Nghiên cứu phân lập vi khuẩn probiotic từ ruột tôm sú (Penaeus monodon) làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm probiotic trong nước

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 40 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI KHUẨN PROBIOTIC TỪ RUỘT TÔM SÚ (PENAEUS MON ODON) LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRONG NƯỚC STUDY ON ISOLATION PROBIOTIC BACTERIA FROM TIGER SHRIMP GUT (PENAEUS MONODON) AS A SOURCE OF DOMESTIC MATERIAL FOR PROBIOTIC PRODUCTS Phạm Thị Hiền Hòa1, Nguyễn Hữu Dũng2 Ngày nhận bài: 08/11/2013; Ngày phản biện thông qua: 09/8/2014; Ngày duyệt đăng: 01/12/2014 TÓM TẮT Nghiên cứu nhóm vi khuẩn có đặc tính probiotic đang là một xu hướng mới trong những năm gần đây. Nhóm vi khuẩn probiotic có nhiều đặc tính ưu việt, trong đó phải kể đến khả năng ức chế một số loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản. Các loài vi khuẩn probiotic phân lập được là nguồn nguyên liệu đầu tiên để có thể sản xuất chế phẩm probiotic. Bài báo này trình bày kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú (Penaeus monodon ) và kết quả nghiên cứu đặc tính probiotic của chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả định danh bằng kỹ thuật 16S rDNA cho thấy chủng vi khuẩn phân lập được là Pseudomonas stutzeri. Loài vi khuẩn này thể hiện được đặc tính cô lập, sản sinh hoạt chất kháng khuẩn và ức chế sinh trưởng 02 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. Từ khóa: Phân lập, vi khuẩn, probiotic, ruột tôm sú, Pseudomonas stutzeri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus ABSTRACT Study on probiotic bacteria is a new trend in rece nt ye ars. The probiotic bac teria has many advanced properties, especially some characteristics on colonization, producing bactericidal substance and growth inhibition on pathogenic bacteria. Probiotic bacteria isolated will be a initial material for production of probiotic products. This article showed the result of isolation probiotic bacteria strain from tiger shrimp gut (Penaeus monodon) and probiotic properties of isolated bacteria strain. Result from 16S rDNA identifi cation revealed that the isolated bacteria was Pseudomonas stutzeri. This strain could produce bactericidal substance, colonize and in hibit the growth of pathogen bacteria V. alginolyticus and V. parahaemolyticus. Keywords: Isolation, bacteria, probiotic, Pseudomonas stutzeri, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus 1 ThS. Phạm Thị Hiền Hòa: Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng 2 TS. Nguyễn Hữu Dũng: Trường Đại học Nha Trang THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC I. ĐẶT VẤN ĐỀ Với tiềm năng mặt nước rất phong phú và đa dạng, các hình thức và thủy vực nuôi trên cả nước được chia thành nuôi nước ngọt (nuôi ao, nuôi lồng), nuôi ven biển (nuôi ao, đầm, lồng), đem lại nhiều cơ hội cho phát triển về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt trên khắp mọi miền đất nước. Hiện nay, tổng số loài nuôi nước ngọt là 544 loài, nuôi nước lợ và mặn là 186 loài. Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465ha. Gần đây, mô hình nuôi cá tra ao đã đạt đến diện tích trên dưới 6.000ha, với sản lượng xuất khẩu đạt gần 600.000 tấn trong năm 2008 (gấp 3 lần sản lượng tôm xuất khẩu. Mật độ giống thả tăng cao trong mô hình nuôi thâm canh/công nghiệp sẽ dẫn đến môi trường bị ô nhiễm và chất lượng môi trường trở nên khó kiểm soát, vật nuôi dễ bị rơi vào trạng thái “stress”, các vấn đề liên quan đến bệnh và sự suy giảm chất lượng môi trường thường xuyên xảy ra, trong đó có vấn đề phát sinh dịch bệnh. Sử dụng kháng sinh trong giai đoạn sản xuất giống hoặc nuôi thương phẩm đều ảnh hưởng trực tiếp đến sinh vật, như làm cho ấu trùng chậm lớn, Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 