Nghiên cứu sử dụng hormone LHRHa và hcg để kích thích sinh sản cho cóc nhà Duttaphrynus melanostictus (Schneider, 1799) - Đỗ Văn Thu

TAP CHI SINH HOC 2014, 36(2): 259-264 DOI: 10.15625/0866-7160.2014-X NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HORMONE LHRHa VÀ HCG ĐỂ KÍCH THÍCH SINH SẢN CHO CÓC NHÀ Duttaphrynus melanostictus (Schneider, 1799) Đỗ Văn Thu, Đoàn Việt Bình*, Trần Xuân Khôi, Lê Thị Huệ, Võ Thị Ninh Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *dvietbinh@yahoo.com TÓM TẮT: Ở Việt Nam, trong những năm gần đây số lượng cóc nhà, Duttaphrynus melanostictus (Schneider, 1799), sống trong tự nhiên bị giảm mạnh do cóc bị săn bắt quá mức và ô nhiễm môi trường. Cóc nuôi trong các trang trại sinh sản rất kém. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật sinh sản hỗ trợ có thể làm cơ sở cho việc bảo tồn cóc nhà. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu kích thích cóc đực sinh tinh trùng và kích thích cóc cái đẻ trứng. Cóc đực được tiêm LHRHa, liều tiêm 2 µg/g thể trọng và HCG, liều tiêm 3 IU/g thể trọng để kích thích sinh tinh trùng. Cóc cái được chia thành hai lô. Một lô được tiêm duy nhất một liều 500 IU HCG / con (quy trình không tiêm mồi). Lô còn lại trước tiên được tiêm hai lần, mỗi lần tiêm 100 IU HCG/con, cách nhau 72 giờ, sau đó 48 giờ tiêm 500 IU/con (quy trình tiêm mồi). Kết quả cho thấy, tiêm LHRHa và HCG kích thích cóc đực sinh tinh tốt nhất vào thời gian từ 5-7 giờ sau khi tiêm. Sau khi tiêm LHRHa 5 giờ, nồng độ tinh trùng cóc đạt 2,6 triệu/ml, số tinh trùng vận động đạt 82,5%; sau khi tiêm HCG, nồng độ tinh trùng đạt 1,96 triệu/ml và số tinh trùng vận động đạt 85%. Cóc cái không tiêm mồi không đẻ trứng. Trong khi quy trình tiêm mồi dùng HCG đã kích thích được 60 % cóc cái đẻ trứng vào khoảng thời gian từ 14-16 giờ sau khi tiêm mũi cuối cùng. Từ khóa: Cóc nhà, kích thích sinh tinh trùng, kích thích đẻ trứng, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. MỞ ĐẦU Cóc nhà, Duttaphrynus melanostictus, là loài lưỡng cư phân bố rộng ở Việt Nam cũng như ở nhiều nước của châu Á. Ở Việt Nam, cóc cái sống trong tự nhiên thường đẻ chủ yếu vào tháng 3-tháng 5, khi bắt đầu có những cơn mưa rào. Những biến đổi của buồng trứng cóc cái trong năm có thể được chia thành các giai đoạn: giai đoạn trước khi đẻ, giai đoạn cóc đẻ và giai đoạn sau đẻ cho đến khi chuẩn bị chu kỳ mới [7]. Cóc đực mặc dù có khả năng tham gia sinh sản quanh năm nhưng dựa vào những thay đổi của hàm lượng hormone androgen, khối lượng tinh hoàn, hoạt tính sinh tinh có thể chia chu kỳ sinh sản của cóc đực thành các giai đoạn trong năm như sau: thời kỳ sinh sản, thời kỳ sau sinh sản, thời kỳ tích lũy năng lượng và thời kỳ ngủ đông [5]. Các yếu tố như tuổi, khối lượng, ngủ hè, ngủ đông cũng là những yếu tố có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của cóc nhà [12]. Thống kê lưỡng cư toàn cầu cho thấy, trong tổng số 6000 loài lưỡng cư mà khoa