Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (houttuynia cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội - Hoàng Văn Tuấn

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID TỪ CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG) THU HÁI TẠI HÀ NỘI Hoàng Văn Tuấn*1, Phạm Hương Sơn1, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Đình Luyện2, Nguyễn Thanh Hảo3 1Viện Ứng dụng Công nghệ, *vantuan197@gmail.com 2Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam 3Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TÓM TẮT: Cây Diếp cá, một loại thực vật truyền thống ở Việt Nam, có nhiều hoạt tính sinh học như chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn và tăng cường hiệu quả miễn dịch, các thành phần có hoạt tính sinh học trong diếp cá chủ yếu là flavonoid. Trong nghiên cứu này, dịch chiết diếp cá được thu nhận bằng cách trích ly sử dụng 2 dung môi là nước và etanol, sau đó xác định hàm lượng tổng flavonoid, định lượng flavonoid, xác định hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết. Kết quả thu được cho thấy, tổng flavonoid thu được trong dịch chiết etanol cao hơn trong dịch chiết nước, lần lượt là 2,19% và 0,83%. Hàm lượng rutin và quercetin trong dịch chiết etanol xác định được là 0,14% và 0,01%. Ngoài ra, dịch chiết etanol có khả năng kháng được 4 chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus. Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết etanol đạt được là 61,23%, giá trị SC50 là 19,56 mg/ml. Từ khóa: Diếp cá, flavonoid, kháng khuẩn, chống oxy hóa, quercetin MỞ ĐẦU Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) hay còn gọi là giấp cá hoặc ngư tinh thảo, là một loại thực vật truyền thống được trồng rất phổ biến ở Việt Nam và một số nước châu Á. Trong đông y, diếp cá được sử dụng trong các bài thuốc để trị bệnh trĩ, mụn nhọt, lên sởi, đau mắt [4]. Diếp cá là đối tượng nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau và đã được báo cáo là có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch do chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như rutin, quercetin [3]. Tại Việt Nam, Trần Thanh Lương và nnk., (2007) [6] đã xác định được thành phần của 2 loại flavonoid có trong Diếp cá thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh là quercetin (cao dầu hỏa) và rutin (cao butanol). Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cũng đã được xác định trong nghiên cứu này. Trần Thị Việt Hoa và nnk. (2008) [5] đã phân lập và xác định được cấu trúc của 3 thành phần có trong cây diếp cá là sesamin, β-sitosterol và quercitrin từ cao ete dầu hỏa và etyl acetat. Trong nghiên cứu này, trên nguồn diếp cá được thu hái tại Hà Nội, chúng tôi nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxy hóa) của cây diếp cá và dịch chiết của nó nhằm tạo cơ sở cho việc khai thác và ứng dụng cây diếp cá cho 1 số ngành như y học, thực phẩm chức năng và là cơ sở để so sánh với các nguồn diếp cá khác. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Cây Diếp cá được thu hái tại Xuân Đỉnh, Từ Liêm, Hà Nội. Cây Diếp cá được cắt gốc, rửa sạch (cành và lá) và sấy khô đến độ ẩm <13%, bảo quản ở nhiệt độ phòng sử dụng cho nghiên cứu. Phương pháp Phương pháp tách chiết Mẫu được xay nhỏ sau đó ngâm trong etanol 70% và nước ở nhiệt độ 60 oC trong 3 giờ [9]. Dịch chiết thô sau đó được lọc và cô loại dung môi trên thiết bị cô chân không Heidolph (Đức). Hiệu quả tách chiết (Y,%) được xác định dựa vào tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu sử dụng. Phương pháp xác định tổng flavonoid Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang et al. (2002) [1] dựa trên nguyên tắc: Flavonoid trong diếp cá tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3. Phản ứng này dùng để xác định hàm lượng flavonoid tổng có trong diếp cá. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Lập phương trình đường chuẩn: lấy 10 mg Quercetin hòa tan trong ethanol 80% sau đó pha loãng ra các nồng độ 25, 50 và 100 µg/ml. Hút 0,5 ml dung dịch sau khi pha loãng bổ sung 1,5 ml ethanol 95%, 0,1ml AlCl3, 0,1 ml CH3COOK và 2,8 ml nước cất. Sau đó, hỗn hợp được lắc đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút, rồi tiến hành so màu ở bước sóng 415 nm trên máy UV-Vis V630 (Hoa Kỳ), mẫu trắng sử dụng nước cất. Lấy 0,5 mL dịch chiết diếp cá và làm tương tự như các bước lập phương trình đường chuẩn, tổng flavonoid được xác định theo công thức: F(%) = (a×V/m)×n×10-6×100. Trong đó, a là hàm lượng quercetin (µg/ml) được xác định từ phương trình đường chuẩn; V là tổng thể tích dịch chiết (mL); m là khối lượng mẫu (g); n là hệ số pha loãng. Phương pháp định lượng flavonoid (Rutin và Quercetin) Hàm lượng flavonoid (Rutin và Quercetin) được định lượng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên máy Shimadzu (Nhật Bản) với: tốc độ dòng là 0,5 ml/phút; detector UV là 255 nm; pha động ACN-H3PO4 0,01%; thể tích mẫu tiêm là 10 µl. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn (kháng vi sinh vật kiểm định) được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp đục lỗ thạch, sau đó định lượng lại trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher et al. (1991) [8]. Các chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng gồm: Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), Bacillus subtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC 12222), Aspergillus niger (439), Fusarium oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC 7754) và Saccharomyces cerevisiae (SH 20). Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela et al. (2003) [7]. Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm. Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị SC50. Giá trị SC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Graph Pad Prism 5 và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (mean ± SD). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hiệu quả tách chiết Khi sử dụng các dung môi khác nhau gồm nước và etanol 70% để tách chiết đã cho kết quả khác biệt rõ rệt, lần lượt ở mức 13,7% và 19,21% (bảng 1); tổng flavonoid trong dịch chiết diếp cá bằng nước là 0,83%, trong dịch chiết bằng etanol là 2,19%. Kết quả chứng tỏ thành phần flavonoid có trong cây Diếp cá được trích ly tốt hơn khi sử dụng dung môi là etanol so với nước. Tác giả Phan Văn Cư (2010) [4] cũng đã sử dụng etanol làm dung môi tách chiết flavonoid trong nghiên cứu về cây diếp cá ở tỉnh Thừa Thiên Huế, hàm lượng flavonoid được đưa ra trong nghiên cứu này là 2,73%; trong nghiên cứu của Zhang et al. (2008) [9], tác giả đã thu được hàm lượng flavonoid tổng là 3,152% khi sử dụng phương pháp chiết động ở áp suất cao với dung môi là etanol. Bảng 1. Hiệu quả tách chiết và tổng flavonoid trong dịch chiết diếp cá Dịch chiết diếp cá Hiệu quả tách chiết (Y, %) Tổng flavonoid (F, %) Dịch chiết bằng nước 13,7 0,83 ± 0,07 Dịch chiết bằng etanol 19,21 2,19 ± 0,04 Định lượng rutin và quercetin Rutin và quercetin là 2 thành phần phổ biến thuộc nhóm flavonoid tồn tại trong cây Diếp cá và đã được chứng minh sự tồn tại trong nhiều nghiên cứu khác nhau [6, 9]. Hàm lượng rutin và quercetin có trong dịch chiết giàu flavonoid thu được trong nghiên cứu này của chúng tôi được định lượng theo phương pháp HPLC với kết quả thu được lần lượt là 0,14% rutin và 0,01% quercein (hình 1). Hình 1. Sắc ký đồ HPLC của mẫu bột diếp cá 1. Mẫu bột diếp cá; 2. Mẫu rutin đối chiếu; 3. Mẫu quercetin đối chiếu. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn Nhiều nghiên cứu đã khẳng định, dịch chiết Diếp cá và các thành phần trong đó, đặc biệt là flavonoid có tác dụng ức chế và tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau như: S. aureus, E. coli, Asp. niger, F. oxysporum, C. albicans và S. typhimurium [2, 6]. Trong nghiên cứu này, hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid từ mẫu thu hái đã được xác định. Kết quả cho thấy, trong 8 chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng, dịch chiết có khả năng kháng 4 chủng với kết quả định tính và định lượng được trình bày trong bảng 2 và hình 2. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu được đưa ra trong nghiên cứu của Choi et al. (2010) [2] trên đối tượng là chủng S. aureus là 50 µg/ml, còn trong nghiên cứu của Trần Thanh Lương và nnk. (2007) [6], giá trị trên được đưa ra với chủng E. coli là 200 µg/ml. Bảng 2. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid Chủng vi sinh vật kiểm định Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml) Đường kính vòng phân giải (ΔD, mm) E. coli 100 18 P. aeruginosa 200 14 B. subtillis 200 17 S. aureus 50 20 Hình 2. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa Ngoài hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa cũng là 1 đặc trưng của Diếp cá và dịch chiết của nó. Khả năng bắt gốc tự do của flavonoid có trong diếp cá đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của các thành phần có trong cây diếp cá [3]. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid. Kết quả cho thấy, khả năng bao vây gốc tự do của dịch chiết diếp cá khá cao, giá trị SC50 đạt 19,56 mg/ml khi so sánh với đối chứng (vitamin C) là 25,37 mg/ml (bảng 3). Giá trị SC50 được đưa ra trong nghiên cứu của Chou et al. (2009) [3] ở các nồng độ mẫu khác nhau nằm trong khoảng từ 31-63 mM với đối chứng là vitamin E. Bảng 3. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết diếp cá giàu flavonoid STT Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu (mg/ml) SC% SC50 (mg/ml) Kết quả 1 Đối chứng (+) 50 68,7 ± 0,1 25,37 Dương tính 2 Đối chứng (-) - 0,0 ± 0,0 - Âm tính HC 200 61,23 ± 0,5 19,56 Dương tính HC: Dịch chiết Diếp cá; Đối chứng (+): Vitamin C; Đối chứng (-): DPPH. KẾT LUẬN Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng etanol làm dung môi tách chiết cho hiệu quả chiết cao hơn chiết bằng nước, hàm lượng tổng flavonoid trong dịch chiết etanol và dịch chiết nước lần lượt là 2,19% và 0,83%. Hàm lượng rutin và quercetin trong dịch chiết etanol được định lượng theo phương pháp HPLC cho kết quả lần lượt là 0,14% và 0,01%. Dịch chiết giàu flavonoid thu được có khả năng kháng 4 chủng vi sinh vật kiểm định gồm: E. coli, P. aerugninosa, B. subtillis và S. aureus. Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết biểu thị qua giá trị SC50 đạt 19,56 mg/ml. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chang C. C., Yang M. H., Chern J. C., 2002. Estimation of total flavonoid contentin Propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis, 10(3): 178-182. Choi J. Y., Lee J. A., Yun S. J., Lee S. C., 2010. Anti-Inflammatory Activity of Houttuynia cordata against Lipoteichoic Acid-Induced Inflammation in Human Dermal Fibroblasts. Chonnam Medical Journal, 46: 140-147. Chou S. C., Su S. R., Ku Y. C., Wu T. S., 2009. The constituents and their bioactivities of Houttuynia cordata. Chem. Pharm. Bull., 57(11): 1227-1230. Phan Văn Cư, 2010. Phân lập flavonoid từ cao butanol trong cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) ở tỉnh Thừa Thiên - Huế. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 63: 27-32. Trần Thị Việt Hoa, Lê Thị Kim Oanh, 2008. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb) của Việt Nam. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 11(7): 73-77. Trần Thanh Lương, Lê Thị Út, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2007. Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây diếp cá thu hái tại thành phố Hồ Chí Minh. Hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, 430-434. Shela G., Olga M. B., Elena K., Antonin L., Nuria G.M, Ratiporn H., Yong-Seo P., Soon-Teck J., Simon T., 2003. Comparison of the contents of the main biochemical compounds and antioxidant activity of some Spanish olive oils as determined by four different radical scavenging tests. The Journal of Nutritional Biochemistry, 14(3): 154-159. Vanden Berghe D. A., Vlietinck A. J., 1991. Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants. Academic Press, London. In: Dey, P. Mp. Harbone, J. B. (Eds): 47-69. Zhang Y., Li S.F., .Wu X.W., 2008. Pressurized liquid extraction of flavonoid from Houttuynia cordata Thunb. Separation and Purification Technology, 58: 305-310. A STUDY ON EXTRACTION AND DETERMINATION SOME BIOACTIVITIES OF FLAVONOID EXTRACT FROM HOUTTUYNIA CORDATA THUNBERG CULTIVATING IN HANOI CITY Hoang Van Tuan1, Pham Huong Son1, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Dinh Luyen2, Nguyen Thanh Hao3 1National Center for Technological Progress 2Institute of Natural Products Chemistry, VAST 3Hanoi University of Agriculture SUMMARY Houttuynia cordata Thunb. is a medicinal plant in Vietnam, has many biological activities including anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-microbial and immunological effects. The active components in H. cordata are flavonoids. In this study, the H. cordata extract was obtained by water and alcohol. Then, total flavonoids, anti-microbial and anti-oxidant effects of H. cordata extract were determined. The results shown that, H. cordata ethanolic extract had total flavonoids content more than H. cordata water extract, 2.19% and 0.83%, respectively. Rutin and quercetin content in ethanolic extract was 0.14% and 0.01% (g/g dried H. cordata extract). Moreover, H. cordata ethanolic extract could inhibit four bacterial strains including E. coli, P. aerugninosa, B. subtillis and S. aureus. Anti-oxidant effects of H. cordata ethanolic extract reached 61.23%, SC50 was 19.56 mg/ml. Keywords: Houttuynia cordata, antimicrobial, antioxidant, flavonoid, quercetin. Ngày nhận bài: 21-2-2013