41 các giai đoạn biến thái xảy ra không đều, dẫn đến tỷ lệ sống của ấu trùng thấp, tích lũy kháng sinh vào trong thịt. Xu hướng mới hiện nay được áp dụng với nhiều đối tượng nuôi biển là sử dụng chế phẩm probiotic gồm các nhóm vi khuẩn có ích, giúp hạn chế khả năng bị vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm và cải thiện chất lượng môi trường nước. Yasuda và Taga (1980) chỉ ra rằng vi khuẩn không chỉ hữu hiệu cho thực phẩm mà còn là chất ức chế vi khuẩn gây bệnh trên cá và là chất hoạt hóa quá trình tái tạo dinh dưỡng. Xu hướng nghiên cứu phân lập một số vi khuẩn có tiềm năng sử dụng là nhóm vi khuẩn hữu ích (probiotic trong NTTS đang là một hướng nghiên cứu mới, được phát triển ở thế giới từ những năm 1990. Ở Việt Nam, mặc dù nghề NTTS đã phát triển từ khá lâu nhưng hướng nghiên cứu này còn rất mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu lựa chọn các chủng vi khuẩn từ vùng nuôi để dùng làm chế phẩm probiotic phù hợp với điều kiện thực tiễn NTTS Việt Nam. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) (5 con/mẫu, khối lượng 25 ÷ 30g/con) và mẫu bùn (0,5kg/mẫu) được thu ở đầm nuôi tôm tại khu vực Quý Kim - phường Hải Thành - quận Dương Kinh - thành phố Hải Phòng. Các chủng vi khuẩn được phân lập trong trong mẫu ruột tôm sú và mẫu bùn được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Các môi trường nuôi cấy vi khuẩn a. Môi trường phân lập và nuôi cấy bao gồm môi trường NA (Nutrient agar), NB (Nutrient broth) có bổ sung thêm 1,5% NaCl (w/v). b. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus: môi trường TCBS (Thiosulphate citrate Bilesalt Sucroza agar), môi trường LB (Luria Bertani broth) (hai chủng vi khuẩn gây bệnh do Trung tâm nghiên cứu môi trường và dịch bệnh - Viện Nghiên cứu NTTS 1 cung cấp). 3. Phương pháp thu mẫu - Các mẫu tôm sú và bùn được lấy ngẫu nhiên trong đầm nuôi tôm sú vào lúc sáng sớm, lưu giữ trong tú PE vô trùng và đưa về phòng thí nghiệm ngay sau khi thu mẫu. 4. Phương pháp xử lý mẫu - Mẫu tôm được rửa sạch bằng dung dịch NaCl 1,5%, dùng dao chuyên dụng mổ lấy ống tiêu hóa (ruột và dạ dày). Ống tiêu hóa được nghiền nát bằng chày và cối sứ, sau đó hòa vào 5ml dung dịch NaCl 1,5%, sốc nhiệt bằng cách ủ trong bể nước nóng 800C trong 20 phút, sau đó ngâm ngay vào nước lạnh (nước máy). Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn. - Mẫu bùn được pha vào dung dịch NaCl 1,5%. Sử dụng dịch huyền phù này để phân lập vi khuẩn. 5. Phương pháp phân lập, chọn lọc, tinh sạch và giữ giống vi khuẩn - Vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường TCBS ở nhiệt độ 28 - 300C trong 24h. - Các chủng vi sinh vật phân lập được từ mẫu tôm và mẫu bùn được cấy chuyển sang ống thạch nghiêng bằng cách cấy ria, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C, được lưu giống bằng dung dịch Glycerol 20% ở nhiệt độ -800C. 6. Thí nghiệm xác định đặc tính lấn át chủng vi khuẩn gây bệnh + Cô lập chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus, đồng nuôi cấy trong nước biển: thực hiện theo phương pháp của Lemos et al., và Purivirojkul et al., thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 7. Phân loại và định danh vi khuẩn + Phương pháp nhuộm gram (Nguyễn Lân Dũng, 1983). + Phương pháp xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa (Nguyễn Lân Dũng, 1983). + Phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên gen 16 S rDNA. Kết quả các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel 2003, phần mềm BLAST, CLUSTAL X (1,81), MEGA 4.2. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập và lựa chọn một số chủng vi khuẩn probiotic từ ruột tôm sú và bùn đáy đầm nuôi tôm sú tại Hải Phòng Từ mẫu bùn đáy ao nuôi và ruột tôm sú thu tại Quý Kim đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn trên môi trường NA sau khi nuôi cấy từ 2 đến 5 ngày. Sau khi phân lập được các chủng trên, tiến hành thử hoạt tính sinh catalase thu được 8 chủng có phản ứng dương tính. Các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu tôm và mẫu bùn đều cho kết quả dương tính với catalase, trong đó mẫu QKR2 là mẫu từ ruột tôm cho thấy hoạt tính mạnh nhất và khả năng phát triển tốt nhất. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo nhằm kiểm tra hoạt tính probiotic được tập trung tiến hành đối với chủng QKR2. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 42 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ghi nhận được sự có mặt của nhóm vi khuẩn thuộc chi Bacillus là cao nhất. 2. Khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh tôm sú Vibrio spp * Cô lập vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus Khả năng cô lập V. alginolyticus và V. parahaemolyticus của chủng vi khuẩn QKR2 phân lập từ ruột tôm sú nuôi ở Quý Kim được thể hiện ở các hình 2 và 3. Khi nuôi cấy chung với V. parahaemolyticus trên môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl sau 24h vi khuẩn QKR2 đã bắt đầu phát triển mạnh bao vây toàn bộ vi khuẩn V. parahaemolyticus (hình 2B). Sau 48h, đường cấy vi khuẩn V. parahaemolyticus tại vị trí giao nhau của 2 đường cấy chỉ còn là một vệt trắng mờ và bị vi khuẩn QKR2 mọc trùm lên trên (hình 2C). Hiện tượng tương tự cũng được quan sát thấy khi nuôi cấy chung chùng phân lập QKR2 với vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường NA bổ sung 1,5% NaCl (hình 3B, 3C). Hình 1. Chọn lọc chủng vi khuẩn probiotic bằng phản ứng catalase Wiangyos et al., nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn phân lập ở bùn đáy ao nuôi tôm sú từ tháng 9 đến tháng 10 ở đầm nuôi tôm của Thái Lan cũng đã Hình 2. Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. parahaemolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C) Hình 3. Đĩa thạch NA nuôi cấy chung vi khuẩn V. alginolyticus (đường cấy ngang) với chủng QKR2 phân lập từ ruột tôm sú (đường cấy dọc) khi mới cấy (A), sau 24h (B) và sau 48h (C) Một số nghiên cứu cũng đã ghi nhận được khả năng cô lập vi khuẩn Vibrio spp của vi khuẩn Bacillus spp. Purivirojkul et al., đã thông báo kết quả nghiên cứu về khả năng cô lập chủng V. harveyi của chủng B. pumilus, sau 12h và 24h nuôi cấy. Chủng B. pumilus được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon) từ trang trại nuôi tôm ở tỉnh Chachoengsao (Thái Lan). * Ức chế sự phát triển của vi khuẩn V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng Chủng vi khuẩn đối chứng được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường nước biển đều có khả năng phát triển tốt dù môi trường rất nghèo về dinh dưỡng. TCBS là môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn Vibrio spp nên có thể sử dụng làm môi trường kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn Vibrio spp trong thí nghiệm này. Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn Vibrio spp cho thấy 3 chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng lấn át được sự phát triển của chủng Vibrio spp Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 43 sau 96h nuôi cấy trong môi trường nước biển (20ppt) (bảng 1, hình 4). So sánh với kết quả nghiên cứu của Purivirojkul và cs., về khả năng lấn át sự sinh trưởng của chủng Bacillus W120 và Bacillus W1106 với chủng V. harveyi sau 120h nuôi cấy trong môi trường nước biển 20 ppt cũng cho kết quả tương tự. (10ml), mật độ chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản còn cao. Nghiên cứu của Sudthongkong cho biết số lượng vi khuẩn phát sáng ở khu vực ven biển trong khoảng 0,7x101 đến 7,3 x 101 CFU/ml. Trong ao nuôi cá, theo nghiên cứu của Al-Harbi cho thấy, mật độ vi khuẩn tổng số từ 1,8 ± 0,9 x 102 đến 6,0 ± 1,2 x 104. Tuy nhiên, trong thí nghiệm đồng nuôi cấy của tác