Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) trồng trên vùng đất gò đồi và bãi bồi ven sông - Cao Đăng Nguyên

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 83 NGHIÊN CỨU SỰ TÍCH LŨY PROTEIN VÀ LECTIN TRONG ĐẬU NGỰ (Phaseolus lunatus L.) TRỒNG TRÊN VÙNG ĐẤT GÒ ĐỒI VÀ BÃI BỒI VEN SÔNG Cao Đăng Nguyên1*, Nguyễn Đức Phước 2, Phan Tiến Dũng3 1Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế 2 Trung tâm Ươm tạo và chuyển giao công nghệ – Đại học Huế 3 Trung tâm Công nghệ sinh học Đà Nẵng * Email: caodangn@yahoo.com TÓM TẮT Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin của đậu Ngự trồng trên vùng đất gò đồi và bãi bồi ven sông ở Thừa Thiên Huế thấy rằng: protein đều tích lũy lớn nhất ở hạt trong giai đoạn chín thu hoạch (63,41 mg/g với đậu trên vùng bãi bồi và 60,18 mg/g trên vùng gò đồi). Sự tích lũy lectin cũng đều chỉ xuất hiện ở một số cơ quan trong những giai đoạn nhất định, nhiều nhất trong hạt ở giai đoạn chín thu hoạch và lectin của đậu trồng vùng gò đồi cao gấp đôi ( 42,54 Đv/mg) so với vùng bãi bồi (20,19 Đv/mg). Hình ảnh phổ điện di dịch chiết protein tổng số ở các bộ phận qua các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của đậu ngự trồng trên hai vùng đất cũng cho thấy: phổ điện di protein tương đối giống nhau trong những bộ phận tương ứng. Trong lá và hạt protein đa dạng hơn các cơ quan khác (11 băng) nằm trong khoảng 15-200 kDa, các cơ quan còn lại đều có 8 băng vơi khối lượng phân tử thấp dưới 60 kDa. Từ khóa: đậu Ngự, lectin, protein, điện di. 1. MỞ ĐẦU Như đã biết, trong cơ thể protein đảm nhận nhiều chức năng vô cùng quan trọng như xây dựng cấu trúc tế bào, mô đến các hoạt động xúc tác và nhiều chức năng sinh học khác... Lectin cũng là chất có hoạt tính sinh học có bản chất protein, lectin được tích lũy nhiều trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật và ở con người [1], [5]; và đặc biệt nhiều nhất ở các cây họ đậu (Fabaceae), nhằm đảm nhận nhiều chức năng khác nhau như: enzyme; giúp cho sự tích lũy protein; kích thích phân bào; tuyển chọn vi sinh vật thích hợp tạo nốt sần trong rễ; bảo vệ cơ thể; vận chuyển đường; bao bọc và bảo quản nguyên liệu dự trữ tế bào[6], [7], [8]. Mặt khác, do lectin có khả năng tương tác, nhận biết các loại tế bào khác nhau, kể cả tế bào dị thường và ác tính, tham gia vào phản ứng gắn kết đặc hiệu với những glycoprotein khác, nên hiện nay lectin được coi là công cụ hữu hiệu để nghiên cứu trong y học đặc biệt trong miễn dịch học [1], [9]. Cũng như các loài thực vật khác, sự tích lũy protein cũng như lectin thường bị chi phối Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 84 bởi các điều kiện khí hậu đất đai, tùy thuộc vào từng cơ quan cũng như từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cơ thể. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin và đặc trưng phổ điện di protein trong đậu được trồng trên hai vùng đất khác nhau, thông qua đó để tìm hiểu mối quan hệ giữa chúng. Mặt khác đưa ra những cơ sở khoa học để lựa chọn thời điểm và bộ phận thích hợp để thu nhận lectin của đậu cho việc ứng dụng vào thực tiễn. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng Đối tượng là đậu ngự (Phaseolus lunatus L.). Giống đậu ngự được cung cấp bởi công ty TNHH giống cây trồng Phú Nông – Tp Hồ Chí Minh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu + Bố trí thí nghiệm: Tiến hành gieo đậu ngự theo thời vụ trên hai vùng đất khác nhau là ở vùng gò đồi (núi Ngự Bình, TT Huế) và vùng bãi bồi ven sông (sông An Cựu, TT Huế). + Xử lý mẫu vật: Thu mẫu ở các cơ quan gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt qua các giai đoạn sinh trưởng và phát triển khác nhau theo Beinroth [2]. Mẫu được rửa sạch trộn đều và nghiền nhỏ, chiết rút bằng đệm PBS (Phosphate buffer in salt) 7,2 theo tỷ lệ 1 gam mẫu: 5 ml đệm, ly tâm mẫu 6000 vòng/phút trong 30 phút, loại bã và thu dịch trong để tiến hành các thí nghiệm. + Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford [3]. + Xác định hoạt độ lectin theo phương pháp của Gebauer [4]. + Điện di trên SDS-polyacrylamide theo nguyên tắc của Laemmli [8]. + Xử lý số liệu: các mẫu phân tích đều được lặp lai 3 lần, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích Ducan’s test (p<0,05). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu sự tích lũy protein. Kết quả nghiên cứu sự tích lũy protein của đậu trồng trên hai vùng đất được thể hiện trên bảng 1 và 2. Kết quả cho thấy qua các giai đoạn sinh trưởng và phát triên ở đậu ngự trồng trên hai vùng đất hầu như không khác nhau ở các bộ phận tương ứng. Cụ thể các cơ quan: thân, rễ và đặc biệt trong lá protein được tích lũy nhiều nhất từ giai đoạn n-1 lá kép cho đến giai đoạn ra hoa rộ (khoảng 51 mg/g). Như vậy, rõ ràng để chuẩn bị bước vào giai đoạn hình thành các bộ phận của cơ quan sinh sản thì cây cần tổng hợp nhiều protein góp phần hình thành hạt là nơi tích TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 85 protein dử trử lớn nhất như đã được biểu thị trong bảng 1 và 2. Bảng 1. Sự tích lũy protein (mg/g) của đậu ngự trồng tại vùng bãi bồi Giai đoạn sinh trưởng Cơ quan Rễ Thân Lá Hoa Quả Hạt Mọc 9,98b 8,54c 38,78a Lá đơn 10,13b 10,49b 39,63a 1 Lá kép 17,19 c 18,41 b 44,56 a 2 Lá kép 18,39 b 18,82 b 45,11 a 3 Lá kép 19.35 b 18,82 b 43,37 a n-1 Lá kép 27,83 b 26,39 c 51,78 a Bắt đầu ra hoa 32,03b 30,36c 51,45a 25,75d Hoa rộ 31,03c 29,94d 50,85a 35,85b Bắt đầu làm quả 29,32b 28,84c 48,23a 28,53c Làm quả rộ 29,67c 28,14d 48,23a 38,15b Làm Hạt 30,16c 28,54d 48,5b 55,35a Quả chắc Chín sinh lý 30,86 c 29,73 d 30,49 c 31,14 c 47,15 b 46,21 b 54,12 a 54,64 a Chín thu hoạch 24,13d 25,46c 41,84b 63,41a Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một hàng chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các trung bình mẫu với P<0,05 (Duncan’s test). Chú thích này dùng chung cho tất cả các bảng. Bảng 2. Sự tích lũy protein (mg/g) của đậu ngự trồng tại vùng gò đồi Giai đoạn Cơ quan Rễ Thân Lá Hoa Quả Hạt Mọc 12,41b 10,35c 46,26a Lá đơn 10,42c 12,37b 45,21a 1 Lá kép 19,8 b 19,22 b 43,62 a 2 Lá kép 18,28 c 19,86 b 41,78 a 3 Lá kép 18,65 b 17,98 c 42,11 a n-1 Lá kép 28,66 b 27,18 c 50,21 a Bắt đầu ra hoa 31,65b 30,19c 51,31a 24,07d Hoa rộ Bắt đầu làm quả Làm quả rộ 31,78 c 31,78 b 29,73 c 31,39 c 27,99 c 28,02 d 51,91 a 50,14 a 50,14 a 34,76 b 28,01 c 39,51 b Làm Hạt 29,87c 27,92d 49,24b 56,01a Quả chắc Chín sinh lý 30,57 c 30,05 c 28,19 d 29,47 c 48,07 b 47,03 b 52,79 a 53,89 a Chín thu hoạch 23,35d 26,04c 40,09b 60,18a Tuy không có sự khác nhau nhiều về sự tích lũy protein trong đậu trồng trên hai vùng đất, nhưng kết quả cũng cho thấy