Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp biểu hiện Interleukin-3 và Interleukin-11 người dưới dạng lai với PelB - Nguyễn Thị Quý

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 94 NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN INTERLEUKIN-3 VÀ INTERLEUKIN-11 NGƯỜI DƯỚI DẠNG LAI VỚI PelB Nguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Lê Ngọc Giang, Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tnhai@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Interleukin-3 (IL-3) và Interleukin-11 (IL-11) là những cytokine đa chức năng, đóng vai trò điều hòa sự nhân lên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tế bào máu. Gen mã hóa cho protein IL-3 và IL-11 của người (mã số NM_000588 và NM_000641 trên ngân hàng gen quốc tế) được tổng hợp nhân tạo cùng tín hiệu tiết pelB và trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế NdeI ở đầu 5' và NotI ở đầu 3', được đưa vào vector tách dòng pUC57. Sau đó toàn bộ đoạn DNA được chuyển vào vị trí NdeI- NotI của vector biểu hiện pET22b(+) để tiến hành biểu hiện gen il-3, il-11 trong vi khuẩn E. coli BL21. Kết quả cho thấy ở 37oC và nồng độ chất cảm ứng là 0,5 mM IPTG, IL-3 được biểu hiện dưới hai dạng: dạng đơn (IL-3 nguyên vẹn đã được cắt bỏ tín hiệu tiết PelB) có kích thước khoảng 15 kDa và dạng lai với tín hiệu tiết PelB (khoảng 18 kDa). Protein IL-11 biểu hiện ở mức độ thấp và ở dạng đơn, có kích thước khoảng 19 kDa đúng với kích thước của protein IL-11 chuẩn. Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-3, Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), tín hiệu tiết PelB. MỞ ĐẦU Interleukin-11 (IL-11) là một cytokine thuộc họ Interleukin-6, đóng vai trò điều hòa sự nhân lên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tế bào máu. Theo Souto et al. (2012) [ 6], protein IL-11 người tái tổ hợp sản xuất bằng công nghệ DNA tái tổ hợp từ chủng E. coli hiện nay được sử dụng trên toàn thế giới để phòng bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu và giảm nhu cầu truyền tiểu cầu đối với bệnh nhân bị u tủy ác tính. Interleukin 3 (IL-3) cũng là một cytokine có bản chất là glycoprotein, tham gia vào quá trình tự đổi mới và sống sót của các tế bào nguồn tạo máu, sự nhân lên, biệt hóa của các tế bào nguồn và hoạt hóa chức năng của các bạch cầu trưởng thành [ 3]. Trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai hiện nay thì vi khuẩn Gram âm E. coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ. Hơn nữa, trên thị trường hiện nay thương mại nhiều loại vector tách dòng và chủng đột biến đối với hệ biểu hiện này. Protein ngoại lai tổng hợp trong tế bào chất ở E. coli thường đi kèm với sự cuộn xoắn không chính xác và tích tụ ở dạng thể vùi. Mặc dù sự tạo thành thể vùi thuận lợi cho tinh sạch nhưng việc tái cấu trúc để đảm bảo chức năng sinh học chưa hiệu quả. Việc tiết protein vào khoang chu chất sẽ có nhiều ưu điểm, nhất là giảm sự phân cắt protein đích, tinh sạch dễ dàng, protein độc với tế bào khu trú trong khoang chu chất. Hầu hết các protein được tiết ra khoang chu chất là protein dạng tan, có chức năng sinh học. Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các enzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli thường được định hướng vận chuyển đến đây [ 1]. Có nhiều chuỗi tín hiệu xuất phát từ những protein tiết trong tự nhiên như OmpA, OmpT, PelB, β-lactamase và alkaline phosphatase giúp vận chuyển các polypeptide ngoại lai qua màng trong nếu được thiết kế ở dạng lai với chúng. Người ta thường thiết kế thêm tín hiệu dẫn đường vào đầu N của protein đích. Chúng sẽ định hướng chuyển protein ra khoang chu chất và sau đó bị cắt bởi peptidase của màng trong, phần protein còn lại có hoạt tính được định hướng tới khoang chu chất của tế bào. Theo Georgiou & Segatori (2005) [ 2], nhờ Nguyen Thi Quy et al. 95 tiến bộ về công nghệ biểu hiện trong thời gian qua, nhiều protein của động vật có vú được sản xuất đều đặn dưới dạng tiết, năng suất lên tới gam/lít. Trong bài báo này, chúng tôi thiết kế tín hiệu tiết PelB ngay trước gen il-3 và il-11 để định hướng biểu hiện protein IL-3 và IL-11 người tái tổ hợp ở khoang chu chất của E. coli, đồng thời tránh sự gắn không mong muốn của methionin vào đầu chuỗi polypeptide mới tổng hợp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Gen il-3 và il-11 được tổng hợp bởi hãng Genscript (Hoa Kỳ) và tách dòng trong vector pUC57. Plasmid pET22b(+) được dùng làm vector biểu hiện. Chủng E. coli DH10b dùng cho mục đích tách dòng gen. Chủng E. coli BL21 (Invitrogen) được dùng làm chủng biểu hiện protein. Enzyme hạn chế NotI, NdeI, DNA marker, protein chuẩn của hãng Fermentas (Đức). Skimmed milked (Difco), 3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma). Protein tái tổ hợp IL-3 người chuẩn (Biovision) và IL- 11 chuẩn (Sigma) được dùng làm đối chứng dương. Kháng thể kháng IL-3 (Bioworld) và IL- 11 (Abcam) được sử dụng cho phản ứng lai western blot. Tất cả các hóa chất khác được mua từ hãng Merck. Phương pháp Thiết kế plasmid mang gen il-3 và il-11 Trình tự gen mã hóa protein IL-3 và IL-11 người được tổng hợp dựa trên trình tự gen mã số NM_000588 và NM_000641 trên Ngân hàng gen quốc tế, trong đó trình tự amino acid của IL-11 giống với trình tự amino acid của IL-11 đã được thương mại của hãng Neumega (không có Prolin). Để định hướng protein tiết ra khoang chu chất và đảm bảo methionin được cắt khỏi protein đích, gen il-3 và il-11 được thiết kế thêm đoạn peptide dẫn đường pelB ở đầu mỗi gen. Ngoài ra, trình tự nhận biết bởi enzyme hạn chế NdeI và NotI được đưa vào hai đầu của mỗi gen để thuận tiện cho việc tách dòng các gen. Trình tự cassette biểu hiện gen il-3, il-11 được gửi sang hãng Genscript để tổng hợp và tách dòng trong vector pUC57. Sau đó, đoạn gen pelBil3, pelBil11 được cắt khỏi vector tách dòng bằng NdeI và NotI và nối vào vector pET22b(+) cũng đã được xử lý bằng hai enzyme hạn chế trên để tạo thành vector pET22pelBil3, pET22pelBil11. Biểu hiện gen il-3 và il-11 Các tế bào E. coli mang vector biểu hiện pET22pelBil3, pET22pelBil11 được nuôi cấy trong môi trường Luria Broth có ampicillin (LBamp) nồng độ 100 µg/ml qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút rồi chuyển sang sang môi trường LBamp mới sao cho OD600 ban đầu là 0,1. Tiếp tục nuôi cấy trong cùng điều kiện cho tới khi OD600=0,4-0,6 thì bổ sung 0,5 mM Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) để cảm ứng promoter tổng hợp protein ngoại lai ở 37oC và thu mẫu sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng. Tế bào được thu lại bằng cách ly tâm và hòa lại trong đệm TrisHCl 20 mM sao cho OD600=10. Sau đó, tế bào được xử lý trực tiếp bằng đệm xử lý mẫu để giải phóng protein tổng số. Protein tổng số có chứa protein tái tổ hợp được phân tích bằng SDS-PAGE và Western blot. Tính kháng nguyên của IL-3 và IL-11 được đánh giá thông qua khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu. Mẫu protein được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE 15% và chuyển màng bằng bộ chuyển màng của BioRad trong 1 giờ, 120 V. Màng được lấy ra và phủ bằng sữa tách béo 5%, rồi ủ với kháng thể 1 là kháng thể kháng IL-3 (hoặc IL-11) người trong 1 giờ. Sau bước rửa bằng đệm TBS 1X, màng tiếp tục được ủ với kháng thể 2 cộng hợp với enzyme peroxidase trong 1 giờ và hiện màu với 3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidine (TMB). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế plasmid mang gen il3 và il11 để biểu hiện trong E. coli Các gen il-3, il-11 của người có kích thước tương ứng là 405 bp và 537 bp. Khi được gắn pelB và trình tự nhận biết enzyme hạn chế vào đầu 5', kích thước gen tăng lên tương ứng là 488 bp và 620 bp (hình 1). Do trong vector có thêm trình tự nhận biết của NdeI nên khi cắt bằng cặp enzyme hạn chế này vector đã bị cắt thành hai đoạn có kích thước khoảng 2,5 kb và 0,25 kb (hình 1). TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 96 Hình 1. DNA plasmid được xử lý bằng enzyme hạn chế 1. pUC57pelBil11/NdeI+NotI; 2: pUC57pelBil3/NdeI+NotI; M: DNA marker 1 kb. Gen il-3 và il-11, pET22b(+) sau khi xử lý với NdeI và NotI được phân tách trên gel agarose và được tinh sạch bằng kít của Qiagen. Cả ba đoạn DNA pET22b(+), il3, il11 giới hạn bởi NdeI+NotI có kích thước lần lượt là 5,37 kb, 488 bp, 620 bp đều được cắt và tinh sạch hiệu quả (hình 2). Các đoạn gen il-3, il-11 lần lượt được nối vào vector pET22b(+) để tạo thành vector pET22pelBil3 và pET22pelBil11. Sự có mặt của gen il-3, il-11 trong vector biểu hiện được kiểm tra bằng chính cặp enzyme hạn chế NdeI và NotI (hình 3) và giải trình tự gen (kết quả không trình bày). Hình 2. pET22b(+), gen pelBil3 và pelBil11 tinh sạch sau khi xử lý bằng NotI và NdeI. 1. pET22b(+)/NdeI+NotI; 2: pelBil3/NdeI+NotI; 3: pelBil11/NdeI+NotI; M: DNA marker 1kb (fermentas). Hình 3. Cắt kiểm tra vector biểu hiện mang gen bằng enzyme hạn chế 1. pET22pelBil3/NdeI+NotI; 2: pET22pelB il11/NdeI+NotI; M: DNA marker 1 kb (fermentas). Hình 4. Kiểm tra protein biểu hiện từ các dòng E. coli BL21 mang pETpelBil3 bằng Coomassie (a) và phản ứng lai western blot (b) 1-6. các dòng mang pETpelBIL-3; DC: chủng đối chứng không mang gen; K. chủng mang gen không cảm ứng IPTG; M1. thang protein chuẩn (Fermentas); M2. thang protein màu chuẩn (Fermentas); P: protein chuẩn hIL3 (Biovision) 1 M 2 250 500 750 1000 1500 2000 10000 bp 6000 2500 3000 4000 250 500 750 1000 1500 2000 10000 bp 6000 2500 1 M 2 3 250 500 750 1000 1500 2000 10000 bp 6000 2500 1 M 2 kDa 10 70 15 25 35 40 55 b 1 M 2 P 2 3 DC 4 5 K kDa 14,4 18,4 25,0 35,0 45,0 66,2 116, a 1 M 1 2 3 4 DC 5 K Nguyen Thi Quy et al. 97 Biểu hiện gen il-3 và il-11 trong E. coli Vector tái tổ hợp mang gen pelBil-3 và il-11 được biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21. Các dòng biến nạp được nuôi cấy trong môi trường LBamp và cảm ứng với IPTG. Dịch phá tế bào được điện di biến tính trên gel SDS- PAGE 15% để kiểm tra sự có mặt của protein quan tâm (hình 4 và 5). Kết quả nhuộm Coomassie trên hình 4a cho thấy sau cảm ứng, tất cả các dòng biến nạp (1- 6) đều biểu hiện protein ngoại lai, thể hiện với một băng protein có kích thước khoảng 15 kDa tương ứng với kích thước của protein IL-3 và một băng protein khác có kích thước khoảng gần 18 kDa, trong khi dòng đối chứng âm (đường chạy DC) là dòng chỉ mang vector pET22b(+) và dòng mang gen nhưng không được cảm ứng IPTG (đường chạy K) đều không cho hai băng protein này. Theo lý thuyết, đoạn peptide tín hiệu PelB có kích thước khoảng 2,42 kDa. Sự xuất hiện băng protein có kích thước