Nghiên cứu sử dụng Viscozyme L trong sản xuất carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii (Doty) doty)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 107 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN (KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY) STUDIES ON THE USE OF VISCOZYME L FOR EXTRACTION OF CARRAGEENAN FROM KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY Lê Thị Thúy Hằng1, Vũ Ngọc Bội2 Ngày nhận bài: 03/7/2012; Ngày phản biện thông qua: 07/01/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm enzyme để thay thế các hóa chất trong tách chiết carrgeenan từ rong sụn giảm thiểu ô nhiễm môi trường đang là hướng đi mới rất được quan tâm. Viscozyme L là endo-beta-glucanase có thể thủy phân liên kết (1-3)- hoặc (1-4)- trong beta-D-glucans nên có thể sử dụng để xử lý rong sụn trước khi nấu chiết carrageenan thay cho xử lý bằng hóa chất. Nghiên cứu này đã tìm ra điều kiện tối ưu cho việc xử lý rong để sản suất carrageenan bằng enzyme Viscozyme L như sau: tỷ lệ enzyme/rong = 1,45%; t0 = 420C; pH =5,1; t = 60 phút. Xử lý rong theo điều kiện tối ưu thu được carrageenan có màu trắng sáng và sức đông là 655g/cm2. Từ khóa: Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, carrageenan, Viscozyme L ABSTRACT The applying enzyme product replaced some chemicals to extract carrageenan from Kappaphycus alvarezii is the new method which can reduce environmental pollution and up to now it would be more and more popular. Viscozyme L is an endo-beta-glucanase that hydrolyzes (1,3)- or (1,4)-linkages in beta-D-glucans. Therefore, it can be use to treat Kappaphycus alvarezii before extraction of carrageenan instead of chemical treatment. This study found that the optimal condition for treating Kappaphycus alvarezii as follows: enzyme/seaweed ratio = 1,45%; t0 = 420C; pH =5,1; t = 60 minutes. Carrageenan obtained by treatment of seaweed under the optimal condition had white color with a gel strength of 665g/cm2. Keywords: Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, carrageenan, Viscozyme L 1 Lê Thị Thúy Hằng: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Vũ Ngọc Bội: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Rong sụn (Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty) là loài rong biển nhiệt đới có giá trị kinh tế cao. Thành phần hoá học chủ yếu của rong sụn là Carrageenan, chiếm 40 - 55% khối lượng rong khô. Việc sản xuất Carrageenan được bắt đầu từ năm 1862. Hiện nay, các nước sản xuất Carrageenan nhiều trên thế giới là Philipine, Mỹ, Đan Mạch, Pháp Năm 2001, tổng sản lượng Carrageenan trên thế giới là 42.390 tấn, trong đó: Châu Âu chiếm 32%, Mỹ 21%, Châu Á - Thái Bình Dương 47%. Sản lượng rong sụn của nước ta năm 2005 khoảng 150 tấn khô và tiếp tục gia tăng trong các năm tiếp bằng. Tuy nhiên, các cơ sở sản xuất carrageenan từ rong sụn còn rất hạn chế và nhỏ lẻ, nguồn carrageenan thường được nhập khẩu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước [1], [2]. Hiện nay, các công trình nghiên cứu về rong sụn chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nuôi trồng và thu nhận carrageenan từ rong sụn bằng quy trình xử lý rong bằng hóa chất. Phương pháp xử lý rong bằng hóa chất để sản xuất carrageenan có nhược điểm là carrageenan thu được thường lẫn với hóa chất nên quá trình tinh chế gặp nhiều khó khăn nhất là khi sử dụng carrageenan trong lĩnh vực y dược và dược phẩm. Ngoài ra, việc sử dụng hóa chất còn Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 108 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG gây nên các vấn đề về ô nhiễm môi trường. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng enzyme polysaccharase để thu carrageenan có nhiều ưu điểm về hiệu suất và carrageenan thu được sẽ dễ dàng tinh chế. Nghiên cứu của Soovendran và cộng sự (2009) cho thấy sử dụng enzyme cellulase để thu nhận carrageenan từ rong sụn cho hiệu suất rất cao khoảng 45%. Viscozyme L là một phức hợp đa enzyme bao gồm arabanase, cellulase, β-glucanase, hemicellulase và xylanase, sử dụng chế phẩm này để xử lý nguyên liệu thực vật có tác dụng làm giảm độ nhớt, cải thiện tính chất của nguyên liệu và giúp tăng hiệu suất quá trình tách chiết những thành phần mong muốn của thực vật. Do vậy, đề tài này đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme Viscozyme L để thay thế hóa chất trong xử lý rong sụn (Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty) để sản xuất carrageenan. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu a. Rong sụn (Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty) được trồng ở vùng biển Khánh Hòa, Việt Nam. Rong sụn sau khi được thu mua, rửa sạch cát, muối và phơi khô để đạt được độ ẩm khoảng 30,5%. Sau đó, rong được bảo quản tại phòng thí nghiệm và sử dụng cho nghiên cứu. b. Chế phẩm enzyme: Visozyme L của hãng Novozymes, hoạt độ 100 FBG/g, điều kiện thích hợp để chế phẩm hoạt động: pH 3,3 - 5,5 và nhiệt độ 50 - 550C. Bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ 1- 100C c. Hóa chất: CH3COOH, NaOH, KCl là những hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích do Trung Quốc sản xuất. 2. Phương pháp nghiên cứu - Xác định hàm ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo tiêu chuẩn TCVN 3700-90. - Xác định đường tổng số: bằng phương pháp Dubois [4]. - Xác định hàm lượng 3,6- anhydro-galactose: bằng phương pháp Yaphe [7]. - Xác định hàm lượng sulfate: bằng phương pháp Terho [6]. - Xác định độ nhớt: bằng phương pháp Craigle [3]. - Xác định độ bền gel: bằng phương pháp Craigle [3]. - Phương pháp tối ưu hóa: tối ưu hóa quá trình nghiên cứu bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp I. Quá trình thu carrageenan được bố trí theo thí nghiệm sau: Rong sụn khô Ngâm nước 8 – 10h Xử lý bằng enzyme Viscozyme L Rửa Nấu chiết Lọc Dịch lọc Lạnh đông tan giá Phơi khô Carrageenan Đánh giá chất lượng Bã KCl 0,3% Tỷ lệ nước/rong khô: 50/1 Nhiệt độ: 900C Thời gian 80 phút E/R= 1% - 1,5% t0 = 400C – 500C pH : 4,6 – 5,2 Hình 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sử dụng Viscozyme L để xử lý rong sụn trong sản xuất carrageenan Giải thích sơ đồ: rong sụn được ngâm trương nở từ 8 - 10 giờ sau đó đem xử lý với Viscozyme L trong thời gian 60 phút. Lần lượt nghiên cứu các điều kiện thích hợp để xử lý rong bằng enzyme với tỷ lệ enzyme/rong từ 1% - 1,5%, nhiệt độ ngâm rong 40 - 500C và pH 4,6 - 5,2. Sau đó, rong được đem đi nấu chiết ở 900C, tỷ lệ nước/rong khô: 50/1 và thời gian 80 phút. Hỗn hợp được lọc qua một lớp vải, rồi bổ sung 0,3% KCl vào dịch lọc, để đông tự nhiên, cắt miếng, cấp đông, rã đông và làm khô thu sản phẩm carrageenan. Kết quả đánh giá: hiệu suất thu nhận và sức đông của carrrageenan. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 109 Tiếp theo, để khảo sát các giá trị tối ưu, áp dụng quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp I với 3 yếu tố và 2 hàm mục tiêu theo sơ đồ sau: Ta có biến đầu vào: - Z1: nồng độ enzyme/rong 1% - 1,5% - Z2: nhiệt độ xử xử lý rong 40 0C – 500C - Z3: pH 4,6 – 5,2 Hàm mục tiêu: - Y1: Sức đông của carrageenan - Y2 : Hiệu suất thu carrageenan Các yếu tố ảnh hưởng n = 3 và số thí nghiệm N = 2k + 3 = 11. Phương trình hồi quy có dạng: Y = b0 + b1x + b2x + b3x + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 Hàm mục tiêu được lựa chọn trong quá trình tối ưu hóa là hàm sức đông và hàm hiệu suất thu carrageenan, đây là các chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng cũng như ảnh hưởng lớn đến chi phí sản xuất. Thực tế không thể có một nghiệm chung cho cả hai quá trình để đạt được y1 và y2 gần y1max, y2max. Để tìm được nghiệm thỏa mãn sử dụng phương pháp chập tuyến tính: YL = α1y1 + α2y2 Trong đó - α1: hệ số quan trọng ứng với hàm mục tiêu sức đông (y1) - α2: hệ số quan trọng ứng với hàm mục tiêu hiệu suất (y2) Với mục đích thu nhận carrageenan có chất lượng cao nên ưu tiên cho hàm mục tiêu là sức đông, chọn α1 = 0,6, α2 = 0,4 (Vì sức đông là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến chất lượng carrageenan còn hiệu suất ảnh hưởng nhiều đến chi phí sản xuất) Ta có hàm đa mục tiêu: YL = 0,6y1 + 0,4y2 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tối ưu hóa công đoạn ngâm rong Bảng 1. Khoảng biến đổi của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu carrageenan Các mức Các yếu tố ảnh hưởng Z1 (tỷ lệ enzyme/rong) Z2 (nhiệt độ) Z1 (pH) Mức trên (+1) 1,5% 500C 5,2 Mức cơ sở (0) 1,25% 450C 4,6 Mức dưới (-1) 1% 400C 4,9 Khoảng biến thiên 0,25% 50C 0,3 Quy hoạch thực nghiệm gồm 11 thí nghiệm, kết quả thực nghiệm được trình bày như sau: STT Biến mã Y1 Y2x1 x2 x3 x12 x13 x23 x123 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 569 33,9 2 1 -1 -1 -1 -1 1 1 571,3 36,5 3 -1 1 -1 -1 1 -1 1 529,4 33 4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 564 34,9 5 -1 -1 1 1 -1 -1 1 567 35,5 6 1 -1 1 -1 1 -1 -1 581,4 36,8 7 -1 1 1 -1 -1 1 -1 563,3 35,2 8 1 1 1 1 1 1 1 582,9 33,9 T1 0 0 0 0 0 0 0 580,87 34,5 T2 0 0 0 0 0 0 0 577,57 34 T3 0 0 0 0 0 0 0 581 34,3 Công đoạn ngâm rong Z 1 Y1 Y 2 Z 2 Z3 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 110 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hàm sức đông và hiệu suất thu hồi carrageenan được biểu diễn theo bằng mô hình sau: Y1 = 566,04 + 8,86x1 – 6,14x2 + 7,6x3 + 4,69x12 + 5,59x23 - 3,39x123 Y2 = 34,96 + 0,56x1 - 0,71x2 + 0,39x3 - 0,41x12 - 0,56x13 Phân tích hồi quy cho thấy hai mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thông kê với độ tin cậy 99,95%. Lần lượt xét ảnh hưởng của từng yếu tố đến sức đông và hiệu suất thu nhận carrageenan. Khi tăng lượng chế phẩm Viscozyme L bổ sung để ngâm rong thì cả sức đông và hiệu suất đều tăng theo, chế phẩm Viscozyme L chứa enzyme polysacharase có tác dụng bào mòn tế bào thân rong thu được lượng carrageenan. Nhiệt độ ngâm rong cũng ảnh hưởng lớn đến sức đông và hiệu suất, ở nhiệt độ thích hợp tạo điều kiện để enzyme xúc tác phản ứng thủy phân thân rong. Trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu 40- 550C, để tăng hai yếu tố này cần phải giảm nhiệt độ xử lý vì khi nhiệt độ quá cao lại là yếu tố kìm hãm hoạt độ xúc tác enzyme khi thủy phân rong vì bản chất enzyme cũng chính là protein, dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao. Ngoài ra, sức đông và hiệu suất cũng chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi pH ngâm rong, pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thủy phân màng cellulose của thân rong, nó làm thay đổi trạng thái ion hóa các nhóm định chức ở trung tâm hoạt động của enzyme. Khi tăng pH trong khoảng nghiên cứu thì cả sức đông và hiệu suất thu nhận đều tăng theo. Quá trình tách chiết carrageenan từ rong sụn được tiến hành sao cho thu được carrageenan có sức đông và hiệu suất cao nhất. Vì vậy, nghiên cứu đã tối ưu hóa các hàm mục tiêu bằng phương pháp chập tuyến tính. Bảng 2. Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc của hàm chập YL Hệ số b Y1 Y2 YL b0 566,04 34,96 353,61 b1 8,86 0,56 5,54 b2 -6,14 -0,71 -3,97 b3 7,6 0,39 4,72 b12 4,69 -0,41 2,65 b13 -0,56 -0,65 b23 5,59 5,59 b123 -3,39 -3,39 Ta có phương trình hồi quy: YL = 353,61 + 5,54x1 – 3,97x2 + 4,72x3 + 2,65x12 – 0,65x13 + 5,59x23 – 3,39x123 Kết quả tối ưu hóa thu được như sau: tỷ lệ enzyme/ rong 1,45%, nhiệt độ ngâm rong 420C, pH là 5,1. Khi đó carrageenan thu được có sức đông đạt 655g/cm2, hiệu suất thu nhân đạt 34,5%. 2. Đề xuất quy trình công nghệ Sau khi nghiên cứu, quy trình công nghệ sử dụng chế phẩm Viscozyme L thu nhận carrageenan được đưa ra như sau: Hình 2. Quy trình công nghệ sử dụng chế phẩm Viscozyme L thu nhận carrageenan Rong sụn khô Ngâm nước 8 – 10h Xử lý bằng Viscozyme L Nấu chiết Lọc Dịch lọc Lạnh đông tan giá Phơi khô Carrageenan Bã KCl 0,3% Nhiệt độ: 900C Tỷ lệ nước/rong khô: 50/1 Thời gian nấu: 80 phút Enzyme/rong: 1,45%; pH 5,1 Nhiệt độ: 420C pH: 5,1 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 111 IV. KẾT LUẬN Sau khi nghiên cứu, đưa ra các thông số kỹ thuật tối ưu cho các công đoạn xử lý rong bằng chế phẩm Viscozyme L và đề xuất được quy trình công nghệ tách chiết carrageenan từ rong sụn trồng tại vùng biển Khánh Hòa. Chất lượng carrageenan tách chiết theo quy trình này được thể hiện qua các chỉ tiêu chất lượng sau: + Sức đông: 655 g/cm2 + Hiệu suất thu nhận carrageenan đạt 34,5% + Màu sắc: trắng sáng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đào Trọng Hiếu, 2007. Tối ưu hóa quy trình công nghệ tách chiết carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii. Tạp chí Khoa học công nghệ và Kinh tế thủy sản, Tập số 7: trang 15 – 17. 2. Trần Đình Toại, Nguyễn Xuân Nguyên, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bích Thủy, Trần Thị Hồng (2006). Carrageenan từ rong biển - Sản xuất và ứng dụng. NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. Tiếng Anh 3. Craigie, J.C, Leigh, C, 1978. Carrageenan and agar. In handbook of phycoligical method, Physiological and Biochemical methods - Cambridge Univ. Press. 09 - 31 4. Dubois, W. S., Wilton, O. C., Cas Kill, J.MC., Humm, HJ.and Wolf, F.A. 1956. Colorimetric method for determination of sugar and related subtances. Analytical Biochemistry, 28, 350 - 356 5. Soovendran A/l Varadarajan, Nazaruddin Ramli, Arbakariya Ariff, Mamot Said, Suhaimi Md Yasir, 2009. Development of high yielding carragenan extraction method from Eucheuma Cotonii using cellulase and Aspergillus niger, Prosiding Seminar Kimia Bersama UKM-ITB VIII - 461 6. Terho, T.T., Kartiala, 1971. Method for determinantion of the sulphate contenf of glycosaminoglycan. Analytical Biochemistry, 41, 471 - 476 7. Yaphe, W., Arsenault, G. P., 1965. Improved resorciol reagent for the determination of fructose and 3,6 anhydrogeatose in polysaccharides. Analytical Biochemistry, 3, 143 – 148