Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] bằng kỹ thuật RAPD

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 116 NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU XANH [Vigna radiata (L.) Wilczek] BẰNG KỸ THUẬT RAPD Chu Hoàng Mậu1*, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2, Hoàng Thị Thao2, Đỗ Tiến Phát3 1 Đại học Thái Nguyên, 2Trường Đại học Khoa học , 3Viện Công nghệ sinh học TÓM TẮT Sử dụng chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - đa hình các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên) với 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích sự đa dạng di truyền của 30 giống đậu xanh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 10 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Tổng số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản là 105 phân đoạn. Khoảng cách di truyền và biểu đồ hình cây đƣợc thiết lập nhờ phƣơng pháp UPGMA, kết quả cho thấy 30 giống đậu xanh đƣợc chia thành 2 nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền là 67% ; nhóm I bao gồm 2 giống là: T6 và T9, nhóm II gồm 28 giống còn lại là: T1, T2, T3, T4, T5, T7, T8, T10, T11, T12, T13, T14, T15, T16, T17, T18, T19, T20, T21, T22, T23, T24, T25, T26, T27, T28, T29, T30. Từ khóa: Đa hình, đậu xanh, quan hệ di truyền, RAPD, Vigna radiata MỞ ĐẦU Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt. Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nƣớc, trong đó có Việt Nam. Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh dƣỡng của con ngƣời và vật nuôi mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dƣỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [9], [10]. Vấn đề đặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống đậu xanh có chất lƣợng tốt, phục vụ nhu cầu trong nƣớc cũng nhƣ xuất khẩu. Hiện nay, việc nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và đậu xanh nói riêng nhờ chỉ thị phân tử đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học đã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ RAPD, AFLP, RFLP, SSRCác kỹ thuật này không những phát huy hiệu quả mà còn khắc phục nhƣợc điểm của các phƣơng pháp truyền thống bởi hiệu quả sàng lọc cao, nhanh và tin cậy. Trong các kỹ thuật kể trên thì RAPD là kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi, bởi đây là phƣơng pháp dễ thực hiện và ít tốn kém mà vẫn đánh giá đƣợc sự đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử. Trên thế giới, kỹ thuật  Tel: (84) 913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn RAPD đã đƣợc nhiều tác giả sử dụng để nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh nhƣ: Năm 2006, Karuppanapandian T. và cs đã xác định quan hệ di truyền của các giống đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) đƣợc lựa chọn từ những vùng khác nhau ở Nam Tamil Nadu (Ấn Độ) bằng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên [8]. Afzal và cs nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn giống đậu xanh nhờ kỹ thuật RAPD. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 21 giống đậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên kết quả thu đƣợc tổng số 204 phân đoạn DNA đƣợc nhân bản, trong đó có 75% phân đoạn thể hiện tính đa hình. Sự tƣơng đồng di truyền nhận đƣợc trong nghiên cứu này có thể đƣợc sử dụng để chọn dòng bố mẹ phục vụ mục đích chọn giống [1]. Betal và cs (2004) đã sử dụng 14 giống đậu xanh cùng 14 mồi ngẫu nhiên để phân tích mối quan hệ di truyền nhờ kỹ thuật RAPD. Kết quả cho thấy các giống có năng suất cao có liên quan chặt chẽ với tính trạng mùi thơm của hạt. Kết quả nghiên cứu của tác giả cũng chỉ ra rằng tính trạng năng suất có mối liên quan với đặc điểm hình thái nhƣ chiều cao cây, kích cỡ và màu sắc hạt [2],. Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng đã đƣợc các tác giả Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Điêu Thị Mai Hoa sử dụng để xác định quan hệ di truyền của các giống đậu xanh đột biến, các giống đậu xanh chịu hạn, các giống đậu xanh chín tập Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 117 trung và không tập trung [3], [5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả đánh giá mối quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] địa phƣơng bằng kỹ thuật RAPD nhằm tạo cơ sở cho việc tuyển chọn các giống đậu xanh có chất lƣợng tốt, năng suất cao và ổn định góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen cây đậu xanh. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Chúng tôi sử dụng hạt của 30 giống đậu xanh khác nhau, trong đó 10 giống do Viện ngô cung cấp và 20 giống thu thập đƣợc từ các địa phƣơng. Nguồn gốc của các giống đậu xanh đƣợc trình bày ở Bảng 1. Phương pháp - Tách chiết và làm sạch ADN tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và CS [7]. Kiểm tra chất lƣợng ADN thu đƣợc thông qua điện di trên gel agarose 0,8%. Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl. - Phản ứng RAPD đƣợc tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phƣơng pháp của Foolad và cs (1990) [6]. Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện trong 25µl dung dịch chứa 2µl đệm PCR + 2µl MgCl2 (2,5mM) + 1,2 µl dNTPs (2,5mM) + 1,6 µl mồi (10mM) + 0,4 µl Taq polymerase (5U) + 0,8 µl DNA khuôn (10ng/ µl) +17 µl H2O và đƣợc tiến hành trong máy PCR System 9700. Sản phẩm RAPD đƣợc điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh. - Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên cho phản ứng RAPD, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng đƣợc trình bày trong Bảng 2. - Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, thống kê các băng xuất hiện và không xuất hiện. Phân tích số liệu RAPD trên máy vi tính bằng phần mềm NTSYSpc Version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998). Bảng 1. Nguồn gốc các giống đậu xanh nghiên cứu TT Tên giống Nguồn gốc TT Tên giống Nguồn gốc 1 T1 Bắc Sơn - Lạng Sơn 16 T16 Kim Động - Hƣng Yên 2 T2 Mai Châu - Hoà Bình 17 T17 Yên Phong - Bắc Ninh 3 T3 Bát Xát - Lào Cai 18 T18 Đình Bảng - Bắc Ninh 4 T4 Mộc Châu - Sơn La 19 T19 Nam Sách - Hải Dƣơng 5 T5 Bảo Lạc - Cao Bằng 20 T20 Yên Thế - Bắc Giang 6 T6 Xuất Hoá - Bắc Kạn 21 T21 Việt Yên - Bắc Giang 7 T7 Đồng Hỷ - Thái Nguyên 22 T22 044/DX06 - Viện NC Ngô 8 T8 Phú Lƣơng - Thái Nguyên 23 T23 Từ Liêm - Hà Nội 9 T9 Hàm Yên - Tuyên Quang 24 T24 Long Biên - Hà Nội 10 T10 Sơn Dƣơng - Tuyên Quang 25 T25 VN99-3 - Viện NC Ngô 11 T11 Bắc Quang - Hà Giang 26 T26 DXVN4 - Viện NC Ngô 12 T12 Hoàng Su Phì - Hà Giang 27 T27 DXVN5 - Viện NC Ngô 13 T13 Thanh Thuỷ - Phú Thọ 28 T28 VN93-1 - Viện NC Ngô 14 T14 Yên Bình - Yên Bái 29 T29 Vĩnh Bảo - Hải Phòng 15 T15 Kim Bảng - Hà Nam 30 T30 Yên Lạc - Vĩnh Phúc Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 118 Bảng 2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi OPP08 5’ACATCGCCCA3’ RA159 5’AACCGACGGG3’ OPV06 5’ACGCCCACGT3’ RA50 5’GCTGTGCCAG3’ OPD13 5’GGGGTGACGA3’ RA32 5’GTGAGGCGTC3’ OPB10 5’CTGCTGGGAC3’ OPA15 5’GACACAGCCC3’ RA142 5’CAATCGCCGT3’ RA40 5’GGCGGACTGT3’ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân tích đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD Tách DNA tổng số từ lá non của đậu xanh sau đó đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lƣợng thông qua điện di trên gel agarose 0,8% và đo phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260nm, 280nm trên máy quang phổ, kết quả cho thấy DNA tổng số đƣợc tách từ các mẫu lá các giống đậu xanh có hàm lƣợng dao động 82,5 - 3010 µg/ml, băng vạch DNA gọn, không đứt gãy và tƣơng đối sạch, tỷ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,8 - 2. Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 10ng/µl, và tiến hành phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên ở trên. Kết quả cho thấy, tổng số các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với 10 mồi là 105 phân đoạn, trong đó có 94 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 89,52%) và không đa hình là 11 phân đoạn (chiếm 10,48%). Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản trong khoảng từ 200- 2750 bp. Số lƣợng các phân đoạn tƣơng ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 4- 16, trong đó mồi RA40 nhân bản đƣợc ít nhất (4 phân đoạn), còn mồi OPV06 nhân bản đƣợc nhiều nhất (16 phân đoạn). Trong số 10 mồi nghiên cứu thì đều cho kết quả đa hình, mức độ đa hình của 10 mồi dao động từ 14,28 – 100%, trong đó có 7 mồi cho tính đa hình cao nhất 100% là: OPP08, OPV06, OPD13, OPB10, RA142, RA159, RA32. Mồi OPA15 cho tính đa hình thấp nhất. Kết quả thể hiện ở Bảng 3. Giá trị PIC đƣợc sử dụng khi phân tích thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lƣợng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Trong đó, fi là tần số của alen thứ i Số liệu Bảng 4 phù hợp với tỷ lệ đa hình các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản ở bảng 3. Giá trị PIC của mồi OPA15 là thấp nhất 0,07 (tính đa hình thấp nhất). Giá trị PIC của 2 mồi OPV06 và RA159 là 0,85 (đa hình cao nhất). Hầu hết các mồi đều cho tính đa hình cao (PIC > 0,5), chỉ có 2 mồi OPA15 và RA40 cho tính đa hình thấp (PIC < 0,5) điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các mẫu đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều cao. Nhƣ vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên đã chỉ ra đƣợc sự đa dạng di truyền của 30 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau. Mối quan hệ di truyền của các giống đậu xanh nghiên cứu Từ kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi thống kê các băng điện di (xuất hiện=1, không xuất hiện= 0) và xử lý số liệu phân tích RAPD bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0i nhằm xác định khoảng cách di truyền giữa các mẫu đậu tƣơng nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Để xác định quan hệ di truyền, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tƣơng quan kiểu hình theo ba phƣơng pháp tính hệ số di truyền giống nhau (phƣơng pháp của Jaccard, SM và Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 119 Dice) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 5). Bảng 3. Thống kê các phân đoạn DNA được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên Mồi Số phân đoạn DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) OPP08 14 14 0 100 OPV06 16 16 0 100 OPD13 7 7 0 100 OPB10 12 12 0 100 RA142 11 11 0 100 RA159 10 10 0 100 RA50 14 12 2 85,71 RA32 10 10 0 100 OPA15 7 1 6 14,28 RA40 4 1 3 25,00 Tổng 105 94 11 89,52 Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu T1 đến T20 với mồi RA142 Ghi chú: Kí hiệu M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20 Bảng 4. Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của 10 mồi ngẫu nhiên STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC 1 OPP08 0,7348 6 RA159 0,8546 2 OPV06 0,8528 7 RA50 0,8498 3 OPD13 0,7316 8 RA32 0,7453 1.0 0.75 0.5 0.25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 2.0 1.5 kb Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 120 4 OPB10 0,7501 9 OPA15 0,0729 5 RA142 0,6630 10 RA40 0,2275 Bảng 5. Giá trị tương quan kiểu hình (r) UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0.8794 0.8352 0.7439 0.8600 Dice 0.8741 0.8331 0.7737 0.8418 Jaccard 0.8733 0.8228 0.7549 0.8324 Hình 2. Biểu đồ hình cây của các giống đậu xanh nghiên cứu theo kiểu phân nhóm UPGMA Biểu đồ hình cây đƣợc thiết lập dựa trên giá trị tƣơng quan cao nhất; Khi r  0,9: tƣơng quan rất chặt, 0,8≤r < 0,9: tƣơng quan chặt, 0,7≤r < 0,8: tƣơng quan tƣơng đối chặt, r < 0,7: tƣơng quan không chặt. Kết quả bảng 5 cho thấy, giá trị tƣơng quan kiểu hình (r) của 30 mẫu đậu xanh nghiên cứu đều cao, trong phạm vi tƣơng quan chặt. Cụ thể giá trị (r) dao động từ 0,7439 – 0,8794. Giá trị tƣơng quan kiểu hình (r) lớn nhất là 0,8794 khi tính theo hệ số di truyền SM và kiểu phân nhóm UPGMA. Biểu đồ hình cây thể hiện quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh đƣợc lập dựa trên giá trị tƣơng quan kiểu hình cao nhất (Hình 2). Kết quả phân tích cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền của 30 giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 0,58 – 0,93 . Trong đó, 2 giống có hệ số đồng dạng di truyền lớn nhất (0,93) là: T22 và T25, T27 và T29, 3 cặp giống có hệ số đồng dạng nhỏ nhất (0,58) là: T6 và T21, T6 và T24, T9 và T21 (0,58). Biểu đồ hình cây tạo đƣợc khi phân tích 30 giống đậu xanh với 10 mồi ngẫu nghiên chia làm 2 nhóm chính: Nhóm I: bao gồm hai giống T6 và T9 và sai khác với các giống thuộc nhóm II là 33%. Nhóm II bao gồm 28 giống còn lại và tiếp tục phân thành 2 nhóm phụ (PI và PII). KẾT LUẬN Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên đã nhân bản đƣợc 105 phân đoạn DNA, trong đó có 94 phân đoạn đa hình (chiếm 89,52%), trong số 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng tất cả 10 mồi biểu hiện tính đa hình. Phân tích đa dạng di truyền của 30 giống đậu xanh cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền của 30 giống đậu xanh dao động từ 0,58 – 0,93 và từ sơ đồ hình cây cho thấy 30 giống đậu xanh nghiên cứu đƣợc chia thành 2 nhóm chính: Nhóm I Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 121 bao gồm 2 giống T6 và T9. Nhóm II bao gồm 28 giống còn lại. Hai nhóm đậu xanh có sự sai khác di truyền là 33% (tức tỷ lệ tƣơng đồng di truyền là 67%). LỜI CẢM ƠN: Công trình được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài dự án TRIG. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Afzal M.A., Muynul Haque M., and Shanmugasundaram S, “Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analysys of selected mung bean (Vigna radiata L. Wilczek) cultivars”, Asian Journal of Sciences, 2004, 3(1), pp.20-24. [2]. Betal S., Roy C.P., Kundu S., Sen R.S, “Estimation of geneetic variability of Vigna radiata cultivars by RAPD analysis”, Biologia plantrum, 2004, 48(2):205-209. [3]. Chu Hoàng Mậu, Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 2001. [10]. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5 [4]. Đƣờng Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, Nxb Lao động - Xã hội, tr: 5-31. [5]. Điêu Thị Mai Hoa, Nghiên cứu một số đặc điểm nông học, sinh lý và sinh học phân tử liên quan đến tính trạng chín tập trung của đậu xanh. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2006, tr. 51-63. [6].Foolad, Arusekar, Rodriguer (1995), applicationof polymerase Chain Reation (PCR) to plant genome analyis. In: Tissue and organ culture, Fundamenatal mathods Springer Verlag, Berlin, heidelerg, pp. 282 – 289. [7]. Gawel, Jarret (1991). Genomic DNA isolation. www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/htm/dna.htm. [8]. Karuppanapandian T., Karuppudurai T., Sinha P. B., Kamarul Haniya A, Ma noharan K, “Genetic diversity in green gram (Vigna radiata L.) landraces analyzed by using random amplified polymorphic DNA (RAPD)”, African Jounal of Biotechnology, 2006, pp. 1214-1219 [9]. Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1998), Cây đậu xanh, Nxb Nông Nghiệp SUMMARY RESEARCH ON GENETIC RELATIONSHIP OF SOME MUNGBEAN CULTIVALS (Vigna radiata (L.) Wilczek) BY RAPD TECHNIQUE Chu Hoang Mau 1 , Nguyen Vu Thanh Thanh 2 , Hoang Thi Thao 2 , Do Tien Phat 3 1 Thai Nguyen University, 2 College of Science - TNU, 3 Institute of Biotechnology Using RADP (Random Amplified Polymorphic DNA) indicator with 10 random primers to analyse the genetic variety of 30 mungbean cultivals [Vigna radiata (L.) Wilczek]. The reseaching results showed that all 10 primers are polymorphic. DNA total fragments copied when analysed 10 random primers are 105 bands. Genetic distance and tree graph established by UPGMA method, the results showed that 30 mungbean cultivals are divided two groups that genetical homologous ratio are 67%, the first group includes 2 cultivals: T6 and T9, the second group includes 28 remain cultivals: T1, T2, T3, T4, T5, T7, T8, T10, T11, T12, T13, T14, T15, T16, T17, T18, T19, T20, T21, T22, T23, T24, T25, T26, T27, T28, T29, T30. Keywords: Genetic relationship, Mungbean, Polymorphic, RAPD, Vigna radiata . Chu Hoàng Mậu và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 72(10): 116 - 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 122