khoảng 18 kDa trên điện di đồ được cho là băng của protein IL-3 gắn với PelB và trong quá trình biểu hiện có thể chỉ một phần protein IL-3 được cắt khỏi đoạn peptide tín hiệu. Để chứng minh lập luận trên, phản ứng lai western blot dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể được thực hiện. Kết quả phân tích miễn dịch trên Hình 4b cho thấy có hai băng màu xuất hiện được đánh dấu bằng mũi tên, đó là băng protein IL-3 (khoảng 15 kDa) và IL-3 liên kết với PelB (khoảng 18 kDa). Kết quả liên kết miễn dịch này hoàn toàn thống nhất với kết quả phân tích SDS-PAGE. Như đã đề cập ở trên, để protein biểu hiện dưới dạng tiết thì người ta thường thiết kế thêm tín hiệu tiết vào đầu N của protein đích. Tuy nhiên, hiệu suất biểu hiện thường thấp hơn nhiều và không phải tất cả protein biểu hiện đều được tiết vào khoang chu chất mà còn tìm thấy ở trong môi trường, trong tế bào chất và màng nguyên sinh chất [ 1, 7]. Kết quả biểu hiện protein IL-3 từ chủng E. coli tái tổ hợp do chúng tôi thiết kế cũng giống như trường hợp trên. Mặc dù được thiết kế gắn thêm pelB vào đầu gen nhưng chỉ một phần protein biểu hiện ra được cắt khỏi PelB và phần còn lại vẫn gắn với tín hiệu tiết này. Theo Mergulhao et al. (2005) [ 5], kích thước protein có thể ảnh hưởng đến hiệu quả tiết. Thành phần amino acid của peptide tín hiệu và protein đích cũng đóng vai trò quan trọng. Tốc độ vận chuyển protein ngoại lai ra khoang chu chất có thể bắt nguồn từ khả năng tiết hạn chế của bộ máy vận chuyển trong E. coli. Khi khả năng này bị lấn át thì phần lớn protein biểu hiện ra dưới dạng thể vùi. Vì thế việc tối ưu mức độ biểu hiện là điều rất quan trọng. Tương tự như vậy, các dòng biến nạp với gen il-11 cũng được nuôi cấy và cảm ứng với IPTG để phân tích sự biểu hiện protein IL-11 người tái tổ hợp trong dịch phá tế bào. Sự biểu hiện protein ngoại lai được phân tích trên gel SDS-PAGE và phản ứng lai western blot (hình 5). Hình 5. Kiểm tra protein biểu hiện từ các dòng E. coli BL21 mang pETpelBil11 bằng Coomassie (a) và phản ứng lai western blot (b) 1-5. các dòng mang vector pETpelBil11; ĐC. chủng đối chứng không mang gen; K. chủng mang gen không cảm ứng IPTG; P: protein chuẩn human IL-11 (Sigma); M1. thang protein chuẩn (Fermentas); M2. thang protein màu chuẩn (Fermentas). kDa 10 70 15 25 35 40 55 170 b 1 K DC P M2 2 3 4 5 DC 14,4 18,4 25,0 35,0 45,0 66,2 116, kDa 1 K DC P M1 2 3 4 5 a TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99 98 Kết quả nhuộm Coomassie trên hình 5a cho thấy so với dòng đối chứng (ĐC) và dòng không cảm ứng IPTG (K) thì các dòng còn lại đều không quan sát thấy băng protein khác biệt trong khi kết quả lai với kháng thể kháng IL-11 người (hình 5b) cho một băng duy nhất bắt màu rất yếu, tương ứng với kích thước của protein IL-11 chuẩn (đường chạy P, mũi tên) ở các dòng số 1, 3, 4 và 5. Như vậy IL-11 biểu hiện kém trong chủng chủ và dưới dạng đơn, không giống như trường hợp IL-3. Mức độ biểu hiện yếu của IL-11 trong chủng tái tổ hợp có thể liên quan đến cấu trúc gen il-11 và tính chất của protein tạo ra. Thành phần nucleotide của gen liên quan đến mã bộ ba mã hóa cho amino acid. Khi phân tích sự phù hợp của gen il-11 đối với chủng chủ thì thấy thành phần GC của gen lên tới 71,13% và chỉ số phù hợp codon là 0,61. Thông thường để gen biểu hiện tốt trong chủng chủ thì chỉ số phù hợp codon lớn hơn 0,8 và thành phần GC nằm trong ngưỡng 30-70%. Mức độ biểu hiện protein ngoại lai trong chủng chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Theo