học đã biết thì có đến 32% ở mức độ tuyệt chủng [6], trong khi tỷ lệ này ở các loài thú chỉ là 22% và các loài chim là 12%. Thậm chí có họ như Bufonidae còn có nguy cơ tuyệt chủng rất cao, đến 45,6%. Nguyên nhân là do những thay đổi về môi trường, môi trường sống của các loài lưỡng cư bị thu hẹp lại, do bị khai thác quá mức, do các bệnh dịch [13]. Ở các nước Đông Nam châu Á môi trường sống của lưỡng cư thu hẹp nhanh hơn các vùng nhiệt đới khác. Vì vậy, lưỡng cư ở đây đối mặt với nhiều nguy cơ hơn và có tới một phần năm các loài lưỡng cư ở đây bị ghi nhận là có nguy cơ bị tuyệt chủng [6]. Ở Việt Nam, cóc nhà thường được dùng làm thuốc chữa bệnh cho người. Trong những năm gần đây, cóc còn được sử dụng làm thức ăn cho rắn, kỳ đà [11]. Thêm vào đó, môi trường sống của cóc cũng như của nhiều loài lưỡng cư cũng bị ảnh hưởng bởi nạn chặt phá rừng, tăng sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp. Vì vậy, số lượng cóc nhà sống trong tự nhiên bị giảm mạnh. Để giúp bảo tồn một số loài cóc có nguy cơ tuyệt chủng cao, một số nước trên thế giới đã áp dụng biện pháp nuôi chúng trong các trang trại rồi thả trở lại về môi trường tự nhiên [4]. Tuy nhiên, cóc nuôi ở đây bộc lộ nhiều hạn chế về mặt sinh sản như: con đực mất đi các tập tính sinh sản thông thường (không gọi và ôm con cái lúc giao phối), không có tinh trùng hoặc không có sự đồng pha giữa sự sinh tinh trùng của con đực và sự đẻ trứng của con cái, tỷ lệ rụng trứng của cóc cái thấp, cóc đẻ ít trứng và tỷ lệ thụ thai rất thấp [10]. Vì vậy, bên cạnh các biện pháp nuôi dưỡng, thực tế đòi hỏi rất cần thiết phải nghiên cứu những kỹ thuật sinh sản hỗ trợ để giúp cho cóc nuôi có thể sinh sản bình thường. Trong đó, trước tiên tập trung nghiên cứu các quy trình kích thích sinh tinh ở con đực và gây rụng trứng ở con cái. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các loại hormone khác nhau để kích thích cho cóc đẻ, chủ yếu là các loài cóc sống ở châu Mỹ và châu Úc [1, 2]. Brown et al. (2006) [1] đã thử nghiệm tiêm kết hợp 1,8µg LHRHa/g cùng với 0,15 mg progesterone sau đó 24 giờ tiêm thêm 1,8µg LHRHa/g đã kích thích được 71% cóc (Bufo fowleri) đẻ trứng với tỷ lệ thụ thai là 73±5%. Brown et al. (2006) [2] lại dùng 500 IU HCG + 4 µg LHRHa làm liều tiêm mồi để giúp trứng phát triển. Sau đó 72 giờ, lại tiêm tiếp liều tiêm mồi thứ hai với hàm lượng hormone ít hơn (100 IU HCG + 0,8 µg LHRHa). Cuối cùng, sau 168 giờ của lần tiêm thứ nhất tiêm liều tiêm kích thích rụng trứng (500 IU HCG + 4 µg LHRHa). Kết quả tiêm đã làm cho 8/9 (88,88%) cóc (Bufo baxteri) đẻ trứng. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có tài liệu nào công bố về dùng hormone kích thích cho cóc nhà Duttaphrynus melanostictus đẻ. Ở Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu nào về vấn đề này. Bài báo này trình bày về những kết quả nghiên cứu kích thích cóc đực sinh tinh trùng và kích thích cóc cái đẻ trứng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu gồm hormone LHRHa của hãng Syndel Laboratories ltd. (Canada), HCG của LG life Sciences (Hàn Quốc). Kính hiển vi Olympus (Nhật). Cân phân tích Toledo của hãng Mettler (Thụy Sĩ). Mẫu vật sử dụng trong nghiên cứu này gồm cóc nhà trưởng thành, cóc cái có khối lượng từ 80-100 g/con, cóc đực có khối lượng từ 50-60 g/con. Cóc lô thí nghiệm và đối chúng được nuôi cùng trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm phòng thí nghiệm bình thường. Cóc được cho ăn và uống nước tự do theo nhu cầu của cơ thể. Thức ăn của cóc là ấu trùng sâu gạo và dế mèn. Quy trình tiêm cóc đực Quy trình tiêm LHRHa: tiêm LHRHa vào túi bạch huyết dưới da lưng, pha LHRHa trong 200 µl nước muối sinh lý, liều tiêm 2 µg/g thể trọng. Sau 3 giờ và các giờ tiếp theo, lấy nước tiểu cóc soi tìm tinh trùng. Quy trình tiêm HCG: tiêm HCG vào túi bạch huyết dưới da lưng, pha HCG trong 200 µl nước muối sinh lý, liều tiêm 3 IU/g thể trọng. Tiêm cóc đối chứng: tiêm 200 µl nước muối sinh lý vào túi bạch huyết dưới da lưng. Kỹ thuật thu nước tiểu: bắt cóc đực nhẹ nhàng để tránh cóc bị kích thích. Dùng giấy hoặc khăn thấm khô phần thân dưới của cóc. Sau đó dùng tay vuốt nhẹ phần dưới bụng cóc để kích thích cóc phóng nước tiểu. Hứng nước tiểu cóc vào đĩa Petri hoặc cốc sạch. Sau đó soi tìm tinh trùng và đếm dưới kính hiển vi bằng buồng đếm Neubauer theo phương pháp của Kouba et al. (2012 ) [9]. Đánh giá tinh trùng vận động theo phương pháp của Kouba et al. (2012) [9], kết quả thu được, được xử lý xác suất thống kê trên Excel. Quy trình tiêm cóc cái Quy trình tiêm không mồi: tiêm HCG vào ổ bụng, pha HCG trong 200 µl nước muối sinh lý, liều tiêm 500 IU/con. Những ngày sau đó theo dõi xem cóc có đẻ không. Quy trình tiêm mồi ngày thứ 1: tiêm HCG với liều 100 IU/con. Sau 72 giờ, tiêm nhắc lại như ngày 1; sau 48 giờ, tiêm HCG với liều 500 IU/con. Những ngày sau đó theo dõi xem cóc có đẻ không. Sau khi tiêm HCG lần cuối, nhốt cóc cái chung với cóc đực trong bình thủy tinh có kích thước 20 cm × 30 cm × 40 cm. Đáy bình đổ một lượng nước cao khoảng 5 cm. Thời gian thí nghiệm: tháng 9 đến tháng 12 năm 2013. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kích thích cóc sinh tinh trùng Sau khi tiêm hormone, toàn bộ số cóc đực của lô thí nghiệm đều có tinh trùng trong nước tiểu, trong khi cóc ở lô đối chứng không có tinh. Có 90% cóc đực được tiêm LHRHa có biểu hiện ôm cóc cái, trong khi chỉ có 60% cóc tiêm HCG có biểu hiện này (bảng 1). Trong khoảng thời gian từ 5-7 giờ sau khi tiêm, nồng độ tinh trùng đạt mức cao nhất, sau đó giảm dần và còn rất ít sau 11 giờ (hình 1). Tiêm LHRHa cho nồng độ tinh trùng cao hơn so với tiêm HCG (bảng 2), tuy nhiên sự khác nhau này không có ý nghĩa (p>0,05). Tổng số tinh trùng vận động sau khi tiêm LHRHa cao nhất trong thời gian từ 5-7 giờ, sau đó giảm dần. Trong khi đó, sau khi tiêm HCG số tinh trùng vận động gần như không thay đổi cho đến 11 giờ (bảng 