giả Purivirojkul và cs, chủng vi khuẩn gây bệnh được thử nghiệm với mật độ cao (106tb/ml) nên kết quả về khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của chủng phân lập được có thể chưa thực sự có ý nghĩa. Từ kết quả nghiên cứu về sự lấn át của các chủng Bacillus spp với V. harveyi trong thí nghiệm đồng nuôi cấy, Seel-audom et al., cho rằng có tiềm năng ứng dụng các chủng Bacillus spp như là chủng vi khuẩn probiotic trong nuôi tôm he chân trắng (L. vannamei) (mật độ của V. harveyi ban đầu là 105 CFU/ml). Như vậy, từ các kết quả thí nghiệm về khả năng đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản V. alginolyticus và V. parahaemolyticus của chủng QKR2 cho thấy chủng vi khuẩn phân lập được có tiềm năng ứng dụng là nhóm vi khuẩn probiotic trong NTTS. 4. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái vi khuẩn phân lập Kết quả quan sát hình thái và nhuộm Gram chủng vi khuẩn QKR2 và một số đặc điểm sinh hóa được thể hiện ở bảng 2 và các hình 5 A, 5B. Hình 4. Số lượng khuẩn lạc V. alginolyticus và V. parahaemolyticus trong dịch đồng nuôi cấy với chủng QKR2 theo thời gian Bảng 1. Kết quả ức chế chủng vi khuẩn Vibrio spp của chủng vi khuẩn QKR2 (theo tỷ lệ %) Tên chủng V. alginolyticus V. parahaemolyticus QKR2 28,5% 45% Mặc dù kết quả thí nghiệm cho thấy có sự lấn át về sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập với chủng Vibrio spp nhưng đây cũng chỉ là những nghiên cứu ban đầu do quy mô thí nghiệm rất nhỏ Hình 5. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào nhuộm Gram (B) của chủng QKR2 Bảng 2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn QKR2 Các đặc điểm sinh hóa, sinh lý và hình thái tế bào QKR2 Catalase + Oxidaza - Gram + Di động + Màu sắc khuẩn lạc Trắng đục Hình thái tế bào Hình que Kích thước tế bào 3,3 - 0,4 x 1,2 - 1,8µm Hô hấp hiếu khí + Sinh trưởng ở độ muối (% NaCl) 0 ÷ 5 Sinh trưởng ở nhiệt độ (0C) 15 ÷ 45 Sinh trưởng ở khoảng pH 5 ÷ 9,5 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 44 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 5. Phân tích trình tự gen 16S rDNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn phân lập Phân tích trình tự gen và so sánh với các dữ liệu về chủng chuẩn trên ngân hàng lưu trữ quốc tế DDBJ, EMBL và GenBank cho kết quả như sau: + Trình từ gen 16S rDNA của chủng QKR2 tương đồng 99,9% với đoạn gen 16S của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri. Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 (hình 7) cho thấy chỉ có 2 loài Pseudomonas trong cây chủng loại này. Chủng QKR2 nằm khác nhóm với loài Pseudomonas khác. Nhánh Pseudomonas này có họ hàng gần với một số loài thuộc chi Bacillus. Hình 6. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn phân lập trên gel agarose 1% Đường 1: Marker (1,5 Kb ladder) ; Đường 2: chủng QKR2 Chủng vi khuẩn P. stutzeri được biết đến là loài vi khuẩn chuyển hóa nitrat rất có hiệu quả, khoảng 99% ở nồng độ 200 mg/L NO3 - (Rezaee et al.,). Loài vi khuẩn này rất có tiềm năng ứng dụng trong xử lý môi trường cho những vùng có hàm lượng nitrat cao, trong đó có ao NTTS thâm canh. Một số nghiên cứu đã phân lập và xác định được khả năng khử nitrate của P. stutzeri trong ao nuôi cá tra (Be et al., Diep et al.,). Mặc dù chưa có ghi nhận về sự xuất hiện của P. stutzeri trong ruột tôm, tuy nhiên Bogatyrenko và cs, đã ghi nhận được sự có mặt của loài này trong hệ tiêu hóa của loài hải sâm Apostychopus japonicus tại vùng Viễn Đông (Bogatyrenko et al.,). Cũng trong nghiên cứu này, tác giả đã phát hiện ra loài P. stutzeri có khả năng tổng hợp các enzym tiêu hóa với hoạt tính cao (amylase, chondroitin sulfatase, chitinase, và alginate lyase), được nhận định là có tiềm năng sử dụng là vi khuẩn probiotic. Hình 7. Cây phát sinh chủng loại của chủng QKR2 và các loài có quan hệ họ hàng gần Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 45 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận - Chủng vi khuẩn phân lập đều thể hiện khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh thủy sản qua các hình thức cô lập, sản sinh hoạt chất kháng khuẩn và ức chế sinh trưởng V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. - Chủng QKR2 là vi khuẩn Gram (+), có khả năng di động, hình que, catalase (+).Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng QKR2 có thể là Pseudomonas stutzeri (tương đồng 99,9%). Chủng có tiềm năng được sử dụng như là vi khuẩn probiotic. 2. Kiến nghị Để có thể chọn lựa được những chủng này làm nguồn nguyên liệu probiotic trong nước cần có những nghiên cứu bổ sung nhằm chứng tỏ các đặc tính probiotic như khả năng tồn tại trong môi trường nước mặn, khả năng tiết các hoạt chất, khả năng bùng phát ảnh hưởng đến hệ sinh thái thủy sinh. Cần có các nghiên cứu ở quy mô lớn hơn về khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập với các chủng Vibrio spp, khả năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Lân Dũng, 1983. Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. Tiếng Anh 2. Al-Harbi, A.H., 2003. Faecal coliforms in pond water, sediments and hybrid tilapia Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus in Saudi Arabia, Aquac. Res, 34 (7), 517-518. 3. Be, D.T., Diep, C.N., Phu, T.Q., 2008. Nitrogen Removal in wastewater of catfi sh fi sh-ponds by Pseudomonas stutzeri and Rhodopseudomonas sp., The international symposium on catfi sh aquaculture in Asia at Can Tho University - Vietnam. 4. Bogatyrenko, E.A., Buzoleva, L.S., Chi. Z., 2010. Potential probiotics of the Far Eastern trepang Apostychopus japonicusproducing digestive enzymes, Mikrobiologiya, 2010, Vol. 79 (2), 193–198. 5. Diep, C.N., Cam, P.M, Vung, N.H., Lai, T.T., My, N.T.X., 2009. Isolation of Pseudomonas stutzeri in wastewater of catfi sh fi sh-ponds in the Mekong Delta and its application for wastewater treatment, Bioresource Technology Vol. 100 (16), 3787-3791. 6. Lemos, M.L., Dopazo C.P., Toranzo A.E., 1991. Competitive dominance of antibiotic - producing marine bacteria in mixed cultures. J. Appl. Bacteriol, 71, 228-232. 7. Purivirojkul, W., and Areechon, N., 2007. Application of Bacillus spp. isolated from intestine of black tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habita for control pathogenic bacteria in aquaculture, Kasetsart J. (Nat. Sci), 41, 125-132. 8. Purivirojkul, W., Maketon, M., and Areechon, N., 2005. Probiotic properties of Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus and Bacillus subtilis in black tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) culture, Kasetsart J. (Nat.Sci), 39 (2), 262-273. 9. Razee, A., Godini, H., Dehestani, S., Kaviani, S., 2010. Isolation and characterization of a novel denitrifying bacterium with high nitrate removal: Pseudomonas stutzeri, Iran. J. Environ. Health. Sci. Eng., Vol. 7(4), 313-318. 10. Seel-audom, M., Areechon, N., Srisapoome, P., 2008. Effi cacy of Bacillus spp. isolated from the intestine of Pacifi c white shrimp (Litopenaeus vannamei Boone) on the control of Vibrio harveyi, Kasetsart University Annual Conference, Bangkok. 11. Suthongkong, C., 1996. Identifi cation and drug resistance of luminous bacteria in coastal area of inner Gulf og Thailand. The AAHRI Newsletter 5:2 12. Wiangyos, S., Asawapaitoon, I., Vuthiphandchai, V., Nimrat, S., 2007. Bacterial diversity and antimicrobial susceptibility of bacteria isolated from bottom soil in black tiger shrimp (Penaeus monodon) culture pond, Proceedings of the 45th Kasetsart University Annual Conference, Subject: Fisheries, 475-482. 13. Yasuda, K., & Taga, N., 1980. A mass culture method for Artemis salina using bacteria as food, Mer, 18, 53-62.