Nghiên cứu thành phần amino acid và điện di protein dự trữ trong hạt của một số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) wilczek)

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008 66 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AMINO ACID VÀ ĐIỆN DI PROTEIN DỰ TRỮ TRONG HẠT CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) Nguyễn Vũ Thanh Thanh (Khoa KHTN&XH- ĐH Thái Nguyên) - Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên) 1. Mở đầu Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó cung cấp protein cho con người, có giá trị trong y học và cũng là cây cải tạo đất [3]. Nghiên cứu chất lượng hạt đậu xanh dựa trên phân tích hàm lượng protein, lipid, hàm lượng đường và enzyme đã được chúng tôi quan tâm nghiên cứu. Trong bài báo này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một số đặc điểm hóa sinh của 14 giống đậu xanh dựa trên phân tích hàm lượng và thành phần amino acid, điện di protein dự trữ trong hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Hạt của 14 giống đậu xanh (11 giống do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ - Viện cây lương thực và thực phNm cung cấp và 3 giống sưu tập tại tỉnh Hòa Bình và Vĩnh Phúc) làm vật liệu nghiên cứu. Đặc điểm của các giống được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Đặc điểm của 14 giống đậu xanh Ký hiệu Tên giống Nơi cung cấp Khối lượng 1000 hạt (g) Màu vỏ hạt Màu vỏ quả 1 V123 Viện KH Nông nghiệp VN 64,50±0,85 Xanh bóng Đen nâu 2 KP11 Viện KH Nông nghiệp VN 57,10±0,62 Xanh mốc Đen 3 KPS1 Viện KH Nông nghiệp VN 65,50±0,87 Xanh bóng Đen 4 T135 Viện KH Nông nghiệp VN 53,30 ±0,47 Xanh mốc Đen 5 MN93 Viện KH Nông nghiệp VN 45,30±0,49 Xanh mốc Đen 6 VC6144 Viện KH Nông nghiệp VN 59,30±0,64 Nâu bóng Đen nâu 7 HB1 Hoà Bình-VN 61,00±0,60 Xanh bóng Vàng nâu 8 HB2 Hoà Bình-VN 57,40±0,25 Xanh mốc Vàng nâu 9 ĐX06 Viện KH Nông nghiệp VN 50,00±1,16 Xanh nâu Đen 10 263 Viện KH Nông nghiệp VN 41,20±0,55 Xanh bóng Đen 11 Ninh Thuận Viện KH Nông nghiệp VN 60,50±0,84 Xanh bóng Đen 12 Quảng Bình Viện KH Nông nghiệp VN 35,40±0,75 Vàng Đen 13 Kon Tum Viện KH Nông nghiệp VN 48,60±0,85 Xanh mốc Đen 14 Vĩnh Phúc Vĩnh Phúc-VN 41,40±0,44 Xanh mốc Đen Xác định hàm lượng và thành phần amino acid trên máy phân tích amino acid tự động Biochrom 20 của hãng Pharmacia Biotech tại Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Thành phần amino acid được xác định theo gam amino acid/100g bột. Tách chiết và phân đoạn protein theo phương pháp Osborne và Klimenko như mô tả của Trần Thị Phương Liên (1999) [2]. Sau đó phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS theo phương pháp của Leammli [7]. Hạt được nghiền nhỏ thành bột mịn, loại lipid bằng ether petroleum sau đó tiến hành điện di protein phân đoạn. Protein được chiết bằng 2 cách: trong dung dịch NaCl 1M và nước cất. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008 67 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Hàm lượng amino acid trong hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu Giá trị sinh học của protein phụ thuộc trực tiếp vào thành phần amino acid. Kết quả phân tích hàm lượng amino acid trong hạt của 14 giống đậu xanh đều thu được 17 loại amino acid (hàm lượng cysteine và cystine được tính chung), trong đó đều có 7 loại amino acid không thay thế (lysine, valine, isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, methionine). Riêng amino acid không thay thế thứ 8 là tryptophan bị phân giải trong quá trình xử lý mẫu trong HCl nên không thu nhận được. Glutamin và asparagin chuyển hóa thành glutamic acid và aspartic acid. Từ kết quả phân tích hàm lượng protein và hàm lượng từng loại amino acid trong hạt của mỗi giống đậu xanh chúng tôi đã xác định được thành phần amino acid trong protein hạt của các giống đậu xanh này. Amino acid tổng số dao động trong khoảng 21,3 g - 28,28 g amino acid/100 g bột. Hàm lượng amino acid của các amino acid không thay thế được thể hiện trong bảng 2. Bảng 2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein hạt của 14 giống đậu xanh (ĐVT [g amino acid/100 g bột]) STT Tên giống Amino acid không thay thế Thr Val Met Phe Ile Leu Lys 1 V123 0,88 1,76 0,26 1,43 0,92 1,97 1,74 2 KP11 0,90 