Nghiên cứu tách chiết và xác định tính chất của chất kháng sinh từ 2 chủng xạ khuẩn HT28 và K4

Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 71 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH TỪ 2 CHỦNG XẠ KHUẨN HT28 VÀ K4 Vi Thị Đoan Chính*, Trịnh Ngọc Hoàng, Liễu Thị Phương, Hoàng Thị Bích Luân Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Hai chủng xạ khuẩn HT28 và K4 có hoạt tính kháng sinh (HTKS) cao, có hoạt phổ rộng được sử dụng trong các thí nghiệm để nghiên cứu tách chiết chất kháng sinh (CKS) và xác định các tính chất của chất kháng sinh. Để tách chiết chất kháng sinh của chủng HT28 từ sinh khối, ethanol là dung môi cho hiệu quả cao nhất, để tách chiết CKS từ dịch ngoại bào thì iso-butanol cho hiệu quả cao hơn. Đối với chủng K4, để tách chiết chất kháng sinh từ cả sinh khối và dịch ngoại bào, iso-butanol và ethanol đều cho hiệu quả cao. Khả năng hoà tan trong dung môi của các CKS tốt nhất ở pH = 3. Một số tính chất của CKS của chủng HT28 và K4 đã được nghiên cứu: chất kháng sinh của chủng HT28 thuộc loại kém bền với nhiệt độ, CKS của chủng K4 thuộc loại bền với nhiệt độ. Chất kháng sinh của cả 2 chủng HT28 và K4 đều thuộc loại bền trong pH. Dịch chiết kháng sinh vẫn giữ được hoạt tính trong dải pH từ 3 ÷ 9. Từ khóa: chất kháng sinh, chủng, dịch chiết kháng sinh, hoạt tính kháng sinh, xạ khuẩn. ∗ ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, quanh năm nóng, ẩm, mưa nhiều nên có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng khá cao, vì vậy nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh là khá lớn. Tuy nhiên, bên cạnh hiệu quả chữa bệnh của thuốc kháng sinh, Việt Nam đang phải đối đầu với hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi sinh vật (VSV) gây bệnh. Theo nhiều nghiên cứu tại một số bệnh viện lớn của Việt Nam cho thấy, tỷ lệ các VSV kháng lại với các kháng sinh thông thường luôn cao hơn 30% [6] Đứng trước một thực trạng như vậy, để khắc phục hiện tượng kháng thuốc, một yêu cầu cấp thiết đặt ra là phải tiếp tục tìm kiếm phát hiện ra các kháng sinh mới. Trong số các VSV sinh kháng sinh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất. Trong số các chất kháng sinh hiện đã biết, có tới hơn 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Vì vậy, xạ khuẩn được xem là nguồn tài nguyên quý để tìm kiếm các kháng sinh mới. ∗ Tel: 0987 123 606; Email: vichinh57@gmail.com Hai chủng xạ khuẩn HT28 và K4 phân lập được ở Thái Nguyên, có hoạt tính kháng sinh cao, có hoạt phổ rộng, đặc biệt là có khả năng kháng được một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. Hai chủng này đã được chúng tôi tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá [1]. Trong bài báo này, chúng tôi tiếp tục thông báo các kết quả nghiên cứu tách chiết CKS và một số tính chất của CKS từ 2 chủng HT28 và K4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu - 2 chủng xạ khuẩn HT28 và K4 có HTKS cao, có hoạt phổ rộng, được chọn ra trong số các chủng xạ khuẩn phân lập được ở Thái Nguyên. - VSV kiểm định: là trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145) do Viện Kiểm nghiệm – Bộ Y tế cung cấp. Phương pháp - Xác định HTKS: theo phương pháp thỏi thạch để sơ tuyển xạ khuẩn và phương pháp đục lỗ để sàng lọc xạ khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 72 - Tách chiết CKS bằng các dung môi hữu cơ: dịch lên men sau khi loại bỏ sinh khối, bổ sung dung môi hữu cơ (tỷ lệ 1 : 1). Xác định hoạt tính của dịch kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. - Xác định khả năng bền nhiệt của CKS: xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau trong thời gian: 20 phút, 40 phút và 60 phút. Xác định hoạt tính của dịch kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. - Xác định