Mehlin at el. (2006) [ 4], sự phù hợp của gen, kích thước phân tử, điểm đẳng điện (PI) của protein đích đối với E. coli liên quan mật thiết đến khả năng biểu hiện trong chủng chủ. KẾT LUẬN Gen il-3 và il-11 đã được thiết kế gắn với tín hiệu tiết pelB và đưa vào vector biểu hiện pET22b(+) và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21. Protein IL-3 tái tổ hợp tạo ra ở dạng đơn và dạng lai với tín hiệu tiết PelB trong khi protein IL-11 biểu hiện ở dạng đơn. Phân tích miễn dịch cho thấy protein IL-11 biểu hiện ở mức độ thấp, thể hiện ở tín hiệu yếu với kháng thể kháng IL-11. Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện từ nguồn kinh phí của đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị)” giai đoạn 2013-2015. Công trình có sử dụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Baneyx F., 1999. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol., 10(5): 411-21. 2. Georgiou G., Segatori L., 2005. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects. Curr Opin Biotechnol., 16(5): 538-545. 3. Kaushansky K., Shoemaker S. G., Broudy V. C., Lin N. L., Matous J. V., Alderman E. M., Aghajanian J. D., Szklut P. J., VanDyke R. E., Pearce M. K., 1992. Structure- function relationships of interleukin-3. An analysis based on the function and binding characteristics of a series of interspecies chimera of gibbon and murine interleukin-3. J. Clin. Invest., 90(5): 1879-1888. 4. Mehlin C., Boni E., Buckner F. S., Engel L., Feist T., Gelb M. H., Haji L., Kim D., Liu C., Mueller N., Myler P. J., Reddy J. T., Sampson J. N., Subramanian E., Van Voorhis W. C., Worthey E., Zucker F., Hol W. G., 2006. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol., 148(2): 144-160. 5. Mergulhao F. J. M., Summers D. K., Monteiro G. A., 2005. Recombinant protein secretion in Escherichia coli. Biotechnology Advances 23: 177-202. 6. Souto R. B., Stamm F. P., Ribela M. T., Bartolini P., Calegari G. Z., Dalmora S. L., 2012. Validation of a stability-indicating RP-LC method for the assessment of recombinant human interleukin-11 and its correlation with bioassay. Anal Sci., 28(3): 215-220. 7. es/protein_expression/ecoli/improving_prot ein_solubility/ Nguyen Thi Quy et al. 99 DESIGNING RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI STRAIN FOR EXPRESSION OF INTERLEUKIN-3 AND INTERLEUKIN-11 IN FUSION FORM WITH PelB Nguyen Thi Quy, Duong Thu Huong, Le Ngoc Giang, Le Thi Thu Hong, Do Thi Huyen, Truong Nam Hai Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Interleukin-3 và Interleukin-11 are multifunctional cytokine, which modulates the proliferation, differentiation and maturation of various types of hematopoietic cells. Genes coding for IL-3 and IL-11 (NM_000588 and NM_000641 from GenBank) linked with pelB leader and restriction sequences of NdeI (5’end), NotI (3’end) were synthesized and then introduced into a cloning vector pUC57. The gene cassets were incorporated into pET22b(+) at restriction sites for expression of il3 and il11 genes in E. coli BL21. Following induction with 0.5 mM IPTG at 37oC, a band of 15 kD, corresponding to the size of IL-3 protein (cleavage of PelB signal sequence) and another band of about 18 kD, corresponding to the size of IL-3 protein in fusion with PelB. IL-11 protein was expressed with a very faint band of about 19 kD, corresponding to the human IL-11 size. Keywords: Escherichia coli, Interleukin-3 và Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), pelB leader. Ngày nhận bài: 30-6-2013