1,79 0,25 1,41 0,97 1,92 1,75 3 KPS1 0,80 1,70 0,34 1,47 0,88 1,85 1,71 4 T135 0,74 1,73 0,27 1,37 0,84 1,74 1,69 5 MN93 1,16 1,97 0,27 1,35 0,91 2,08 1,95 6 VC6144 0,87 1,74 0,32 1,59 0,95 2,05 1,87 7 HB1 0,96 1,80 0,27 1,41 0,91 1,99 1,89 8 HB2 1,17 2,13 0,21 1,41 1,11 1,96 2,07 9 ĐX06 1,01 1,85 0,27 1,47 1,14 2,10 2,02 10 263 0,79 1,69 0,32 1,45 0,87 1,89 1,72 11 Ninh Thuận 0,81 1,78 0,34 1,47 0,95 1,94 1,76 12 Quảng Bình 0,81 1,72 0,33 1,37 0,91 1,86 1,72 13 Kon Tum 0,81 1,78 0,34 1,45 0,95 1,94 1,83 14 Vĩnh Phúc 0,79 1,70 0,35 1,34 0,86 1,84 1,62 Ghi chú: Thr=Threonine; Val=Valine; Met=Methionine; Phe=Phenylalanine; Ile=Isoleucine; Leu=Leucine; Lys=Lysine. Bảng 2 cho thấy, trong số 7 amino acid không thay thế thì hàm lượng của valine (1,69 g- 2,13 g/100g bột), leucine (1,74 g - 2,10 g/100 g bột) và lysine (1,62 g - 2,07 g/100 g bột) cao hơn so với các amino acid còn lại, hàm lượng của methionine thấp nhất (0,21 g - 0,35 g/100 g bột). Giống HB2 có hàm lượng lysine cao nhất (2,07 g/100 g bột) thì hàm lượng methionine lại thấp nhất (0,21 g/100g bột), giống Vĩnh Phúc có hàm lượng lysine thấp nhất (1,62 g/100g bột) thì hàm lượng methionine lại cao nhất (0,35 g/100g bột). Các amino acid: valine, leucine và lysine có hàm lượng chênh lệch nhau không đáng kể. Kết quả này cũng phù hợp với Lê Doãn Diên nghiên cứu về thành phần amino acid của các giống đậu xanh [1]. Đối với lúa gạo, hàm lượng lysine chỉ cao hơn hàm lượng methionine trung bình khoảng 1,5 lần [4]. Còn đối với đậu xanh, kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy: hàm lượng lysine cao hơn hàm lượng methionine rất nhiều (trung bình khoảng 6,3 lần). T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008 68 Hình 1. Sắc ký đồ amino acid ở hạt của giống đậu xanh KP11 3.2 Phân tích phổ điện di các phân đoạn protein Protein chiếm một lượng lớn trong hạt đậu xanh (khoảng 24%-28%). Hàm lượng này không giống nhau giữa các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau. Protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao trong hạt đậu, trong đó phải kể đến là globulin. Nhằm đánh giá chất lượng hạt và tìm ra sự khác nhau giữa các tiểu phần protein của các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, chúng tôi tiến hành điện di protein phân đoạn theo phương pháp của Osborne và Klimenko như mô tả của Trần Thị Phương Liên. Phân đoạn 1: Protein được chiết bằng NaCl 1M. Phổ điện di phân đoạn này được xem như protein tổng số của đậu xanh gồm albumin và globulin. Số băng điện di ở mỗi giống dao động trong khoảng 13-24 băng. Khối lượng phân tử của một số băng chính đã được xác định. Các băng đậm là các vạch tương ứng với các tiểu đơn vị globulin dự trữ trong hạt. 14 giống đậu xanh nghiên cứu đều có đầy đủ các tiểu đơn vị globulin là vicilin (hệ sô lắng 8S), legumin (hệ số lắng 11S) và globulin kiềm (7S), chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của các băng sau khi điện di. Điện di phân đoạn 1 có đủ 4 băng của vicilin (8S) với kích thước 60 kDa, 48 kDa, 32 kDa, 26 kDa, trong đó băng 48 kDa rất đậm và rõ ràng. Kết quả điện di cũng thấy có đủ 2 băng của legumin với kích thước 24 kDa và 40 kDa nhưng băng mờ hơn so với các băng điện di của vicilin. Còn globulin kiềm cũng có đủ hai băng: một băng kích thước 28 kDa và băng 16 kDa. Kết quả này cũng phù hợp với công bố của các tác giả khác [5], [6], [8]. Trên hình ảnh điện di phân đoạn 1 cũng nhìn thấy rõ băng của albumin có kích thước 30,6 kDa ở tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu. Như vậy, tuy các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau nhưng đều có đầy đủ các tiểu đơn vị của globulin dự trữ. Tuy nhiên, các giống đậu xanh khác nhau có sự thay đổi về số lượng băng nhưng chỉ là sự chênh lệch ở các băng phụ mờ (hình 2). Phân đoạn 2: chứa phần lớn albumin được chiết bằng cách thNm tích phân đoạn 1. Kết quả điện di cho thấy tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu đều có băng albumin rõ nhất ở kích thước 30,6 kDa. Các băng còn lại đều có ở tất cả các giống đậu xanh nghiên cứu nhưng mờ hơn so với băng 30,6 kDa (hình 3.6). Vai trò của từng protein này như thế nào là vấn đề cần nghiên cứu tiếp. Phân đoạn 3: cặn li tâm thu được ở quá trình nhận phân đoạn 2 được tiếp tục chiết bằng NaCl 1M. Phân đoạn này chỉ chứa globulin. Số băng điện di dao động từ 8-13 băng. Phân đoạn 4: protein được chiết bằng H2O gồm cả albumin và globulin. Phổ điện di cho thấy số băng dao động trong khoảng 18-24 băng. Các băng phụ nhiều hơn và rõ hơn so với phân đoạn 1. Điều này có thể lý giải là do tỷ lệ albumin và globulin tan trong nước chiếm tỷ lệ cao. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008 69 Hình 2. Hình ảnh điện di protein phân đoạn 1 của một số giống đậu xanh Ghi chú: 1. HB1; 2. HB2; 3.ĐX06; 4. KP11; 5. MN93. Hình 3. Hình ảnh điện di protein phân đoạn 2 của một số giống đậu xanh Ghi chú: 1. HB1; 2. HB2; 3.ĐX06; 4. KP11; 5. MN93. Phân đoạn 5: nhận được sau khi thNm tích phân đoạn 4, chứa hầu hết albumin. Số băng điện di dao động từ 14-24 băng. Phân đoạn 6: Cặn li tâm sau khi nhận phân đoạn 5 được tiếp tục chiết bằng NaCl 1M. Phân đoạn 6 chứa phần lớn globulin tan trong muối. Số băng điện di dao động từ 11-14 băng. Phân đoạn 7: protein được chiết bằng NaCl 1M từ cặn ly tâm sau khi chiết bằng nước (ở phân đoạn 4), chứa phần globulin còn lại. Phổ điện di của phân đoạn 7 dao động từ 13-24 băng. Các băng của các tiểu phần vicilin, legumin và globulin kiềm đều có đầy đủ và rất rõ nét ở 14 giống đậu xanh nghiên cứu. Tuy nhiên, các băng này có độ đậm nhạt khác nhau ở các giống khác nhau. 4. Kết luận Đã xác định được sự có mặt của 17 amino acid , trong đó 7 amino acid không thay thế đều có trong protein hạt của 14 giống đậu xanh nghiên cứu. Phân tích điện di phân đoạn protein trong hạt của 14 giống đậu xanh nghiên cứu cho thấy, có sự khác biệt về mức độ hoà tan của các tiểu đơn vị globulin. Tất cả các giống đậu xanh đều có các tiểu đơn vị của globulin và albumin. Như vậy, protein dự trữ có đủ các thành phần bảo đảm thực hiện chức năng dự trữ và tạo cấu trúc không gian đúng của các phân tử protein. Sự khác nhau về phổ điện di protein trong hạt của các giống đậu xanh chỉ biểu hiện ở các băng vạch phụ
T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 1/N¨m 2008 70 Summary STUDY ON AMINO ACID AND ELECTROPHORESIS COMPOSITION OF SEED PROTEINS OF SOME MUNGBEAN CULTIVARS (Vigna radiata (L.) Wilczek) Nguyen Vu Thanh Thanh and Chu Hoang Mau Mungbean, which is rich in source of dietary protein, is a widely grown grain legume in the tropics and subtropics area. Seed of 14 mungbean cultivars was used for the study. Total amino acid content in the seeds of mungbean cultivars was from 21,3 g - 28,28g of dry weight. The protein fractions were analyzed by 12,5 SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Based on the study on electrophoresis composition of seed proteins of 14 mungbean cultivars, it showed that protein storage of 14 mungbean cultivars have globulin and albumin. The variation of protein bands in seeds of mungbean cultivars arises from the difference in the gene encoding storage proteins. Tài liệu tham khảo [1]. Lê Doãn Diên (1990), “Nghiên cứu về protein và amino acid trong một số giống cây trồng ở miền Bắc Việt Nam”, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật nông nghiệp, tr. 100-115. [2]. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội. [3]. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [4]. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. [5]. Garcia R.N, Adachi M., Tecson-Mendoza E.M., Bernardo A.E., Utsumi S. (2006), “Physicochemical properties of native and recombinant mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) 8S globulins and the effects of the N-linked glycans”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(16), pp. 6005-6010. [6]. Itoh T., Garcia R.N., Adachi M., Maruyama Y., Tecson-Mendoza E.M., Mikami B., Utsumi S. (2006), “Structure of 8S alpha globulin, the major seed storage protein of mungbean”, Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography, 62, pp. 824-832. [7]. Leammli U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227, pp. 680-685. [8]. Mendoza E.M., Adachi M., Bernardo A.E., Utsumi S. (2001), “Mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) globulins: Purification and characterization”, Journal of Agricultural of Food Chemistry, 49(3), pp. 1552-1558.