Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản (angelica acutiloba) nuôi cấy in Vitro - Hoàng Ngọc Nhung

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 196 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ BÀO CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba) NUÔI CẤY IN VITRO Hoàng Ngọc Nhung1, Nguyễn Thị Quỳnh1*, Nguyễn Vũ Ngọc Anh1, Nguyễn Lê Anh Thư1, Toyoki Kozai2 (1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com (2)Trường đại học Chiba, Nhật Bản TÓM TẮT: Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5. Từ khóa: Angelica acutiloba, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, phát sinh cơ quan, rễ bất định. MỞ ĐẦU Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), là loài thân thảo lớn, có chiều cao trung bình 40-80 cm, được du nhập vào Việt Nam từ năm 1996 và trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội. Rễ của cây đương quy 3 năm tuổi được đào vào mùa thu, rồi sấy than, cắt thành lát mỏng dùng làm thuốc. Những lá non có thể ăn sống hoặc làm trà tươi uống. Trong y học cổ truyền của Trung Quốc, đương quy là thuốc đầu vị, dùng rất phổ biến trong thuốc chữa bệnh phụ nữ, thiếu máu, suy nhược cơ thể, đồng thời được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ dựa vào các hợp chất chính như ligustilide, butylidenephthalide và acid ferulic. Các polysaccharide có mặt trong rễ của cây đương quy Nhật Bản còn có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể [6]. Trong dân gian, cây đương quy thường được trồng bằng hạt, tuy nhiên, hạt chỉ có thể thu được vào một thời gian nhất định trong năm, thường vào năm thứ 3 sau khi trồng, và sức nảy mầm giảm nhanh chóng sau một thời gian ngắn. Do nhu cầu về giống cây ngày càng tăng, đồng thời đòi hỏi việc nuôi trồng phải đáp ứng các tiêu chuẩn nghiêm ngặt, bảo đảm được tính sạch và sự ổn định về chất lượng của hợp chất thứ cấp có trong cây, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất để tạo một lượng lớn cây đương quy đồng nhất, sạch bệnh trong một thời gian nhất định và không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Trong bài này, chúng tôi trình bày kết quả tạo chồi và rễ bất định từ nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn và phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần hóa học và một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) bổ sung trong môi trường nuôi cấy, nhằm hướng đến việc xây dựng hệ thống nhân chồi và rễ in vitro hữu hiệu để phục vụ cho nhu cầu dược liệu trong nước. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chồi in vitro và phiến lá cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) lấy từ cây mầm phát triển từ hạt được nuôi cấy trên môi trường MS [9]. Ngoc Nhung Hoang et al. 197 Môi trường nuôi cấy in vitro Môi trường khoáng MS hoặc khoáng Gamborg B5 [3], có bổ sung vitamin Morel hoặc Gamborg B5, 30 g/l đường sucrose (công ty Đường Biên Hòa), 7,3 g/l agar (công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm 6 tuần (42 ngày). Phương pháp Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy Nhật Bản Chồi (đã loại bỏ hết lá) được cắt ngang thành 3 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và được đặt vào môi trường MS, vitamin Morel, bổ sung 30 g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, chất ĐHSTTV là NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) và TDZ (0,1; 0,5; 1 mg/l). Thí nghiệm gồm 9 công thức, mỗi công thức 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 chồi cắt thành 3 lớp và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được đặt trong tủ vi khí hậu (công ty Sanyo, Japan) dưới cường độ ánh sáng 50 µmol m-2 s-1 (30 µmol m-2 s-1 trong 3 tuần đầu), thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là số chồi/mẫu hình thành theo thời gian nuôi cấy (chồi ≥ 1 mm). Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi Chồi sau khi loại bỏ lá được cắt ngang thành 2 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và đặt vào môi trường thí nghiệm với thành phần khoáng đa lượng MS, vi lượng MS, bổ sung 30 g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Thí nghiệm được bố trí với 6 công thức nhằm khảo sát ảnh hưởng của vitamin Morel hoặc vitamin Gamborg B5 trong môi trường nuôi cấy lớp mỏng, không hoặc có bổ sung nước dừa (10%, v/v), không hoặc có bổ sung adenine sulphate (40 mg/l). Mỗi công thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 chồi được cắt thành 2 lớp và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy và chỉ tiêu theo dõi kế thừa từ thí nghiệm trên. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro Mẫu cấy là phiến lá mở thứ nhất từ chồi in vitro của cây đương quy Nhật Bản, mỗi mẫu được rạch 9 đường ngẫu nhiên để tạo vết thương. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS, vitamin Morel, có bổ sung NAA hoặc IBA ở các nồng độ 4, 6, 8, 10, và 12 mg/l và kinetin ở các nồng độ 0 và 1 mg/l. Mỗi công thức có 2 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 2 mẫu và chứa 20 ml môi trường. Mẫu nuôi cấy được đặt hoàn toàn trong tối, nhiệt độ phòng nuôi là 25oC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ được xác định sau 42 ngày nuôi cấy. Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng và vitamin lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro Phiến lá được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS hoặc Gamborg B5, và vitamin Morel hoặc Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l NAA. Mỗi công thức có 7 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 mẫu và chứa 20 ml môi trường. Điều kiện nuôi cấy như thí nghiệm trên. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi, trọng lương khô của rễ được xác định ở ngày thứ 42. Các số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC phiên bản 2.10 của Đại học bang Michigan, Mỹ. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy Nhật Bản Số lượng chồi hình thành tăng dần ở các công thức theo thời gian nuôi cấy (bảng 1). Ảnh hưởng của NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hay cao (0,2 mg/l) lên sự tạo chồi mới của mẫu ban đầu chưa rõ rệt so với mẫu nuôi cấy trên môi trường không có NAA, cho dù nồng độ của TDZ cao (1 mg/l) hay thấp (0,1 mg/l). Tuy nhiên, việc bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ (công thức L6) vào môi trường đã kích thích mẫu cấy lớp mỏng chồi và làm gia tăng số chồi hình thành/mẫu cấy so với các công thức khác ngay sau 2 tuần nuôi cấy (bảng 1). TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 198 Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự hình thành chồi của cây đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy Công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/mẫu cấy) Ký hiệu NAA (mg/l) TDZ (mg/l) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6 L1 0 0,1 1,4 bcx 1,7 e 2,2 f L2 0 0,5 1,4 bc 2,7 d 3,9 cd L3 0 1 0,9 c 1,4 e 2,0 f L4 0,1 0,1 1,4 bc 3,3 bc 4,3 c L5 0,1 0,5 1,6 d 2,1 de 4,3 c L6 0,1 1 4,1 a 6,3 a 8,9 a L7 0,2 0,1 1,1 bc 1,7 e 3,2 e L8 0,2 0,5 0,9 c 2,7 cd 3,7 de L9 0,2 1 1,4 bc 3,4 b 7,8 b ANOVAy Nồng độ NAA (A) ** ** ** Nồng độ TDZ (B) ** ** ** A × B ** ** ** CV (%) 14,28 10,28 5,86 y **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test. Sau 6 tuần, số chồi hình thành ở các công thức tiếp tục gia tăng và sự khác biệt trở nên rất có ý nghĩa (bảng 1). Số lượng chồi cao nhất ở công thức L6 (8,9 chồi/mẫu) và thấp nhất ở công thức L3 (1 mg/l TDZ và không có NAA) (hình 1). Ngoài ra, chồi xuất hiện tập trung trên lớp mỏng 1 và 2 tính từ ngọn và hầu như không thấy xuất hiện trên lớp mỏng thứ 3. Hình 1. Cụm chồi cây đương quy Nhật bản sau 6 tuần nuôi cấy (ký hiệu tên nghiệm thức theo bảng 1) Ngoc Nhung Hoang et al. 199 TDZ được biết đến như một cytokinin loại phenylurea và được sử dụng thay thế cho BA trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trong thời gian gần đây. Sự có mặt của TDZ trong môi trường, ở nồng độ thấp hoặc vừa phải, đã thúc đẩy sự sinh tổng hợp cytokinin nội sinh ở mô thực vật nuôi cấy [7]. Bên cạnh đó, tỷ lệ giữa auxin và cytokinin đóng vai trò hết sức quan trọng đối với sự phát sinh hình thái cơ quan trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy, sự vắng mặt của NAA trong môi trường nuôi cấy có thể đã gây nên sự mất cân bằng về tỷ lệ giữa auxin và cytokinin, hoặc dẫn đến sự dư thừa cytokinin và tạo phản ứng ngược lên sự sinh tổng hợp cytokinin của tế bào. Tỷ lệ 1:10 giữa 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ có lẽ đã đạt được thế cân bằng phù hợp cho sự hình thành chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi cây đương quy. Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng của cây đương quy diễn ra chậm. Số chồi hình thành ở các công thức không có sự khác biệt về mặt thống kê sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, ở tuần nuôi cấy thứ 4, sự thay đổi loại vitamin cũng như sự bổ sung thêm nước dừa và adenine đã gây các phản ứng khác nhau đối với mô nuôi cấy (bảng 2). Bảng 2. Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và adenine lên sự hình thành chồi của cây đương quy theo thời gian nuôi cấy Tên công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/ mẫu cấy) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6 M (Vitamin Morel) 0,25 2,71 ex 9,83 d MC (Vitamin Morel + 10% nước dừa) 0,08 3,67 c 10,67 c MCA (Vitamin Morel + 10% nước dừa + 40 mg/l adenine) 0,42 1,92 f 7,17 f B (Vitamin Gamborg B5) 0,13 3,42 d 7,96 e BC (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa) 1,08 6,08 b 14,29 b BCA (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa + 40 mg/l adenine) 1,21 9,88 a 16,33 a ANOVAy Vitamin (A) * ** ** Nước dừa và adenine (B) * ** ** A x B NS ** ** CV(%) 89,5 2,12 0,65 y NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 hoặc 0,0; x Các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test. Khi thay vitamin Morel bằng vitamin Gamborg B5, số chồi/mẫu gia tăng rõ rệt sau 4 tuần nuôi cấy ở cả 3 công thức B, BC và BCA. Số chồi/mẫu trên môi trường BC hơn gần hai lần so với số chồi/mẫu trên môi trường MC (bảng 2). Ở tất cả các công thức, sồ chồi đều gia tăng sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi/mẫu lớn nhất thu nhận được ở công thức BCA (16,33 chồi/mẫu) và nhỏ nhất ở nghiệm thức MCA (7,17 chồi/mẫu). Sự hiện diện của nước dừa làm gia tăng đáng kể số chồi/mẫu, tuy nhiên, sự bổ sung thêm adenine chỉ có ảnh hưởng rõ rệt khi vitamin của môi trường Gamborg B5 được sử dụng (bảng 2). Vai trò kích thích tăng trưởng của nước dừa đã được đề cập đến trong nhiều công trình vi nhân giống lan. Nước dừa có chứa nhiều loại cytokinin như kinetin, trans-zeatin và một số chất kích thích tố sinh trưởng thực vật khác chưa được định danh thuộc nhóm gibberellin và auxin [13]. Ngoài ra, nước dừa còn có các vi lượng như sắt và vitamin, các acic amin, đường... có thể được đưa vào hệ thống antioxidant của cơ thể người. Trong nuôi cấy TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 200 tạo chồi cây oliu, nước dừa đã thành công trong việc thay thế zeatin trong môi trường nuôi cấy và trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình nhân giống [11]. Ảnh hưởng của adenine lên sự tăng sinh chồi được mô tả trong thí nghiệm này khi môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin Gamborg B5. Nandagopal & Kumari (2006) [10] cũng đã chứng minh trên cây Cichorium intybus về sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi đạt hiệu quả cao nhất khi bổ sung 1,36 µM adenine vào môi trường MS có vitamin Gamborg B5. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ ở các công thức vào ngày thứ 42 có sự khác biệt rất ý nghĩa khi kết hợp cả 2 yếu tố. Khi khảo sát ảnh hưởng của NAA có hoặc không có kết hợp với kinetin, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao khi mẫu được nuôi cấy trên môi trường chỉ có NAA ở các nồng độ 6, 8, 10 hoặc 12 mg/l (bảng 3A). Khi khảo sát ảnh hưởng của IBA có hoặc không có kết hợp với kinetin, trên môi trường chỉ có 6 hay 8 mg/l IBA, hoặc trên môi trường IBA kết hợp với 1 mg/l kinetin, ở nồng độ 10 hay 12 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao hơn các nghiệm thức còn lại (bảng 3B). Bảng 3. (A) Ảnh hưởng của NAA, kinetin hoặc (B) IBA, kinetin lên % mẫu tạo mô sẹo, % mẫu tạo rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ngày thứ 42 A B Tên công thứcz % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ Tên công thứcz % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ N4K1 88,89 33,33 cx I4K1 77,78 ab 55,56 abcx N4K0 77,78 33,33 c I4K0 22,21 d 55,56 abc N6K1 66,67 77,78 ab I6K1 66,67 abc 66,67 abc N6K0 55,56 66,67 ab I6K0 66,67 abc 88,89 a N8K1 55,56 55,56 bc I8K1 66,67 abc 33,33 c N8K0 33,33 88,89 a I8K0 33,33 cd 66,67 abc N10K1 100 0 d I10K1 100 a 77,77 ab N10K0 77,77 77,77 ab I10K0 33,33 cd 33,33 c N12K1 83,33 0 d I12K1 53,33 bcd 55,56 abc N12K0 72,22 72,22 ab I12K0 44,44 bcd 44,44 bc ANOVAy ANOVAy NAA (A) ** ** IBA (A) * * KINETIN (B) ** ** KINETIN (B) ** NS A x B NS ** A x B ** ** CV (%) 19,61 24,82 CV (%) 28,5 24,14 z N tượng trưng NAA, I tượng trưng IBA; K tượng trưng cho kinetin; các số đi kèm với N hoặc K hoặc I là nồng độ của NAA hoặc IBA hoặc kinetin được sử dụng trong nghiệm thức; y NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,05 và 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test. Các loại tế bào khác nhau đáp ứng với chất ĐHSTTV khác nhau. Các tế bào vùng nhu mô là những tế bào có chức năng hoàn chỉnh. Do đó, khi bị thương và dưới tác động của tổ hợp chất ĐHSTTV, các tế bào vùng nhu mô sẽ đáp ứng lại bằng cách phản biệt hóa tạo khối mô sẹo. Tuy nhiên, mô sẹo hình thành là những khối có dạng tròn, xốp, màu nâu nhạt, khả năng tái biệt hóa rất thấp. Khác với tế bào vùng nhu mô, các tế bào vùng tượng tầng libe-mộc là Ngoc Nhung Hoang et al. 201 những tế bào mô phân sinh cấp hai. Vì vậy, dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, các tế bào này không trải qua quá trình phản biệt hóa mà được hoạt hóa trực tiếp để hình thành vùng tế bào mô phân sinh, tạo sơ khởi rễ (hình 2a). Hình 2. Sự hình thành rễ bất định từ phiến lá cây đương quy Nhật bản a. Sơ khởi rễ hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc (thanh ngang = 10 µm); b. Rễ bất định hình thành trên môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (thanh ngang = 5 mm). Auxin làm giảm tích lũy của cytokinin và ngược lại cytokinin ức chế một số hoạt tính của auxin [4]. Chẳng hạn như, ở nồng độ 10 mg/l NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ là 77,77% (nghiệm thức N10K0). Tuy nhiên, khi bổ sung 1 mg/l kinetin, mẫu không đáp ứng tạo rễ (nghiệm thức N10K1), nhưng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo lại tăng (bảng 3a). Yang & Chuang (1995) [12] khi khảo sát sự tạo rễ từ nuôi cấy tạo mô sẹo của cây đương quy Trung Quốc - Angelica sinensis cũng đã chứng minh, đối với vật liệu là cuống lá ex vitro, mô sẹo được hình thành trên môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, trong khi môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA và 4 mg/l kinetin lại thích hợp cho sự hình thành rễ. Bên cạnh đó, loại auxin khác nhau cũng tác động lên mẫu cấy khác nhau. Mẫu nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IBA ở nồng độ 6 mg/l hoặc IBA nồng độ 10 mg/l , 1 mg/l kinetin cho kết quả tạo rễ khá cao, nhưng rễ tạo ra lại mảnh, ngắn so với rễ tạo từ phiến lá trên môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (hình 2b). Phản ứng khác nhau của mẫu cấy phiến lá đối với hai loại auxin này có thể do sự nhận biết tín hiệu dẫn đến sự đáp ứng của mẫu cấy đối với hai loại auxin này là khác nhau. Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng và vitamin lên sự tạo mô sẹo và rễ từ phiến lá nuôi cấy in vitro của cây đương quy Nhật Bản Ở ngày thứ 42, tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ trong các công thức nuôi cấy có sự khác biệt rất ý nghĩa khi xét cả hai yếu tố là loại môi trường và vitamin (hình 3). Hình 3. Mô sẹo, rễ hình thành từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản dưới ảnh hưởng của môi trường khoáng MS, Gamborg B5 và vitamin Morel, vitamin Gamborg B5 ngày thứ 42 (thanh ngang = 5 mm) M hay B bên trái tượng trưng cho môi trường khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B bên phải tượng trưng cho vitamin Morel hay Gamborg B5. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 202 Mẫu nuôi cấy trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5 (công thức BB) có tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo và rễ đạt cao nhất (100%) (bảng 4). Nghiệm thức BB có số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, trong khi nghiệm thức MB có số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi và khối lượng khô của rễ thấp nhất (bảng 4). Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường khoáng MS được sử dụng phổ biến cho hầu hết các loại cây do giàu và cân bằng về mặt hàm lượng khoáng. Tuy nhiên, môi trường Gamborg B5 cũng được sử dụng trong nuôi cấy tạo mô sẹo và rễ ở một số loại cây như sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [7]. Quá trình phiến lá tạo rễ bất định có thể chia làm hai giai đoạn: giai đoạn đầu là các tế bào tượng tầng libe-mộc được cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giai đoạn sau là sự phát triển thành cơ quan rễ hoàn chỉnh. Dưới tác động của nồng độ 10 mg/l NAA, sơ khởi rễ được hình thành. Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng và loại vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi (KLT), khối lượng khô (KLK) của rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản ngày thứ 42 Tên công thứcz % mẫu tạo mô sẹo % mẫu tạo rễ Số rễ hình thành/mẫu KLT (mg/mẫu) KLK (mg/mẫu) MM 57,1 cx 57,1 c 8 c 19,7 c 2,8 c MB 33,4 d 33,4 d 2 d 5,7 c 0,9 d BM 71,4 b 71,4 b 17 b 44,3 b 4,7 b BB 100,0 a 100,0 a 31 a 86,5 a 9,9 a ANOVAy KHOÁNG (A) ** ** ** ** ** VITAMIN (B) NS NS ** ** ** A x B ** ** ** ** ** CV (%) 6,3 6,3 3,5 14,8 13,9 z M hay B (bên trái): môi trường khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B (bên phải): vitamin Morel hay Gamborg B5; y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng LSD Test. Tùy vào từng giai đoạn phát triển, nhu cầu dinh dưỡng ở các loại tế bào cũng khác nhau. Theo George & Davies (2003) [5], sự phát triển của tế bào rễ sẽ bị kìm hãm nếu môi trường chứa nhiều amonium (NH4+), nhưng ngược lại rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-). Điều này liên quan mật thiết đến sự đồng hóa đạm của rễ. Giai đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm là sự khử nitrate, thường xảy ra ở rễ, trong tối. Tiếp theo là sự tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp protein của tế bào. Đặc biệt, sự đồng hóa đạm có những đặc điểm sau: mô non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+. Do đó nếu dùng NH4+ quá nhiều sẽ gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ [1]. Ở môi trường khoáng MS, có tỷ lệ KNO3/NH4NO3 = 1,15; trong khi ở môi trường Gamborg B5 tỷ lệ KNO3/(NH4)2SO4 = 18,65. Như vậy, nồng độ NH4+ trong thành phần khoáng MS cao gấp 10 lần trong thành phần khoáng Gamborg B5, có thể gây cản trở sự đồng hóa đạm của rễ và sự hấp thu các ion K+, Ca2+ hay Mg2+. Trong khi NO3- giúp cho sự thấm cation, K+ có vai trò trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu của tế bào), sự đóng mở của khí khổng, hoạt hóa enzyme và tổng hợp protein. Như vậy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy, nồng độ khoáng đa lượng của môi trường Gamborg B5 thích hợp hơn cho việc tạo rễ từ nuôi cấy phiến lá cây đương quy Nhật Bản. Vitamin tác động rõ rệt lên số rễ/mẫu và khối lượng tươi, khối lượng khô của rễ (bảng 4). Vitamin là hợp chất cần thiết cho nhiều phản ứng sinh hóa, trong đó thiamine (B1), nicotinic acid (B3), myo-inositol, pyridoxine (B6) là những vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô thực vật. Trong thành phần vitamin Gamborg Ngoc Nhung Hoang et al. 203 B5 nồng độ thiamine cao gấp 10 lần so với nồng độ thiamine trong vitamin Morel. Thiamine được xem là chất cần thiết cho quá trình cảm ứng tạo rễ bất định ở cây Taxus sp. [2]. Cơ chế này chưa được biết rõ trên cây đương quy Nhật Bản, nhưng số lượng rễ hình thành trên mẫu nuôi ở môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5 cao hơn so với các công thức khác có thể là do tác động của thiamine. KẾT LUẬN Sự tạo chồi trực tiếp của cây đương quy Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn trên môi trường khoáng MS, vitamin Gamborg B5, bổ sung 0,1 mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine. Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến lá cũng như số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng khô của rễ cao nhất khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l NAA. Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác nghiên cứu giữa Trường đại học Chiba, Nhật Bản và phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Avilla A., Pereira M. and Arguello A., 1998. Nitrogen concentration and proportion of NH4+-N affect potato cultivar response in solid and liquid media. Hort. Sci., 33: 336-338. 2. Chee P., 1995. Stimulation of adventitious rooting of Taxus species by thiamine. Plant Cell Rep., 14: 753-757. 3. Gamborg L., Miller A. and Ojima K., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158. 4. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M. and Thrope A., 1996. Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: 272-289. 5. George E. F., Davies W., 2003. Effects of the Physical Environment. Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition 1: The Background. George EF, Hall MA, Klerk GJ De (eds.) Springer, Dordrecht, Netherlands: 245-246. 6. Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y., 1982. Immunostimultaing polysacchride separated from hot water extract of Angelica acutiloba Kitagawa (Yamato tohki). Pub. Med. Immunology, 47(1): 75-83. 7. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành và Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ, 27: 30-36. 8. Mok C., Mok S., Turner E., Mujer V., 1987. Biological and biochemical effects of cytokinin-active phenylurea derivatives in tissue culture systems. Hort. Sci., 22: 1194- 1197. 9. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15(3): 473-497. 10. Nandagopal S. and Kumari D., 2006. Adenine sulphate induced high frequency shoot organogenesis in callus and in vitro flowering of Cichorium intybus L. cv. Focus - a potent medicinal plant. Acta agriculturae Slovenica, 87(2): 415-425. 11. Peixe A., Raposo A., Lourenço R., Cardoso H. and Macedo E., 2007. Coconut water and BAP successfully replaced zeatin in olive (Olea europaea L.) micropropagation. Scientia Horticulturae, 113: 1-7. 12. Yang J. S. and Chuang S. H., 1995. Callus formation and plant regeneration from petiole - derived calli of Angelica sinensis. Plant Tis. Cul. Lett., 12(1): 91-93. 13. Yong H., Ge L., Yan N., Tan N., 2009. The chemical composition and biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water. Molecules, 14: 5144-5164. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204 204 A STUDY ON ORGANOGENESIS FROM THIN CELL LAYER CULTURE OF Angelica acutiloba Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Thi Quynh1, Nguyen Vu Ngoc Anh1, Nguyen Le Anh Thu1, Toyoki Kozai2 (1)Institute of Tropical Biology, VAST (2)Chiba University, Japan SUMMARY Angelica (Angelica acutiloba) plants originating in Japan were considered as of higher value than other varieties of the genus Angelica. Angelica’s roots have been used historically to treat health disorders and in many supplemental remedies in Asian traditional medicine. In this study, organogenesis from thin cell layer culture of japanese Angelica shoot tips and leaf blades was shown. Thin layers (1-1.5 mm thick) of shoot tips of Angelica were cultured on MS medium supplemented with NAA (0, 0.1, or 0.2 mg/l) and/or TDZ (0.1, 0.5 or 1 mg/l). The numbe of shoots was the largest (8.9 shoots/explant) when explants were cultured on the medium supplemented with 0.1 mg/l NAA and 1 mg/l TDZ. When Morel vitamins were replaced by Gamborg’s B5 vitamins together with the addition of 10% (v/v) coconut water and 40 mg/l adenine to the culture medium, the number of shoots per explants was remarkably increased after 6 weeks of culture. In vitro Angelica leaves also proved a potential source for adventitious root production. On MS medium supplemented with kinetin (0 or 1 mg/l), NAA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), the first open leaves from the shoot tip, when cultured in dark period, had a different response to the root formation. The root formation from japanese Angelica’s leaf culture significantly varied with the change of medium elements (minerals and vitamins). Percent of leaf explants having roots, number of roots per explant, root fresh and dry weights were the largest when leaf blades were cultured on the medium containing minerals and vitamins of Gamborg’s B5. Keywords: Angelica acutiloba, Adventitios root, organogenesis, plant growth substances. Ngày nhận bài: 21-6-2012