3). Tổng số tinh trùng vận động sau khi tiêm LHRHa 3 giờ thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p0,05), rồi lại thấp hơn trong thời gian 9-11 giờ (p<0,001). Bảng 1. So sánh tác động của tiêm LHRHa và HCG lên cóc đực Hormone Số cóc thí nghiệm (con) Khối lượng trung bình (g/con) Số cóc có tinh trùng (con) Số cóc đực ôm cóc cái (con) LHRHa 30 53,8±0,63 30 27 HCG 30 53,4±0,49 30 18 Bảng 2. Nồng độ tinh trùng của cóc sau khi tiêm hormone(triệu/ml) Hormone Thời gian sau khi tiêm(giờ) 3 5 7 9 11 LHRHa 2,25±0,09 2,6±0,05 2,49±0,08 0,39±0,06 0,13±0,04 HCG 1,64±0,07 1,96±0,03 1,57±0,06 0,30±0,03 0,12±0,02 Hình 1. Nồng độ tinh trùng cóc sau khi tiêm hormone Hình 2. Ảnh tinh trùng cóc (độ phóng đại 10 × 40 ) Bảng 3. Tổng số tinh trùng vận động của cóc sau khi tiêm hormone (%) Hormone Thời gian sau khi tiêm(giờ) 3 5 7 9 11 LHRHa 20,5±3,01 82,5±2,11 80±3,92 22±2,96 17±3,53 HCG 60±7,61 85±2,35 80±2,72 80±3,23 80±2,72 Kích thích cóc cái đẻ Kết quả cho thấy quy trình tiêm HCG, không tiêm mồi không có tác dụng đối với cóc cái, trong khi quy trình tiêm mồi rồi mới tiêm HCG cho tỷ lệ cóc cái đẻ là 60% ( bảng 4). Thảo luận Các loài lưỡng cư phản ứng khác nhau đối với các kích thích bằng hormone sinh sản. Vì vậy, cần tìm quy trình tiêm tối ưu cho riêng mỗi loài. Trong thí nghiệm, cả hai quy trình tiêm LHRHa hay HCG đều kích thích cóc đực sinh tinh. Trong cả hai quy trình, nồng độ tinh trùng và tổng số tinh trùng vận động đều đạt mức cao nhất tại thời điểm từ 5 đến 7 giờ sau khi tiêm hormone và nồng độ tinh trùng đều cao hơn so với số lượng tối thiểu cần phải có là 106 để có thể đảm bảo cho cóc cái có thể thụ tinh được [3]. Tuy nhiên, chỉ có quy trình tiêm LHRHa đạt được tỷ lệ cóc đực ôm cóc cái là 90%, trong khi tỷ lệ này của quy trình tiêm HCG chỉ đạt 60%. Vì vậy, tiêm LHRHa sẽ thích hợp hơn khi áp dụng cho các trường hợp kích thích để cóc giao phối và đẻ tự nhiên, còn tiêm HCG sẽ thích hợp cho việc thu tinh trùng để thụ tinh nhân tạo cho chúng. Bảng 4. Kết quả tiêm hormone kích thích cóc đẻ Quy trình tiêm HCG Số cóc được tiêm ( con ) Khối lượng trung bình (g/con) Số cóc đẻ ( con ) Thời gian đẻ sau khi tiêm (giờ) Không tiêm mồi 20 89,5±1,36 0 Tiêm mồi 20 92,8±1,09 12 14-16 Cóc cái sống trong tự nhiên chỉ đẻ một lần trong năm, vào tháng 3 đến tháng 5, khi trong buồng trứng đã có đầy đủ trứng phát triển ở giai đoạn cuối. Thời gian này được gọi là giai đoạn cóc đẻ. Những giai đoạn khác (giai đoạn trước khi đẻ và giai đoạn sau đẻ cho đến khi chuẩn bị chu kỳ mới), cóc không đẻ do trứng trong buồng trứng còn đang ở giai đoạn tạm ngừng phát triển hay còn chưa phát triển đầy đủ. Trong buồng trứng, các tế bào trứng lớn dần từ nang trứng I đến nang trứng VI [7]. Trong các nang trứng từ I-III, tế bào trứng tiết ra estradiol, là hormone ức chế đẻ trứng. Trong các nang từ IV-VI, sự tiết estradiol giảm dần trong khi testosterone và progesterone tăng lên thúc đẩy trứng phát triển và