Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân hủy 1,2-Dicloroethane phân lập tại Việt Nam - Phạm Thị Vui

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93 88 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN HỦY 1,2-DICLOROETHANE PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Phạm Thị Vui, Phạm Thị Hoa, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, *huynq17@gmail.com TÓM TẮT: 1,2-dicholoroethane (1,2-DCE) là một hoạt chất có trong các thuốc bảo vệ thực vật và là chất có khả năng gây ung thư đối với người và gây ô nhiễm cho môi trường. Việc loại bỏ 1,2-DCE trong môi trường được tiến hành bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó, bằng phương pháp sinh học thông qua việc sử dụng các vi khuẩn có trong tự nhiên mang lại hiệu quả kinh tế và tính bền vững cao. Từ các mẫu đất và nước thải thu được ở các khu vực có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật tại Hà Nội, chúng tôi đã phân lập được 45 chủng vi khuẩn trên môi trường khoáng bổ sung 1,2-DCE là nguồn cacbon duy nhất. Hai chủng vi khuẩn ký hiệu R9, S15 được xác định là các chủng có hoạt tính mạnh nhất. Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải trình tự gen 16S ARNr cho thấy chủng R9 thuộc chi Klebsiella, chủng S15 thuộc chi Pseudomonas với độ tương đồng 99% với các loài trong ngân hàng gen. Chủng R9 phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 23 đến 30°C, còn chủng S15 là 30-37°C. Nồng độ cơ chất 1,2-DCE tối ưu cho hai chủng R9, S15 sinh trưởng là 5 mM. Từ khóa: Klebsiella, Pseudomonas, 1,2-dicholoroethane, môi trường, ô nhiễm, phân hủy, phân lập. MỞ ĐẦU Hiện nay, việc sản xuất và sử dụng các hợp chất halogen trong đó có hợp chất 1,2- dichloroethane (1,2-DCE) trong các ngành công, nông nghiệp ngày một gia tăng. Hợp chất này được sử dụng trong thành phần các thuốc bảo vệ thực vật hoặc là các loại dung môi, hóa chất tổng hợp. Theo các nghiên cứu của Fetzner & Lingens (1994) [3], Olaniran et al. (2004) [6] hợp chất 1,2-DCE dễ cháy, có tính tan thấp trong nước và hầu như không thể phân hủy tự nhiên trong môi trường. Nghiên cứu của Doucette et al. (2010) [2] và Hunkeler et al. (2005) [5] cho thấy, hợp chất này có khả năng gây ung thư cho người cũng như các sinh vật trong hệ sinh thái. Các phương pháp vật lý và hóa học đã được áp dụng trong việc phân hủy 1,2-DCE, thường có giá thành cao và chưa mang tính bền vững. Sử dụng phương pháp sinh học thông qua các nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng phân hủy 1,2-DCE trong tự nhiên là một giải pháp đang được chú ý trong thời gian gần đây [3, 10]. Các nghiên cứu của Govender & Pillay (2011) [4], Olaniran et al. (2004) [6], Song et al. (2003) [7] đều chỉ ra rằng trong tự nhiên tồn tài nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân hủy 1,2-DCE như Bacillus subtilis, Comamonas testosterone, Pseudomonas plecoglossicida và Burkholderia sp.. Một số loài vi khuẩn như Pseudomonas pavonacae, Xantobacter autotrophicus GJ10, Ancylobacter aquaticus có khả năng sử dụng 1,2-DCE như là nguồn cacbon duy nhất trong quá trình sinh trưởng và trong chúng mang các gen mã hóa cho các enzyme phân giải 1,2-DCE [8]. Tại Việt Nam, các nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng chuyển hóa hợp chất chứa clo cũng như phân giải 1,2- DCE còn chưa nhiều. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày các kết quả về phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy 1,2- DCE tại Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các mẫu đất và nước được thu thập từ các địa điểm: làng hoa Tây Tựu, Từ Liêm và điểm tập trung rác thải tại khu vực Cầu Diễn, Từ Liêm, Hà Nội. Chất1,2 Dichloroethane được mua của hãng Prolabo, Hoa Kỳ. Các hóa chất khác đều đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu. Phương pháp Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật Môi trường khoáng cơ bản (MGB) được chuẩn bị theo Hunkeler et al. (2005) [5] gồm K2HPO4.3H2O: 42,5 g; NaH2PO4.2H2O: 10 g và Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy 89 (NH4)2SO4: 20 g; nước cất 1 lít. Thành phần các nguyên tố vi lượng được chuẩn bị ở nồng độ gấp 10 lần (10X) bổ sung vào MGB bao gồm MgSO4.7H2O: 2 g; FeSO4.7H2O: 120 mg; MnSO4.4H2O: 3 mg; ZnSO4.H2O:18 mg; CoCl2.6H2O: 10 mg và nước cất 1 lít. Các chủng vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp làm giàu: mẫu thu thập được đưa vào môi trường MGB có bổ sung các nguyên tố vi lượng và 1,2-DCE nồng độ 5 mM và nuôi cấy lắc trong 5 ngày, tốc độ lắc 160 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC theo Govender & Pillay (2011) [4]. Cấy chuyển 1 ml dung dịch nuôi cấy sang môi trường mới và tiếp tục nuôi trong 5 ngày. Pha loãng dịch nuôi và cấy trải trên môi trường MGB thạch có bổ sung 1,2-DCE. Lựa chọn các khuẩn lạc phát triển tốt sau 24 giờ cho các nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp đo vòng sinh trưởng trên môi trường MGB thạch được sử dụng kết hợp với khả năng phát triển và tạo màu trên môi trường có bromothymol blue nhằm chọn lọc các chủng có khả năng phân giải tốt 1,2-DCE. Môi trường chọn lọc có bổ sung thạch và chất chỉ thị màu bromothymol blue nồng độ 20 g L-1 được dùng trong tuyển chọn và bán định lượng khả năng phân hủy 1,2-DCE. Sự sinh trưởng của vi khuẩn được đánh giá qua mật độ quang học OD 620 nm (Bionate, Anh). Hình thái và các đặc điểm sinh hóa của các chủng phân hủy 1, 2 DCE Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để nhận biết ban đầu về hình thái và phân loại các chủng vi khuẩn. Sử dụng kit API (bioMérieux, Pháp) để xác định các đặc điểm hóa sinh. Trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn phân lập được đọc trực tiếp trên máy giải trình tự được thực hiện tại công ty Macrogen (Hàn quốc). Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự 16S rARN các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài. Chụp ảnh kính hiển vi điện tử được thực hiện tại Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội. Tối ưu các điều kiện môi trường sự phát triển của vi khuẩn Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường MGB bổ sung thêm cao nấm men 0,1% ở các nhiệt độ 16oC, 23oC, 30oC và 37oC. Nồng độ cơ chất 1,2-DCE được thí nghiệm từ 5 đến 20 mM trong môi trường. Đánh giá khả năng phát triển sau thời gian 48 giờ. Khả năng phân hủy hợp chất clo (1,2-DCE) Khả năng phân hủy hợp chất 1,2-DCE được xác định gián tiếp thông qua hàm lượng Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Vi sinh vật sử dụng cơ chất 1,2-DCE, chúng cắt đứt liên kết giữa Cacbon và Clo giải phóng Cl-. Xác định hàm lượng Cl- ngoại bào theo phương pháp của Bergmann & Sanik (1957) [1]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy 1,2-DCE Từ các mẫu đất và nước thu thập tại các khu vực khác nhau sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5 ngày/lần) trên môi trường khoáng bổ sung 1,2- DCE chúng tôi đã phân lập được 45 loại khuẩn lạc khác nhau ký hiệu từ R1 đến R15 và từ S1 đến S30. Các chủng phân lập đều có hình thái khuẩn lạc dạng tròn hoặc dẹt, màu sắc chủ yếu là màu trắng đục hoặc trong, một số có hình dạnh bông. Trong số 45 chủng phân lập các chủng ký hiệu R7, R9, R15 và S15 có khả năng phát triển tốt nhất. Tiếp tục tuyển chọn trên môi trường MGB thạch bổ sung bromothymol blue, các chủng R9 và S15 chứng tỏ khả năng phát triển tốt trên môi trường có 1,2-DCE là nguồn cacbon duy nhất thông qua việc phân giải mạnh cơ chất 1,2-DCE khi làm thay đổi pH môi trường, biến màu xanh ban đầu thành màu vàng mạnh hơn so với hai chủng còn lại (hình 1). Chúng tôi lựa chọn hai chủng S9, R15 cho các nghiên cứu tiếp theo về các đặc điểm sinh học, phân loại cũng như khả năng phân giải 1,2- DCE. Hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập Các đặc điểm về hình thái và sinh lý sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại vi sinh vật. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy tế bào chủng R9 được nhận diện là Gram (+), có hình que ngắn trong khi tế bào chủng S15 có hình que dài mang các đặc tính của vi khuẩn Gram (-) (hình 2). TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93 90 Hình 1. Sự phân giải 1,2-DCE trên MGB thạch có bổ sung Bromothymol Blue của một số chủng phân lập Hình 2. Hình thái tế bào các chủng nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử (×5000) Các đặc điểm về sinh lý sinh hóa của hai chủng R9 và S15 được trình bày trong bảng 1. Kết quả cho thấy, hai chủng vi khuẩn này có hoạt tính của các enzyme thủy phân phân giải các chất như cellulose, gelatin. Cả hai chủng đều có khả năng sử đa dạng nhiều nguồn cacbon khác nhau từ glucose đến maltose hoặc N-acetyl-glucosamine. Chủng S15 có phản ứng thủy phân Arginine dương tính cho thấy khả năng cao chủng này thuộc chi Pseudomonas. Thử nghiệm khả năng phân hủy các hợp chất halogen khác với sự phát triển mạnh trên môi trường MGB có bổ sung các hợp chất 2,2-Dichloropropionate, 3,4-Dichloroaniline cho thấy cả R9 và S15 đều có có khả năng sinh trưởng phát triển điều này cho thấy khả năng đa dạng sử dụng các hợp chất có chứa clo của hai chủng phân lập. Kết quả giải trình tự gen 16S ARNr của hai chủng cho thấy, trình tự 16S ARNr của chủng S15 có kích thước khoảng 1492bp và có độ tương đồng 99% với chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes trong khi trình tự đoạn gen mã hóa 16S ARNr của chủng R9 có kích thước khoảng 1499bp và tương ứng 99% với trình tự gen 16S ARNr loài Klebsiella pneumoniae đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới. Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy 91 Bảng 1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng nghiên cứu theo Kit API 20 Một số đặc điểm sinh học Chủng S9 Chủng S15 Hoạt tính protease + + Hoạt tính catalase + + Hoạt tính cellulase + + Khả năng chuyển hóa nitrate  nitrite + + Tryptophane - - Lên men (Glucose) - - Thủy phân Aginine - + Hoạt tính Urease - - Thủy phân Esculin (β-glucosidase) + + Thủy phân Gelatine + + β-galactosidase - - Khả năng sử dụng cơ chất Glucose + + Arabinose + + Mannose + + Manitol + + N-acetyl-glucosamine + + Maltose + + Gluconate + + Caprate - - Adipate + - Malate + + Citrate + + Phenyl-acetate - - Khả năng sử dụng một số cơ chất có chứa clo 2, 2-Dichloropropionate + + 3, 4- Dichloroaniline + - (+). Có phát triển; (-). Không phát triển. Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ (a) và nồng độ 1,2-DCE lên sự phát triển (b) của hai chủng phân lập Ảnh hưởng nhiệt độ và nồng độ cơ lên sự phát triển của các chủng phân lập Nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển của các chủng phân hủy 1,2-DCE cũng như việc ứng dụng phương pháp sinh học trong xử lý ô nhiễm 1,2-DCE do ô nhiễm cơ chất này ở sâu TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 88-93 92 dưới các mạch nước ngầm hay dưới đáy sông hồ, nơi có nhiệt độ thấp, còn khi ở nhiệt độ cao, cơ chất này bay hơi rất độc [3]. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ với hai chủng phân lập trong thời gian 48 giờ, kết quả cho thấy, chủng R9 phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 23 đến 30oC trong khi nhiệt độ phát triển của chủng S15 là từ 30 đến 37oC (hình 3a). Đây cũng là khoảng nhiệt độ phù hợp với điều kiện phân lập hai chủng. Nồng độ cơ chất trong môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của các chủng nghiên cứu, nồng độ quá cao hay quá thấp đều có thể làm chậm hay gây ức chế quá trình sinh trưởng của loài, Trong các nồng độ thí nghiệm cho thấy cả hai chủng đều có thể phát triển trong môi trường bổ sung 1,2-DCE với nồng độ từ 5 đến 20 mM. Sau thời gian nuôi cấy 48 giờ, trong khi chủng R9 phát triển tốt nhất ở nồng 5 mM, thì nồng độ 10 mM cho thấy sự sinh trưởng tốt của chủng S15 (hình 3b). KẾT LUẬN Từ các mẫu đất và nước đã phân lập tuyển chọn được hai chủng R9, S15 trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE là nguồn cacbon duy nhất. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải trình tự gen 16S ARNr cho thấy, chủng R9 thuộc chi Klebsiella, chủng S15 thuộc chi Pseudomonas với độ tương đồng 99%. Chủng R9 phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 23 đến 30°C, còn chủng S15 từ 30-37°C. Nồng độ cơ chất 1,2-DCE tối ưu cho hai chủng R9, S15 sinh trưởng là 5 mM. Lời cảm ơn: Đề tài được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài KLEPT 12-01 thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, ĐHQG Hà Nội tài trợ. Đề tài có sử dụng các trang thiết bị tại Phòng Enzym học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bergmann J. G., Sanik J., 1957. Determination of trace amount of chlorine in naphtha, Analytical Chemistry, 29(2): 241-243. 2. Doucette W. J., Hall A. J., Gorder K. A., 2010. Emissions of 1, 2-Dichloroethane from holiday decorations as a source of indoor air contamination. Ground Water Monitoring & Remediation, 30(1): 67-73. 3. Fetzner S., Lingens F., 1994. Bacterial dehalogenases: biochemistry, genetics and biotechnological applications. Microbiological Reviews, 58: 641- 658. 4. Govender A., Pillay B., 2011. Characterization of 1, 2-dichloroethane (DCA) degrading bacteria isolated from South African waste water. African Journal of Biotechnology, 10(55): 11567-11573. 5. Hunkeler D., Aravena R., Berry S. K., Cox E., 2005. Assessment of degradation pathways in an aquifer with mixed chlorinated hydrocarbon contamination using stable isotope analysis. Environmental Science & Technology, 39(16): 5975-81. 6. Olaniran A. O., Pillay D., Pillay B., 2004. Haloalkane and haloacid dehalogenases from aerobic bacterial isolates indigenous to contaminated sites in Africa demonstrate diverse substrate specificities. Chemosphere, 55: 27-33. 7. Song J. S., Lee D. H., Lee K., Kim C. K., 2003. Characteristics of several bacterial isolates capable of degrading chloroaliphatic compounds via hydrolytic dechlorination. The Journal of Microbiology, 41: 277- 283. 8. Van J. E. T., Tang L., Spelberg J. H., Smilda T., Poelarends G. J., Bosma T., Van Merode A. E. J., Janssen D. B., 2001. Halohydrin dehalogenases are structurally and mechanistically related to short-chain dehalogenases/reeducates. Journal of Bacteriology, 183: 5058-5066. 9. Wildeman S. D., Verstraete W., 2003. The quest for microbial reductive dechlorination of C2 to C4 chloroalkanes is warranted. Applied Microbiology and Biotechnology, 61(2): 94-102. Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy 93 10. Wong W. Y., Huyop F., 2012. Molecular identification and characterization of Dalapon-2, 2-dichloropropionate (2,2DCP)- degrading bacteria from a rubber estate agricultural area. African Journal of Microbiology Research, 6(7): 1520-1526. BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF BACTERIAL STRAINS DEGRADED 1,2-DICLOROETHANE ISOLATED IN VIETNAM Pham Thi Vui, Pham Thi Hoa, Pham Bao Yen, Nguyen Quang Huy VNU Hanoi University of Science SUMMARY The use of pesticides has become an integral part of modem agricultural techniques, but increased use of these chemicals might cause the environmental pollution with impact on bats ecosystem and human health. 1,2-dicholoroethane (1,2-DCE) is one toxic of the chemicals commonly used for plant protection that may cause the cancer and environment pollution. In nature, microorganisms are regarded as active factor in transformation cycle of chemical elements and balance environment. Adaptation of indigenous soil microbial populations occurs as a result of contact with xenobiotics. From the soil and water samples collected in the area that use plant protection products in Hanoi, 45 strains were isolated in culture added 1,2-DCE as carbon source. Two bacterial strains R9 and S15 are more active than others. Based on morphological, biological characteristics and sequences of 16S rDNA, the two isolated strains were classified of Pseudomonas and Klebsiella. The R9 and S15 strains are similar to Pseudomonas and Klebsiella at 99.9% and 99.5% respectively. Both strains R9 and S15 were well grown at 23°C-37oC and a concentration of 1.2 DCE from 15 to 20 mM. Keywords: Contamination, 1,2-dicholoroethane, decomposition, environment pollution, isolation. Ngày nhận bài: 30-5-2013