Nghiên cứu tạo chế phẩm horse radish peroxydaseprogesterone tự gắn dùng trong bộ kit EIA-P4 và ứng dụng để chẩn đoán có thai sớm ở bò - Nguyễn Mạnh Hà

Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 65 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM HORSE RADISH PEROXYDASE- PROGESTERONE TỰ GẮN DÙNG TRONG BỘ KIT EIA-P4 VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN CÓ THAI SỚM Ở BÕ Nguyễn Mạnh Hà1*, Phan Văn Kiểm2 1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên, 2Viện Chăn nuôi Việt Nam TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu tạo chế phẩm Horse Radish Peroxydase-progesterone (HRP) sử dụng cho phản ứng ELISA để định lƣợng hàm lƣợng progesterone (P4). Kết quả sau 2 lần gắn đã thu đƣợc 2,05 ml phức hợp HRP-P4 đậm đặc (HRP-P4 tự gắn). Sau khi xác định đƣợc đƣờng cong chuẩn, đề tài đã xác định đƣợc tỷ lệ pha loãng thích hợp đối với HRP-P4 tự gắn sử dụng cho phản ứng ELISA là 1/500000. Sử dụng HRP-P4 tự gắn cho phản ứng ELISA định lƣợng hàm lƣợng P4 đối với 29 bò cái lai sinh sản F2, F3 để chẩn đoán có thai sớm cho kết quả chính xác. 16 bò có hàm lƣợng P4 từ 0,25- 0,28ng/ml ở ngày động dục (ngày 0) sau đó tăng nhanh đạt 0,88 mg/ml ở ngày thứ 7, đạt 1,83 ng/ml ở ngày thứ 21 và đạt 2,41 ng/ml ở ngày 25 sau phối giống đƣợc chẩn đoán đã có thai. Sử dụng HRP-P4 tự gắn có thể thay thế cho HRP-P4 nhập ngoại trong bộ Kit EIA-P4 trong phản ứng ELISA để định lƣợng hàm lƣợng P4 phục vụ chẩn đoán có thai sớm ở bò. Từ khóa: Horse Radish Peroxydase-Progesterone, chẩn đoán có thai sớm ở bò ĐẶT VẤN ĐỀ* Động thái của hormone progesterone (P4) có trong huyết thanh (hoặc trong sữa) là tín hiệu quan trọng phản ánh tình trạng hoạt động của buồng trứng, tình trạng mang thai của con vật cũng nhƣ tín hiệu trong một số bệnh sinh sản. Việc xác định hàm lƣợng hormone P4 trong huyết thanh (hoặc sữa) có thể nhanh chóng giúp chẩn đoán nguyên nhân chậm sinh cũng nhƣ có thai sớm với thời gian nhanh, chính xác, hạn chế những tác động không có lợi từ khám thai trực tiếp qua trực tràng đối với cơ thể con mẹ và bào thai. Để thực hiện phản ứng ELISSA định lƣợng hàm lƣợng P4 cần phải có Kit Enzyme Immuno Assay-Progesterone (EIA-P4) với các thành phần chính là: Kháng thể kháng P4 và HRP-P4. Hiện tại Kit này phải nhập ngoại, giá thành rất đắt. Mỗi lần nhập, thƣờng phải vẽ lại đƣờng cong chuẩn trong định lƣợng vì Kit không cùng một lô sản xuất. Để chủ động nguyên liệu sử dụng trong phản ứng ELISA, đồng thời giảm giá thành sản xuất, đề tài tiến hành nghiên cứu tạo chế * Tel: 0912 004814 phẩm HRP-P4 sử dụng trong Kit EIA-P4 để xác định hàm lƣợng P4 ở gia súc cái ứng dụng để chẩn đoán có thai sớm. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Bò cái lai F2, F3 đã đẻ 1-2 lứa, khối lƣợng cơ thể 400-500kg/con, sinh sản bình thƣờng, số lƣợng 29 con Vật liệu nghiên cứu - Thiết bị thí nghiệm, dụng cụ thí nghiệm, hóa chất dùng cho phản ứng ELISA của phòng thí nghiệm Bộ môn sinh sản và thụ tinh nhân tạo, Viện Chăn nuôi - Bộ kít chuẩn Kháng kháng thể: là kháng thể để kháng lại IgG của thỏ Kháng thể P4 P4 gắn enzyne: HRP-P4 (Horse Radish Peroxydase –Progesterone) Địa điểm tiến hành Đề tài đƣợc tiến hành tại Bộ môn sinh sản và thụ tinh nhân tạo- Viện Chăn nuôi Quốc gia Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 66 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tạo chế phẩm Horse Radish Peroxydase-Progesterone (HRP-P4) dùng trong Kit chẩn đoán EIA-P4 +Nghiên cứu phƣơng pháp gắn HRP-P4 + Xác định độ pha loãng thích hợp của HRP- P4 tự gắn để dùng trong phản ứng ELISA - Nghiên cứu ứng dụng để kiểm tra động dục, phối giống và chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa sau 21 ngày phối giống Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp gắn P4 với HRP - Phƣơng pháp thử độ pha loãng thích hợp của HRP-P4 tự gắn theo phƣơng pháp của ISobe. N, Nakao. T (2002) [2] - Phƣơng pháp định lƣợng ELISA-P4 theo phƣơng pháp của ISobe. N, Nakao.T (2002) [3] Phương pháp lấy mẫu sữa Lấy mẫu sữa của bò vào các ngày: ngày động dục (ngày 0), ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày thứ 25 sau phối giống. Mẫu sữa: cho khoảng 15mg K2Cr2O7 vào ống nghiệm, lấy khoảng 7-10ml sữa, trộn đều, giữ ở 40C rồi chuyển về phòng thí nghiệm. Phương pháp xử lý mẫu Sau khi đƣa về phòng thí nghiệm, mẫu đƣợc đƣa vào máy ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 15 phút sau đó tách lấy huyết tƣơng. Mẫu sau khi xử lý xong đƣợc đƣa vào tủ lạnh sâu bảo quản ở -200C cho đến khi phân tích. Định lượng Progesterone bằng kỹ thuật ELISA Phản ứng EIA-P4 đƣợc thực hiện trên đĩa nhựa chứa 8x12 giếng = 96 giếng. Kích thƣớc mỗi giếng: cao 1cm, đƣờng kính 0,7cm. Phản ứng thực hiện qua 3 bƣớc: Gắn kháng thể vào các giếng (coat đĩa), thực hiện phản ứng kết hợp đặc hiệu: kháng kháng thể- kháng thể- kháng nguyên theo cơ chế cạnh tranh và thực hiện phản ứng enzyme cơ chất. Phương pháp xác định đường cong chuẩn Xác định đƣờng cong chuẩn theo phƣơng pháp của Isobe và Nakao.T (2002)[] Phương pháp xử lý số liệu - Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Excel - Nồng độ progesteron đƣợc đánh giá theo đơn vị quốc tế ng/ml, theo chƣơng trình phần mềm đã đƣợc cài đặt sẵn trong máy tính. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả gắn HRP-P4 Tạo dung dịch 1 Hòa tan P4 với nồng độ 0,024 mmol, NHS nồng độ 0,043mmol và DCC nồng độ 0,024mmol trong DMF. Trộn đều hỗn hợp trong vòng 2 giờ đến khi xuất hiện kết tủa (dicyclohexylurea). Sản phẩm đƣợc đƣa vào ly tâm ở 2800 vòng/phút trong 20 phút. Huyễn dịch thu đƣợc là hỗn hợp ester hoạt hóa với P4 (progesterone-ester). Lọc bỏ kết tủa, lấy phần dung dịch hòa tan. Tạo dung dịch 2 Hòa tan 0,25 mol HRP trong Carbonate buffer pH 8,8, nồng độ 0,2M chứa