C và thời gian cuối bảo quản ở 9 ± 1°C. Lượng E.coli cũng nằm trong giới hạn cho phép khi kết thúc quá trình bảo quản. 2. Kiến nghị Nên xây dựng mô hình biến đổi của vi sinh vật gây bệnh trên tôm sú để dự đoán số lượng của chúng theo nhiệt độ và thời gian bảo quản, góp phần đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm. Ngoài ra, nên nghiên cứu thêm sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh tại các chế độ nhiệt độ biến động mô phỏng các điều kiện thực tế khác của chuỗi cung ứng để kiểm định mô hình. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y tế, 2007. Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 Về việc ban hành “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”, Hà Nội. 2. Bùi Mạnh Hà. Thống kê ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam. doc-thuc-pham-tai-viet-nam/ (truy cập 26/7/2016). 3. Trần Thị Thu Lệ, 2015. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự biến đổi của một số vi sinh vật gây hỏng đặc trưng và gây bệnh hiện diện trên tôm sú (Penaeus monodon) nguyên liệu trong quá trình bảo quản. Luận văn thạc sĩ. Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang. 4. Dương Thị Phượng Liên, Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2011. Đánh giá nhanh độ tươi tôm sú nguyên liệu (Penaeus monodon) bảo quản trong nước đá (0-4°C) theo phương pháp chỉ số chất lượng QIM. Tạp chí Khoa học, 18b, 53-62. 5. Mai Thị Trang, 2016. Nghiên cứu sự biến đổi của lượng vi sinh vật gây bệnh Coliforms và E.coli khi gây nhiễm vào tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh. Đồ án tốt nghiệp. Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang. 6. Huỳnh Thị Ái Vân, 2015. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự biến đổi của vi sinh vật gây hỏng đặc trưng (Pseudomonas spp.) và vi sinh vật gây bệnh (Coliform, E. coli) hiện diện trên fi llet cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bảo quản lạnh. Luận văn thạc sĩ. Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang. 7. TCVN 4882:2007, 2007. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện và định lượng Coliform – kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất. 8. TCVN 6846:2007, 2007. Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli giả định – kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất. 9. VASEP, 2006. Bản tin Thương mại Thủy sản số 5-2016, ngày 05/02/2016. Tiếng Anh 10. Chill-on, 2007. Approach of establishing a shelf life model for fi sh and poultry. Final description. 11. Chitov, T. and Rattanachaiyanon S., 2010. Matching the result of Escherichia coli analysis in pure culture and food models obtained through the Most Probable Number and through Tryptone Bile X-Glucuronide chromogenic plate count methods. As. J. Food Ag-Ind., 3 (02), 258-268. 12. Smith, M. G, 1985. The generation time, lag time and minimum temperature of growth of Coliform organisms on meat, and the implication for codes of practice in abattoirs. Journal of Hygiene (Cambridge), 94, 289-300. 13. WHO Media centre. WHO’s fi rst ever global estimates of foodborne diseases fi nd children under 5 account for almost one third of deaths. (truy cập 26/7/2016).