đẻ trứng. Sự phát triển của trứng phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ môi trường, thức ăn và tuổi của con cái [8]. Trứng không phát triển liên tục mà thành từng đợt, có các đợt nghỉ xen kẽ, khi thời tiết quá nóng hoặc quá lạnh. Vì vậy, để có thể kích thích trứng cóc phát triển giống trong tự nhiên, cần phải tiêm nhắc lại nhiều lần hormone với liều thấp hay còn gọi là tiêm mồi, trước khi tiêm liều cao để gây rụng trứng [2]. Thí nghiệm được tiến hành trên cóc, trong thời gian từ tháng 9 đến tháng 12, là thời gian chúng đang ở giai đoạn chuẩn bị ngủ đông. Chính vì vậy, tiêm một lần HCG duy nhất không làm cho rụng trứng, do trong buồng trứng chưa có trứng đã phát triển hoàn thiện (nang trứng VI). Chỉ khi áp dụng quy trình tiêm mồi thì trứng mới có thể phát triển đầy đủ đến giai đoạn cuối và mới kích thích được một số cóc đẻ. Thời gian cóc đẻ vào khoảng từ 14-16 giờ sau mũi tiêm hormone cuối. Trong khi thời gian cóc đực tiết tinh trùng tối ưu là vào khoảng từ 5-7 giờ sau khi tiêm.Vì vậy, cần tiêm cóc đực sau khi tiêm cóc cái từ 8-10 giờ để tạo được sự đồng pha giữa cóc đực sinh tinh và cóc cái đẻ trúng, tạo điều kiện con cái được thụ tinh tốt. Đây mới là những kết quả nghiên cứu bước đầu về khả năng kích thích cóc nhà đẻ trong thời gian không phải là mùa sinh sản của chúng. Do quá trình biến thái của nòng nọc phụ thuộc vào nhiệt độ môi trường, vì vậy, cần có những nghiên cứu về nhiệt độ và độ ẩm thích hợp để nòng nọc biến thái được trong mùa đông. Có như vậy, công trình mới có thể có triển vọng áp dụng được trong thực tiễn. KẾT LUẬN Tiêm LHRHa và HCG kích thích cóc đực sinh tinh tốt nhất vào thời gian từ 5-7 giờ sau khi tiêm. Sau 5 giờ tiêm LHRHa, nồng độ tinh trùng đạt 2,6 triệu/ml, tổng số tinh trùng vận động đạt 82,5%; sau khi tiêm HCG, nồng độ tinh trùng và tổng số tinh trùng vận động đạt 1,96 triệu/ml và 85%. Dùng hormone có thể kích thích cóc nhà, Duttaphrynus melanostictus, đẻ trứng ngay cả trong thời gian không phải là mùa sinh sản của chúng. Quy trình tiêm mồi dùng HCG đã kích thích được 60% cóc cái đẻ trứng vào khoảng thời gian từ 14-16 giờ sau khi tiêm mũi cuối cùng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Browne R. K., Hong L., Jessica S., Andrew K., 2006. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology, 4:3. Browne R. K., Jessica S., Carrie V., Andrew K., 2006. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri), Reproductive Biology and Endocrinology, 4: 34. Cabada M. O., 1975. Sperm concentration and fertilization rate in bufo arenarum (amphibian: anura). J Exp Biol, 62:481-486. Griffiths R. A., Pavajeau L., 2008, Captive Breeding, Reintroduction and the Conservation of Amphibians. Conservation Biology, 22(4): 852-861. Huang W. S., Lin J. Y., Yu J. J. Y., 1997. Mail reproductive cycle of the toad Bufo melanostictus in Taiwan. Zoological Science, 14: 497-503. IUCN, 2014, IUCN Red list of threatened species, version 