KCl 0,15M. Để tạo phức hợp gắn HRP với P4 tiến hành theo các bƣớc sau: - Pha dung dịch 1 và 2 với tỷ lệ 1:1, lắc trong vòng 1 giờ. Hỗn hợp thu đƣợc đem ly tâm ở 2800 vòng/phút trong 10 phút. - Hoạt hóa P4 bằng hỗn hợp 2 chất NHS và DCC để tạo thành P4 hoạt động có các vị trí có khả năng gắn kết với HRP, từ đó tạo thành phức hợp HRP-P4. Cô đặc phức hợp thu đƣợc bằng ống concentrator-centripre-10 sau khi ly tâm bỏ kết tủa tách đƣợc phức hợp HRP-P4. Để loại bỏ P4 và HRP tự do trong dung dịch, cho hỗn hợp chạy qua cột Sephadex G50 và elute bằng dung dịch BPS có pH 7,4, tốc độ 6ml/giờ, sản phẩm thu đƣợc trình bày ở bảng 1. Sau khi tiến hành gắn HRP với P4 đã đƣợc hoạt hóa P4 bằng hỗn hợp NHS và DCC để tạo thành P4 hoạt động với các vị trí có khả năng gắn kết với HRP. Trong lần gắn thứ nhất, lƣợng phức hợp trƣớc khi gắn là 5ml, sau khi cô đặc còn 1,30ml. Ở lần gắn thứ 2, lƣợng hỗn hợp trƣớc khi gắn là 3ml, sau khi cô đặc còn 0,75ml. Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 67 Bảng 1. Kết quả gắn phức hợp HRP với P4 Lần gắn Phức hợp trƣớc khi gắn Phức hợp sau khi gắn Phức hợp sau khi chạy cột Sephadex G50 Phức hợp sau khi cô đặc I 5ml 4,6ml 15ml 1,30ml II 3ml 2,7ml 9ml 0,75ml Nhƣ vậy khi gắn HRP với P4 với tỷ lệ dung dịch 1 và 2 là 1:1 cho kết quả phức hợp khả quan. Sau khi phức hợp HRP-P4 chạy qua cột Sephadex G50 sản phẩm gắn sau 2 lần thí nghiệm đạt 2,05ml, kết quả này tƣơng đƣơng với kết quả của Isobe và cs (2008)[]. Xác định đƣờng cong chuẩn - Làm phản ứng ELISA + Pha loãng kháng thể đế nồng độ 4g/ml bằng dung dịch đệm carbonate. + Cho 100 µl kháng thể đã pha loãng ở trên vào mỗi giếng. Bọc kín phiến nhựa bằng film dính (tránh bay hơi) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Trong thời gian này, kháng thể sẽ bám vào đáy và thành giếng. + Đổ bỏ dung dịch trong các giếng, rửa 3 lần bằng dung dịch nƣớc sinh lý. + Cho 200 µl dung dịch Blocking để gắn chặt kháng thể vào đáy và thành giếng. + Đổ bỏ dung dịch trong các giếng, làm khô hoàn toàn, bọc kín phiến nhựa bằng film để tránh hút ẩm và bảo quản ở 40C sử dụng cho phản ứng ELISA. + Bỏ lớp film bọc phiến nhựa, cho 50 µl dung dịch chuẩn vào giếng + Cho 50 µl dung dịch HRP-P4 vào giếng + Cho 50µl dung dịch kháng thể kháng lại P4 +. Bọc kín phiến nhựa bằng film để tránh bay hơi và lắc nhẹ trong 1 phút bằng máy votex (500 vòng/phút) để các dung dịch trong giếng trộn đều với nhau. + Ủ giếng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm ít nhất 2 giờ hoặc ủ qua đêm trong tủ lạnh 40C để tạo ra sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể-kháng nguyên. Ở đây có sự cạnh tranh giữa kháng nguyên gắn enzyme và kháng nguyên không gắn enzyme cùng kết hợp với kháng thể. + Đổ bỏ dung dịch trong giếng và rửa bằng nƣớc cất 3 lần để loại bỏ phần không kết hợp. + Cho vào mỗi giếng 150µl dung dịch OPD. + Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút để cho phản ứng giữa cơ chất là OPD với enzyme xảy ra. Sản phẩm của phản ứng có màu nâu. Càng nhiều HRP-P4 gắn với kháng thể thì màu của phản ứng càng đậm, tƣơng ứng với nồng độ P4 trong mẫu càng thấp. + Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 6N và đọc màu trên quang phổ kế Opsys MR TM DYNEX trên máy vi tính. Đƣờng cong chuẩn đƣợc tính dựa trên mối tƣơng quan giữa mật độ quang học (OD) và nồng độ của dãy chuẩn. Căn cứ đƣờng cong chuẩn và mật độ quang học, ta tính đƣợc nồng độ P4 có trong máu, kết quả thể hiện ở bảng 2. Kết quả xác định độ pha loãng thích hợp của HRP-P4 tự gắn Sau khi tạo đƣợc phức hợp HRP-P4, tách chiết, cô đặc và bảo quản chế phẩm sử dụng trong phản ứng ELISA-P4 nhằm thay thế HRP-P4 nhập ngoại. Các bƣớc tiến hành : Xác định nồng độ chế phẩm HRP-P4 tự gắn ở tỷ lệ pha loãng từ 1/500 -1/500000 Xác định nồng độ pha loãng thích hợp trên cơ sở tiến hành làm phản ứng ELISA và so sánh với HRP-P4 chuẩn. HRP-P4 chuẩn đƣợc pha với tỷ lệ 1/50000 (1 phần HRP-P4 đƣợc pha với 49999 AB). HRP-P4 tự gắn đƣợc pha loãng với dung dịch Assay Buffer (AB) theo các tỷ lệ : 1/5000 ; 1/10000 ; 1/50000 ; 1/100000 và 1/500000. Cách pha các nồng độ đối với HRP-P4 tự gắn tƣơng tự nhƣ cách pha 1/500000 của HRP-P4 chuẩn. Kết quả so sánh tỷ lệ tỷ lệ pha loãng HRP-P4 tự gắn với HRP-P4 chuẩn đƣợc thể hiện ở bảng 3. Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 68 Bảng 2. Kết quả định lượng HRP-P4 chuẩn dựa trên nồng độ dãy chuẩn OD HRP-P4 chuẩn 1/5.10 4 Nồng độ P4 ng/ml 1663 0,01 1756 0.03 1840 0,1 1745 0,3 1588 1,0 1257 3,0 896 10 648 30 Bảng 3. Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở ty lệ pha loãng từ 1/500-1/500000 với HRP-P4 chuẩn P4 chuẩn (ng/ml) HRP-P4 chuẩn 1/50000 HRP-P4 tự gắn 1/5000 1/10000 1/50000 1/100000 1/500000 0,01 1660 2889 2634 2338 2040 1655 0,03 1754 2951 2745 2412 2129 1762 0,1 1843 2859 2566 2274 2128 1855 0,3 1746 2674 2439 2159 1988 1776 1 1583 2460 2158 1868 1750 1578 3 1254 2209 1958 1630 1396 1247 10 893 1914 1609 1353 1146 897 30 643 1582 1208 1034 893 655 Bảng 4. Kết quả so sánh độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở tỷ lệ 1/500000-1/1000000 với HRP-P4 chuẩn P4 chuẩn (ng/ml) HRP-P4 chuẩn 1/50000 HRP-P4 tự gắn 1/500000 1/600000 1/700000 1/800000 1/1000000 0,01 1668 1665 1373 1036 0795 0649 0,03 1747 1762 1473 1142 0871 0786 0,1 1848 1845 1315 1023 0875 0764 0,3 1756 1776 1183 0856 0812 0651 1 1588 1578 0981 0755 0675 0533 3 1263 1257 0767 0654 0531 0456 10 0897 0878 0651 0553 0500 0447 30 0648 0650 0427 0405 0396 0374 Số liệu thu đƣợc ở bảng 3 cho thấy: Khi pha loãng HRP-P4 tự gắn ở mức 1/5000, 1/10000 nhận thấy giá trị OD trung bình cao hơn nhiều so với HRP-P4 chuẩn. Độ pha loãng 1/5000, với nồng độ P4 là 30ng/ml thì giá trị OD của HRP-P4 tự gắn đạt 1582, tƣơng đƣơng với giá trị OD ở nồng độ 1ng/ml (1583) của