rằng; đậu trồng trên đất bãi bồi ven sông protein vẫn được tích lũy trong hạt nhiều hơn trồng trên vùng gò đồi. Điều đó cho thấy vùng đất bãi bồi mầu mở hơn, Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 86 đã tạo điều kiện cho sự tích lũy protein nhiều hơn là điều hoàn toàn phù hợp trên lý luận và thực tiễn 3.2. Nghiên cứu sự tích lũy lectin Kết quảt nghiên cứu sự tích lũy lectin của đậu trồng trên hai vùng đất được thể trên bảng 3 và 4. Bảng 3. Sự tích lũy lectin (Đv/mg) của đậu ngự trồng tại vùng bãi bồi Giai đoạn Cơ quan Rễ Thân Lá Hoa Quả Hạt Mọc - - - Lá đơn - - - 1 Lá kép - - - 2 Lá kép - - - 3 Lá kép - - - n- Lá kép - - - Bắt đầu ra hoa 2,5 - - - Hoa rộ 5,1 1,37 - - Bắt đầu làm quả 10,91 2,77 0,83 1,4 Làm quả rộ 10,78 5,69 1,66 2,1 Làm Hạt 10,61 11,21 3,3 5,71 Quả chắc 10,37 10,5 6,79 11,83 Chín sinh lý 5,38 5,14 6,92 23,43 Chín thu hoạch 1,66 1,57 3,82 20,19 Chú thích: Dấu “-“ không có hoạt tính lectin Bảng 4. Sự tích lũy lectin (Đv/mg) của đậu ngự trồng tại vùng gò đồi Giai đoạn Cơ quan Rễ Thân Lá Hoa Quả Hạt Mọc - - - Lá đơn - - - 1 Lá kép - - - 2 Lá kép - - - 3 Lá kép - - - n- Lá kép - - - Bắt đầu ra hoa 2,53 - - - Hoa rộ 5,03 1,27 - - Bắt đầu làm quả 10,07 2,86 0,78 2,86 Làm quả rộ 10,76 5,71 1,6 4,05 Làm Hạt 10,71 11,46 3,23 5,71 Quả chắc 10,46 11,35 6,66 12,12 Chín sinh lý 5,32 5,43 6,8 23,75 Chín thu hoạch 1,71 1,54 3,99 42,54 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 87 Từ kết quả trên các bảng, chúng tôi nhận thấy ở đậu ngự, lectin chỉ xuất hiện trong các cơ quan thân, rễ và lá theo từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển nhất định. Sự xuất hiện lectin bắt đầu từ rễ ở giai đoạn bắt đầu ra hoa, đây cũng chính là thời điểm mà vi khuẩn cố định đạm xâm nhập và tạo rất nhiều nốt sần ở rễ. Từ đó rõ ràng lectin đã thể hiện vai trò tuyển chọn vi khuẩn cố đinh đạm xâm nhập vào rễ của đậu để hình thành nốt sần. Lectin cũng được xuất hiện với hàm lượng nhiều ít khác nhau ở các giai đoạn muộn hơn trong thân, lá quả và đặc biệt trong hạt lectin được tích lũy nhiều nhất (khoảng 20-40 Đv/mg). Mặt khác, nếu so sánh giữa đậu được trồng trên hai vùng đất, nhậ thấy rằng: ngược lại với sự tích lũy protein, sự tích lũy lectin diễn ra mạnh mẽ hơn trong đậu trồng trên vùng gò đồi. Điều đó cho thấy rằng rất có thể lectin đã tham gia vào quá trình giúp đỡ cây chống chọi với điều kiện khô hạn bất lợi khi sống trên những vùng đất này. 3.3. Nghiên cứu phổ điện di protein Để tìm hiểu sâu hơn về protein trong đậu ngự, chúng tôi tiến hành điện di protein từ dịch chiết của các cơ quan theo từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển của đậu ngự thu được các kết quả trên các hình sau đây: Hình 1. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn mọc Chú thích: M: Khối lượng protein chuẩn 1G: lá vùng gò đồi; 1B: lá vùng bãi bồi; 2G: thân vùng gò đồi; 2B: thân vùng bãi bồi; 3G: rễ vùng gò đồi; 3B: rễ vùng bãi bồi (Chú thích được dùng cho tất cả các hình tiếp theo). Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 88 Hình 2. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn lá đơn Hình 3. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn 1 lá kép Hình 4. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn 2 lá kép TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 89 Hình 5. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn 3 lá kép Hình 6. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn n-1 lá kép Hình 7. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn bắt đầu ra hoa Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 90 Chú thích: M: Khối lượng protein chuẩn 1B: rễ vùng bãi bồi ; 1G: rễ vùng gò đồi; 2B: thân vùng bãi bồi; 2G: thân vùng gò đồi 3B: lá vùng bãi bồi; 3G: lá vùng gò đồi; 4B: hoa vùng bãi bồi 4G: hoa vùng gò đồi Chú thích này được dùng cho tất cả các hình tiếp theo. Hình 8. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn hoa rộ Hình 9. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn bắt đầu làm quả Chú thích: M: Khối lượng protein chuẩn 1B: rễ vùng bãi bồi ; 1G: rễ vùng gò đồi; 2B: thân vùng bãi bồi; 2G: thân vùng gò đồi 3B: lá vùng bãi bồi; 3G: lá vùng gò đồi; 4B: quả vùng bãi bồi 4G: quả vùng gò đồi Chú thích này được dùng cho tất cả các hình tiếp theo. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 91 Hình 10. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn làm quả rộ Hình 11. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn làm hạt Hình 12. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn quả chắc Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 92 Chú thích: M: Khối lượng protein chuẩn 1B: rễ vùng bãi bồi; 1G: rễ vùng gò đồi; 2B: thân vùng bãi bồi; 2G: thân vùng gò đồi 3B: lá vùng bãi bồi; 3G: lá vùng gò đồi; 4B: hạt vùng bãi bồi; 4G: hạt vùng gò đồi Chú thích này được dùng cho tất cả các hình tiếp theo. Hình 13. Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn chín sinh lý Hình 14.Phổ điện di protein mẫu đậu ngự ở giai đoạn chín thu hoạch Kết quả điện di đã cho thấy, protein được tích lũy trong rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt của đậu ngự trồng trên hai vùng sinh thái qua các giai đoạn đều có những nét tương đồng và rất đa dạng, các băng protein đều có khối lượng phân tử nằm trong khoảng 15-225 kDa. Có 8 băng đậm tương ứng với 15 kDa; 20 kDa; 27kDa; 35 kDa; 45 kDa; 60 kDa; 150 kDa và 200 kDa. Tuy nhiên, nếu so sánh giữa các cơ quan sự tích lũy protein có sự sai khác nhau khá rõ rệt. Cụ thể là protein trong lá và hạt đa dạng hơn các cơ quan khác (11 băng), đặc biệt có 2 băng đậm tương ứng với 35 kDa và 45 kDa, có thể đây là các loại potein đặc trưng của đậu ngự. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Tập 4, Số 1 (2016) 93 Protein trong thân và rễ chỉ có khoảng 8 băng với khối lương phân tử thấp chỉ khoảng dưới 60 kDa. Như vậy sự đa dạng protein trong lá và hạt có ý nghĩa thực tiễn và lý luận, hoàn toàn phù hợp với chức quang hợp và dử trử của cây. Mặt khác, sự xuất hiện lectin nhiều trong một số giai đoạn sinh trưởng và phát triển nhưng không thấy xuất hiện 4. KẾT LUẬN 1. Protein của đậu Ngự trồng trên 2 vùng đất gò đồi và bãi bồi ven sông đều được tích lũy lớn nhất ở hạt trong giai đoạn chín thu hoạch. Trong đó đậu trồng ở bãi bồi bên sông protein được tích lũy nhiều hơn (63,41 mg/g) ở vùng gò đồi (60,18 mg/g). 2. Lectin trong đậu cũng đều chỉ xuất hiện ở một số cơ quan trong những giai đoạn nhất định và nhiều nhất trên hạt ở giai đoạn chín thu hoạch và ngược với sự tích lũy protein, lectin trong đâu trên vùng gò đồi được tích lũy nhiều hơn (42,54 Đv/mg) vùng bãi bồi ven sông (20,19 Đv/mg). 3. Hình ảnh phổ điện di dịch chiết protein tổng số ở các bộ phận qua các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của đậu ngự trồng trên hai vùng đất tương đối giống nhau ở các bộ phận tương ứng. Trong đó lá và hạt protein đa dạng hơn cả có 11 băng với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 15-225 kDa. Các bộ phận còn lại chỉ có 8 băng với khối lượng phân tử thấp dưới 60 kDa. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Quốc Khang, Trần Quốc Hùng, Bùi Hải Yến (1991). Ảnh hưởng của dung môi tách chiết protein đến khả năng khai thác lectin và tác dụng diệt côn trùng của cây ruốc cá, Tạp chí thông tin bảo vệ thực vật, 1, tr. 22-27 [2]. Lưu Thị Xuyên (2011). Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của một số giống đậu tương nhập nội và biện pháp kĩ thuật cho giống có triển vọng tại Thái Nguyên, Luận án tiến sĩ nông nghiệp tại Đại học Thái Nguyên. [3]. Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding, Anal Biochem, 72, pp. 248-254. [4]. Fleish, M. and Maider, L. (1985). A one step procedure proisolation and resolution of the Phaseolus vulgaris isolectin by affinity chromatography, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 266, pp. 1029-1032. [5]. Gianni Vandenborre , Guy Smagghe , Els J.M. Van Damme (2011). Plant lectins as defense proteins against phytophagous insects, Phytochemistry,72, pp. 1538–1550. [6]. Halina L. and Nathan S. (2004). History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition Nghiên cứu sự tích lũy protein và lectin trong đậu ngự (Phaseolus lunatus L.) 94 molecules, Glycobiology, 14 (11), pp. 53-62. [7]. Hao C. Z, Sun H. Tong X. and Yipeng QI. (2003). An antitumor lectin from the edible mushrooom (Agrocybe aegerita), Biochem. Journal, (374), pp. 323-327. [8]. Leammli, U.K. (1970). Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4, Nature biotenology, 227, pp. 680-685. INVESTIGATION OF PROTEIN AND LECTIN ACCUMULATION IN PHASEOLUS LUNATUS L. GROWN IN THE HILLSIDE AND RIVERINE ALLUVIAL IN THUA THIEN HUE Cao Dang Nguyen 1* , Nguyen Duc Phuoc 2 , Phan Tien Dng 3 1 Department of Biology, Hue University College of Sciences 2 Center for Innovation Incubation and Technology Transfer, Hue University 3 Da Nang Biotechnology Center * Email: caodangn@yahoo.com ABSTRACT In this work, we investigated the content of total soluble protein (TSP) and lectin in Phaseolus lunatus L. grown in the hillside and riverine alluvial in Thua Thien Hue. The highest TSP content is found in grains in both cultivated regions (63.41 mg/g in hillside and 60.18 mg/g in riverine alluvial). Lectin is synthesized in certain stages of growth and development, and it is also accumulated mostly in grains (42.54 unit/mg in hillside and 20.19 unit/mg in riverine alluvial). The profile of SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) of TSP from different parts of Phaseolus lunatus L. in different growth stages in both cultivated regions is also studied. The results showed that the protein bands from various samples distributed in the same pattern. However, proteins from leaves and grains have 11 bands (molecular weight from 15 to 200 kDa) are more than that of other organs have only 8 bands (molecular weight below 60 kDa). Keywords: Phaseolus lunatus L., lectin, SDS-PAGE.