2014.2 Kanamadi R. D., Saidapur S. K., 1982, Pattern of ovarian activity in the Indian toad Bufo melanostictus (Schn.), Proc. Indian Natn. Sci. Acad., 48(3): 307-316. Kim J. W., Im W. B., Choi H. H., Ishii S., Kwon H. B., 1998. Seasonal fluctuations in pituitary gland and plasma levels of gonadotropic hormones in Rana. Gen Comp Endocrinol., 109:13-23. Kouba A. J., delBarco-Trillo J., Vance C. K., Milam C., Carr M., 2012. A comparison of human chorionic gonadotropin and luteinizing hormone releasing hormone on the induction of spermiation and amplexus in the American toad (Anaxyrus americanus), Reproductive Biology and Endocrinology, 10: 59. Kouba A. J., Vance C. K., Willis E. L., 2009. Artificial fertilization for amphibian conservation: Current knowledge and future considerations. Theriogenology, 71: 214-227. Nguyen T. Q., 2000. Amphibian uses in Vietnam. Froglog, 38: 1-2. Roth T. L., Szymanski D. C., Keyster E. D., 2010. Effects of age, weight, hormones, and hibernation on breeding success in boreal toads (Bufo boreas boreas), Theriogenology, 73: 501-511. Stuart S. N., Chanson J. S., Cox N. A., Young B. E., Rodrigues A. S. L., Fischman D. L., 2004. Status and trends of amphibian declines and extinctions world-wide. Science, 306: 1783-1786. APPLICATION OF LHRHa and HCG TO STIMULATE SPERMIATION AND SPAWNING OF THE TOAD, Duttaphrynus melanostictus (Schneider, 1799) Do Van Thu, Doan Viet Binh, Tran Xuan Khoi, Le Thi Hue, Vo Thi Ninh Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY In Vietnam, the population of Duttaphrynus melanostictus in the wild has been declined due to overharvesting for snake farms and consumption and environmental pollution. While Black-lipped Toad in cativity rarely ovulates spontaneuosly. Therefore, it’s necessary to study the assisted reproductive techniques to help preserve them. In this study, we used LHRHa and HCG to stimulate induction of spermiation and of spawning of toad. Male were injected with 2 µg/g LHRHa or 3 IU HCG/g to stimulate sperm release. Female were divided in two groups: the first group was administred a single dose of 500 IU HCG (considered as unpriming group) and the second group was administred first two sequential anovulatory dose of 100 IU HCG, repeat after 72 hours. Forty-eight hours after the second injection, the ovulatory dose of 500 IU HCG was injected (priming group). The results showed that injection of LHRHa and HCG stimulates sperm release graetest in time from 5-7 hours after injection. Five hours after injection of LHRHa or HCG, toad sperm concentration was 2.6 and 1.96 million/ml, sperm motility was 82.5 and 85%. Unprimed females failed to spawn any eggs. Whereas, 60% of primed females spawned in the period from 14-16 hours after the last injection of HCG. Keywords: Duttaphrynus melanostictus, assisted reproductive technique, spawning induction, spermiation induction, toad. Ngày nhận bài: 13-5-2013