HRP-P4 chuẩn. Độ pha loãng 1/10000, với nồng độ P4 là 30ng/ml thì giá trị OD của HRP-P4 tự gắn đạt 1208, tƣơng đƣơng với giá trị OD ở nồng độ 3ng/ml của HRP-P4 chuẩn. Nhƣ vậy, khi tăng nồng độ pha loãng của HRP-P4 tự gắn so với nồng độ HRP-P4 chuẩn đã làm tăng mức độ chênh lệch giá trị OD. Tuy nhiên, ở mức pha loãng 1/500000 của HRP-P4 tự gắn, giá trị OD tƣơng đƣơng so với mức pha loãng 1/50000 của HRP-P4 chuẩn cùng nồng độ của P4 chuẩn. Xác định nồng độ chế phẩm HRP-P4 tự gắn ở tỷ lệ pha loãng từ 1/500000-1/1000000 Để xác định chính xác độ pha loãng thích hợp của HRP-P4 tự gắn. Thí nghiệm đƣợc tiến hành lặp lại ở độ pha loãng 1/500000 và với các độ pha loãng cao hơn: 1/600000; 1/700000; 1/800000; 1/1000000. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 4. Độ pha loãng HRP-P4 tự gắn ở mức 1/500000, cho kết quả giá trị OD trung bình tƣơng đƣợc với HRP-P4 chuẩn (648 và 650). Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 69 Khi pha HRP-P4 tự chế loãng hơn 1/600000 (427); 1/700000 (405); 1/800000 (396); 1/1000000 (374) thấy kết quả OD trung bình thấp hơn nhiều so với HRP-P4 chuẩn. Từ kết quả ở bảng 3 và 4, hình 2 và hình 3, nhận thấy HRP-P4 tự chế với độ pha loãng 1/500000, giá trị OD trung bình tƣơng đƣơng với HRP-P4 chuẩn ở nồng độ P4 chuẩn 30ng/ml. Kết quả này cần đƣợc thử nghiệm trong phản ứng ELISA để chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa thay thể HRP-P4 nhập ngoại. Kết quả ứng dụng HRP-P4 tự gắn để xác định tình trạng động dục, có thai sớm ở bò sữa sau 21 ngày phối giống Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 29 bò lai hƣớng sữa F2, F3 sinh sản bình thƣờng, 4-6 tuổi, đã đẻ 1-2 lứa. Các mẫu sữa đƣợc lấy vào ngày động dục (ngày 0), ngày 7, ngày 15 và 21 sau phối giống. Sau khi có kết quả định lƣợng về hàm lƣợng progesterone, những bò có hàm lƣợng progesterone tƣơng đƣơng trong các ngày lấy mẫu thì ghép thành 1 nhóm để khám thai đối chứng ở ngày 45. Kết quả thể hiện ở bảng 5. Số liệu ở bảng 5 cho thấy: +) Nhóm 16 trong 29 bò có hàm lƣợng P4 vào ngày động dục dao động 0,25-0,28ng/ml, ngày 7 hàm lƣợng P4 tăng nhanh và đạt đỉnh cao vào ngày 15, 21 và 25 từ 1,65-2,41ng/ml đƣợc chẩn đoán đã có thai. Theo Phan Văn Kiểm và CS, (2003) [1], nếu hàm lƣợng P4 vào ngày động dục và phối giống thấp (<0,35ng/ml) và tăng cao từ ngày 7, 15, 21 và 25 thì tỷ lệ đậu thai đạt 85%. Nhƣ vậy kết quả xác định hàm lƣợng P4 ở đề tài này tƣơng đƣơng với kết quả đã công bố của tác giả trên và phù hợp với kết quả khám thai sau 45 ngày.. +) Nhóm 7 trong số 29 bò có hàm lƣợng P4 vào ngày động dục thấp 0,21-0,22ng/ml, hàm lƣợng tăng dần từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 15 từ 0,60-1,35ng/ml, song từ ngày thứ 21 đến ngày 25 thì hàm lƣợng P4 giảm mạnh từ 0,67 xuống còn 0,32ng/ml. Với nồng độ P4 thấp ở ngày 21 sau phối giống có thể xác định là không có thai, kết quả phù hợp với kết quả khám thai sau 45 ngày. +) Nhóm 3 trong số 29 bò có hàm lƣợng P4 vào ngày động dục, ngày 7, ngày 15, ngày 21 và ngày 25 thấp (từ 0,15-0,23ng/ml). Nhƣng thực tế bò này không động dục (phối giống nhầm) Bảng 5. Hàm lượng P4 ở bò sau khi phối giống Nhóm TN n Hàm lƣợng P4 trong sữa (ng/ml) ( X mX ) Kết quả khám thai Ngày 0 Ngày 7 Ngày 15 Ngày 21 Ngày 25 HRP-P4 tự gắn 16 0,25 ± 0,02 0,88 ± 0,02 1,65 ± 0,03 1,83 ± 0,03 2,41± 0,05 16 HRP-P4 nhập ngoại 16 0,28 ± 0,03 0,91 ± 0,02 1,55 ± 0,02 1,72 ±0,02 2,38 ±0,03 16 HRP-P4 tự gắn 7 0,22 ± 0,02 0,61 ± 0,03 1,15 ± 0,02 0,58 ±0,02 0,36 ±0,02 0 HRP-P4 nhập ngoại 7 0,21 ± 0,02 0,60 ± 0,03 1,35 ± 0,06 0,67 ±0,04 0,32 ±0,01 0 HRP-P4 tự gắn 3 0,15 ± 0,01 0,18 ± 0,01 0,21 ± 0,03 0,20 ±0,02 0,23 ±0,03 0 HRP-P4 nhập ngoại 3 0,18 ± 0,03 0,17 ± 0,02 0,23 ± 0,01 0,22 ±0,03 0,26 ±0,02 0 HRP-P4 tự gắn 3 1,25 ± 0,04 1,35 ± 0,05 1,32 ± 0,02 1,45 ±0,06 1,33 ±0,05 0 HRP-P4 nhập ngoại 3 1,27 ± 0,05 1,32 ± 0,03 1,36 ± 0,07 1,41 ±0,04 1,32 ±0,05 0 Tổng 29 Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 70 +) Nhóm 3 trong 29 bò có hàm lƣợng P4 vào ngày động dục, ngày 7, ngày 15, ngày 21 và ngày 25 cao (từ 1,25-1,45ng/ml). Chứng tỏ bò này thể vàng đang hoạt động, dẫn tinh viên đã chẩn đoán nhầm và phối giống sai. Theo Isobe và cs, (2002) [2], qua hàm lƣợng P4 trong mẫu xét nghiệm cao hay thấp có thể biết tình trạng hoạt động của buồng trứng của bò sữa, bình thƣơng hay không bình thƣờng, có thể vàng hay không có thể vàng, từ đó có biện pháp xử lý thích hợp. Phan Văn Kiểm và cs, (2003) [1], hàm lƣợng P4 vào ngày động dục và phối thƣờng thấp (0,1-0,35ng/ml), hàm lƣợng này bắt đầu tăng vào ngày thứ 4, thứ 5 của chu kỳ, tiếp tục tăng từ ngày 7 đến ngày 21, 25 cao (>1ng/ml) chứng tỏ bò đã mang thai. Nhƣ vậy, nếu hàm lƣợng P4 ở bò vào ngày động dục và phối giống thấp (0,21-0,22ng/ml) ngày 7 đến ngày 15 tăng cao (>1ng/ml) và ngày 21 đến ngày 25 vẫn duy trì và tăng cao (>1ng/ml) chẩn đoán bò đã mang thai. Từ kết quả thu đƣợc nhận thấy: khi sử dụng HRP-P4 tự gắn kết quả thu đƣợc tƣơng đƣơng so với HRP-P4 nhập ngoại song độ biến động nhỏ hơn, kết quả của hai phƣơng pháp là tƣơng đƣơng nhau và có thể dùng một trong hai HRP-P4 xét nghiệm P4 để chẩn đoán thời điểm bò động dục, mang thai hay không mang thai sau phối giống từ ngày thứ 21. Kỹ thuật này cũng cho phép kiểm tra tay nghề của các kỹ thuật viên thụ tinh nhân tạo. KẾT LUẬN Đề tài đã gắn thành công phức hợp HRP-P4 theo quy trình của ISobe.N và cs, (2002) [2]. Kết quả thu đƣợc khi gắn HRP với P4 với tỷ lệ dung dịch 1 và dung dịch 2 là 1: 1 cho kết quả phức hợp khả quan. Sản phẩm thu đƣợc đạt thể tích 2,05ml HRP-P4 đậm đặc. Độ pha loãng thích hợp nhất đối với HRP-P4 tự gắn đƣợc xác định với tỷ lệ là 1/500000. Với tỷ lệ pha loãng 1/500000 của HRP-P4 tự gắn, hàm lƣợng P4 đƣợc xác đinh trong phản ứng ELISA-P4 cho kết quả tƣơng đƣơng với hàm lƣợng P4 trong HRP-P4 nhập ngoại. Có thể thay thế HRP-P4 ngoại nhập bằng HRP-P4 tự gắn trong các xét nghiệm EIA-P4. Sử dụng HRP-P4 tự gắn để chẩn đoán tình trạng động dục và chẩn đoán có thai sớm ở bò cái sinh sản sau phối giống cho kết quả chính xác. Đối với bò cái sinh sản bình thƣờng, ở thời điểm động dục, hàm lƣợng P4 thấp dƣới 0,3 ng/ml (nhóm 16 bò có hàm lƣợng P4 từ 0,25-0,28ng/ml), sau phối giống 7 ngày hàm lƣợng P4 đạt 0,88 mg/ml và tăng nhanh đạt 1,83 ng/ml và tiếp tục tăng cao ở những ngày tiếp theo. Những bò có hàm lƣợng P4 biến động theo quy luật trên có thể chẩn đoán là có chửa sau phối giống 21 ngày. Sử dụng HRP-P4 tự gắn có thể thay thế HRP- P4 nhập ngoại trong bộ Kit EIA-P4 để định lƣợng hàm lƣợng P4 trong chẩn đoán có thai sớm ở bò. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Văn Kiểm, Tăng Xuân Lƣu, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa (2003) ―Ứng dụng kết quả nghiên cứu hàm lƣợng P4 để chấn đoán và điều trị rối loạn sinh sản bò sữa‖, Hội nghị Công nghệ sinh sản toàn quốc, Hà Nội. 2. Isobe. N, Nakao.T (2002), ―Direct Enzym Immunoassay of estron sulphate in the plasma of cattle‖, Hiroshima, Japan 3. Isobe. N, Nakao.T (2002), ―Theory and application of ELISA”, Hiroshima, Japan Nguyễn Mạnh Hà và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 115(01): 65 - 71 71 SUMMARY RESEARCH TO MAKE THE SELL-ATTACHED HORSE RADISH PEROXYDASE-PROGESTERONE USING IN THE KIT EIA-P4 AND APPLYING IN ODER TO DIAGNOSE THE EARLY PREGNANT OF COWS Nguyen Manh Ha 1* , Phan Van Kiem 2 1College of Agriculture and Forestry – TNU, The subject research to make the Horse Radish Peroxydase-progesterone (HRP) using for ELISA reaction in order to determine progesterone (P4) concentration. The result after two times of attachment received 2.05 ml composite of solid HRP-P4 (sell- attached HRP-P4). After determining the standard curve, the subject determined the suitable dilution rate of sell-attached HRP-P4 using for reaction ELISA is 1/500000. Using sell-attached HRP-P4 for ELISA reaction to determine concentration P4 in order to diagnose early pregnant with 29 reproductive cross-bred cows F2, F3. 16 cows are diagnosed pregnancy that have P4 concentration from 0.25ng/ml to 0.28ng/ml in estrus day (day 0), then increase quickly geting 0.88ng/ml at 7 th , 1.83 ng/ml in 21 st and 2.41 ng/ml in day 25 th after insemination. Using sell-attached HRP-P4 can be able to replace HRP-P4 import in EIA-P4 Kit in ELISA reaction to determine concentration P4 in order to diagnose the early pregnant of cow. Key word: Horse Radish Peroxydase-Progesterone, diagnose early pregnant in cow Ngày nhận bài:26/11/2013; Ngày phản biện:10/12/2013; Ngày duyệt đăng: 07/02/2014 Phản biện khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan – Trường Đại học Nông Lâm - ĐHTN * Tel: 0912 004814