khả năng bền với pH của CKS: xử lý dịch kháng sinh thô ở các pH khác nhau từ 3 ÷ 9 trong thời gian 10 phút, sau chỉnh pH = 7. Xác định hoạt tính của dịch kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tách chiết chất kháng sinh Khả năng hoà tan của chất kháng sinh trong các dung môi khác nhau là một yếu tố cần được chú ý để thu nhận kháng sinh. Tuy nhiên, độ hoà tan của chất kháng sinh rất khác nhau trong các loại dung môi. Để xác định được dung môi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh của xạ khuẩn, chúng tôi nuôi xạ khuẩn trên các môi trường lên men thích hợp. Dịch kháng sinh thô được chiết bằng 6 loại dung môi khác nhau. HTKS của dịch chiết được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện trên bảng1. Bảng 1. HTKS của dịch chiết từ sinh khối và dịch ngoại bào TT Dung môi hữ cơ HTKS của chủng HT28 (D-d, mm) HTKS của chủng K4 (D-d, mm) Sinh khối Dịch ng. bào Sinh khối Dịch ng. bào 1 Etyl acetate 14,2 ± 0,2 13,5 ± 0,2 18,3 ± 0,3 24,4 ± 0,8 2 Iso-butanol 15,6 ± 0,6 18,0 ± 0,3 24,8 ± 0,3 29,7 ± 1,0 3 Methanol 14,4 ± 0,7 13,7 ± 0,6 21,2 ± 0,2 26,3 ± 1,0 4 n-propanol 13,7 ± 0,6 14,1 ± 1,1 22,8 ± 0,6 25,2 ± 0,8 5 Ethanol 19,6 ± 0,7 12,2 ± 0,1 21,5 ± 0,6 28,5 ± 0,7 6 Acetone 16,3 ± 0,3 16,3 ± 0,6 23,3 ± 0,6 24,3 ± 0,7 Hình 1. Hoạt tính của dịch chiết kháng sinh từ chủng HT28 ở các pH khác nhau 1.Etyl axetate 2. Iso-butanol 3. Metanol 4. n-propanol 5. Etanol 6. Aceton Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 73 Hình 2. Hoạt tính của dịch chiết kháng sinh chủng K4 ở các pH khác nhau 1.Etyl acetate 2. Iso-butanol 3. Methanol 4. n-propanol 5. Etanol 6. Aceton Kết quả trên bảng 1 cho thấy, CKS của 2 chủng nằm trong cả sinh khối và dịch ngoại bào. Cả 6 loại dung môi trên đều có thể sử dụng để tách chiết CKS. Đó đều là những dung môi thường dùng, có tính hoà tan tốt và ít độc. Đối với chủng HT28, để tách chiết CKS từ sinh khối, ethanol là dung môi cho hiệu quả cao nhất, dịch chiết bằng dung môi này có hoạt lực khá cao (19,6 mm). Nhưng để tách chiết kháng sinh từ dịch ngoại bào thì iso- butanol lại cho hiệu quả cao hơn. Đối với chủng K4, trong 6 loại dung môi sử dụng, iso-butanol cho hiệu quả cao nhất. Dịch kháng sinh thô chiết bằng iso-butanol có hoạt lực khá cao, đặc biệt là dịch chiết từ dịch ngoại bào có hiệu số vòng vô khuẩn (VVK) tới 29,7 mm. Ngoài iso-butanol, có thể sử dụng ethanol để tách chiết CKS từ sinh khối. Theo kết quả của nhiều nghiên trước đã công bố, có nhiều loại dung môi được sử dụng để tách chiết CKS từ xạ khuẩn [2][3][5]. Tuy nhiên, việc sử dụng loại dung môi nào là thích hợp lại tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của từng loại CKS. Khả năng hoà tan của CKS trong dung môi còn phụ thuộc vào pH. Để xác định pH cho hiệu quả tách chiết CKS cao nhất, chúng tôi tiến hành tách chiết CKS từ dịch ngoại bào trong 6 loại dung môi trên ở các ph = 3, pH = 7 và pH = 10. Kết quả thể hiện trên hình 1 và hình 2 cho thấy, cả 2 chủng HT28 và K4, ở pH = 3, dịch chiết đều có hoạt lực cao hơn so với dịch chiết trong các dung môi có pH = 7 và pH = 10. Điều này đã chứng tỏ khả năng hoà tan trong dung môi của các CKS tốt nhất trong môi trường axit (pH = 3). Ngoài ra, một điểm cần lưu ý là pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến việc CKS đi ra ngoài môi trường nhiều hay tích tụ trong sinh khối nhiều [4]. Vì vậy, để tách chiết CKS từ 2 chủng HT28 và K4 có hiệu quả, nên tách chiết ở trong môi trường axit. Khả năng bền nhiệt của CKS Để xác định khả năng bền nhiệt của CKS, chúng tôi tiến hành nuôi xạ khuẩn trên môi trường lên men thích hợp. Thu dịch kháng sinh thô để xử lý với nhiệt độ ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 40oC, 70oC, 80oC và 100oC trong các khoảng thời gian: 20 phút, 40 phút và 60 phút. Xác định hoạt tính của dịch chiết bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện trên bảng 2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 74 Bảng 2. HTKS của dịch kháng sinh thô sau khi đã xử lý với nhiệt độ Thời gian xử lý Ký hiệu chủng Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) 40oC 70oC 80oC 100oC 20 phút HT 28 20,8 ± 0,6 19,3 ± 0,7 19,0 ± 0,4 18,9 ± 0,5 K4 19,5 ± 0,7 19,2 ± 0,3 18,8 ± 0,1 18,3 ± 0,4 40 phút HT 28 20,5 ± 0,2 19,2 ± 0,8 18.1 ± 0,5 14,4 ± 0,5 K4 19,5 ± 0,5 19,0 ± 0,1 18,7 ± 0,1 18,3 ± 0,1 60 phút HT 28 17,4 ± 1,1 17,3 ± 0,6 15,0 ± 0,4 5,4 ± 0,9 K4 19,5 ± 0,7 19,0 ± 0,4 18,7 ± 0,1 18,1 ± 0,4 (Đối chứng của chủng HT 28: 20,8 ± 1,2. Đối chứng của chủng K4: 22,7 ± 0,2) a. Chủng HT 28 b. Chủng K4 Hình 3. HTKS của dịch chiết ở các nhiệt độ khác nhau Kết quả trên đã chứng tỏ, độ bền với nhiệt độ của CKS chủng HT 28 và K4 có sự khác nhau rất rõ rệt. Chủng HT28: HTKS giảm rất nhanh theo nhiệt độ xử lý. Ở 40oC trong 20 phút, HTKS hầu như không thay đổi và có giảm nhẹ khi kéo dài thời gian xử lý lên 60 phút, nhưng ở 100oC trong 60 phút, hoạt tính đã giảm xuống rất nhanh, chỉ còn khoảng 25% so với đối chứng (hình 3 a). Chủng K4: HTKS hầu như không thay đổi theo thời gian xử lý. Khi tăng nhiệt độ xử lý từ 40oC đến 100oC, hoạt tính có giảm dần, nhưng mức độ giảm không nhiều. Đặc biệt, ở 100oC với thời gian xử lý 60 phút, HTKS của dịch chiết vẫn còn khoảng 80% so với đối chứng (hình 3 b) Theo kết quả của nhiều nghiên cứu trước về khả năng bền nhiệt của CKS, trong đó có CKS xạ khuẩn đã công bố có nhiều CKS rất bền với nhiệt độ, ở 70oC trong thời gian 60 phút, HTKS vẫn hầu như không thay đổi, thậm chí, ở 100oC và kéo dài tới 60 phút, HTKS vẫn còn khoảng 50% hoặc chỉ giảm đi đôi chút [2][3]. Tuy nhiên, bên cạnh cũng có nhiều CKS không có khả năng bền nhiệt, chỉ mới hơn 50oC, HTKS đã bị giảm hoặc mất hoàn toàn [5]. Như vậy, so sánh với các kết quả nghiên cứu trước, CKS chủng HT28 thuộc loại kém bền với nhiệt độ. Vì vậy, việc tách chiết, sử dụng và bảo quản CKS này nên ở nhiệt độ dưới 70oC để đảm bảo hoạt lực của CKS. CKS chủng K4 thuộc loại bền nhiệt. Đây là một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 75 tính chất rất thuận lợi cho việc tách chiết, tinh chế và bảo quản CKS. Khả năng bền với pH của CKS Khả năng bền vững của CKS với pH là một đặc điểm đáng chú ý vì điều này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ tách chiết mà còn có ý nghĩa trong ứng dụng. Để xác định khả năng bền với pH của CKS, chúng tôi nuôi 2 chủng HT28 và K4 trên môi trường lên men thích hợp. Thu dịch kháng sinh thô và điều chỉnh pH để có các mức pH từ 3 ÷ 9 và giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó điều chỉnh về pH = 7. HTKS của dịch chiết được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện trên bảng 3 và hình 4. Kết quả trên bảng 4 cho thấy, dịch kháng sinh của cả 2 chủng vẫn giữ được hoạt tính ở trong dải pH từ 3 ÷ 9 trong thời gian 10 phút đã chứng tỏ: các CKS này đều có khả năng bền với pH. Dịch chiết kháng sinh từ chủng HT28 có hoạt lực mạnh nhất ở pH = 7, hơi giảm dần trong các môi trường axit và kiềm. Tuy nhiên, mức độ giảm không nhiều. Chủng K4, dịch chiết kháng sinh có hoạt lực mạnh nhất ở pH = 6, giảm dần trong môi trường có pH từ 7 đến 9 và giảm mạnh hơn trong môi trường có pH từ 5 đến 3. Kết quả này đã chứng tỏ CKS của chủng K4 bền vững hơn trong môi trường kiềm và axit nhẹ. Khả năng bền vững của các CKS với pH rất khác nhau và phụ thuộc vào bản chất hoá học của từng CKS. Nhiều CKS có độ mẫn cảm cao với axit, vì vậy sẽ bị mất hoạt tính kháng khuẩn ở trong môi trường axit. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong thực tiễn, đặc biệt là khi dùng các loại thuốc kháng sinh qua đường miệng, dịch dạ dày có pH = 1,5 – 2,0 có thể sẽ làm mất tác dụng của thuốc. Song, ngược lại, có những CKS lại bị giảm hoặc mất hoạt tính trong môi trường kiềm. Bảng 3. Khả năng bền với pH của dịch KS pH Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) Chủng HT28 Chủng K4 3 15,8 ± 0,5 14,6 ± 0,8 4 17,1 ± 0,3 14,8 ± 0,7 5 17,6 ± 0,5 15,1 ± 0,4 6 17,6 ± 0,8 25,8 ± 0,6 7 19,1 ± 0,1 20,1 ± 0,1 8 18,0 ± 0,1 19,6 ± 0,6 9 17,0 ± 0,2 18,4 ± 0,8 Như vậy, từ các kết quả trên cho thấy, CKS từ 2 chủng HT28 và K4 thuộc loại bền với pH. Đây là một đặc điểm rất lợi thế trong công nghệ thu hồi, tinh chế CKS, đồng thời mở rộng khả năng ứng dụng của các CKS này. Hình 4. HTKS của dịch chiết ở các pH khác nhau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên Vi Thị Đoan Chính và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 82(06): 71 - 76 76 KẾT LUẬN 1. Chất kháng sinh của 2 chủng HT28 và K4 nằm cả trong sinh khối và dịch ngoại bào. Trong số 6 loại dung môi hữu cơ được sử dụng để tách chiết CKS, đối với chủng HT28, ethanol là dung môi để tách chiết CKS từ sinh khối và iso-butanol là dung môi để tách chiết CKS từ dịch ngoại bào cho hiệu quả cao nhất. Đối với chủng K4, iso-butanol và ethanol là 2 dung môi cho hiệu quả cao nhất để tách chiết CKS từ sinh khối và dịch ngoại bào. Khả năng hoà tan của các CKS trong dung môi tốt nhất ở pH = 3. 2. Chất kháng sinh của chủng HT28 thuộc loại kém bền với nhiệt độ, ở 100oC trong 60 phút, hoạt tính giảm chỉ còn khoảng 25%. CKS của chủng K4 thuộc loại bền nhiệt, ở 100oC trong 60 phút, hoạt tính vẫn còn khoảng 80%. 3. Chất kháng sinh của cả 2 chủng HT28 và K4 thuộc loại bền với pH. Dịch chiết kháng sinh vẫn giữ được hoạt tính trong dải pH từ 3 ÷ 9. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]] .Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hoàng, Liễu Thị Phương (2010), “Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân lập ở Thái Nguyên với một số chủng Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa” Tạp chí Khoa học & Công nghệ, tập 66, số 4, 2010. [2]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, 2006. [3]. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở việt nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, 1994. [4]. Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Việt Nam. [5]. Nguyễn Thị Thu Thuỷ, Hoàng Thị Kim Hồng (2009): Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa màu ở Thừa Thiên Huế. Hội nghị CNSH toàn quốc 2009. [6]. Nguyễn Thị Vinh và Cs.(2006), Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam năm 2005. Thông tin Dược lâm sàng, số 7, tr.15-18. SUMMARY STUDY ON EXTRACTION AND PROPERTY OF ANTIBIOTIC FROM TWO ACTINOMYCETES STRAINS HT28 AND K4 Vi Thi Doan Chinh∗, Trinh Ngoc Hoang, Lieu Thi Phuong, Hoang Thi Bich Luan The College of Sciences - Thai Nguyen University Two actinomycetes strains HT28 and K4 with strong antibiotic activity and wide activated range were used for antibiotic extracted and determined experiments. To extracted antibiotic of HT28 strain from biomass, ethanol was the most suitable, to extracted antibiotic from culture perilymph, Isobutanol was more suitable. With K4 strain, both isobutanol and ethanol were more effective. Antibiotic was dissolved in solutions at pH 3. Some antibiotic properties such as stable ability in pH and temperature were determined, K4’s antibiotic was stable in temperature condition but HT28’s was not. The antibiotic of 2 strains were stable in pH condition. Extracted antibiotic solution keep activity in pH range 3 – 9. Key words: antibiotic, strain, antibiotic extracted solution, antibiotic activity, actinomycetes. ∗ Tel: 0987 123 606; Email: vichinh57@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên