Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và một số chỉ tiêu hóa sinh của dịch chiết lá cây thuốc bỏng (Kalanchoe pinnata (LAM.) Pers) - Nguyễn Thị Thu Thủy

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học Huế Tập 3, Số 1 (2015) 117 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY THUỐC BỎNG (Kalanchoe pinnata (LAM.) PERS) Nguyễn Thị Thu Thủy Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế Email: thuthuy.dhkh@yahoo.com TÓM TẮT Cây thuốc bỏng (Kalanchoe pinnata (Lam). Pers) hay còn gọi là cây sống đời trong dân gian thường dùng làm thuốc giải độc, chữa bỏng, đắp vết thương và cầm máu. Ngoài ra, còn được dùng chữa viêm loét dạ dày, một số bệnh đường ruột và bệnh nhiễm trùng khác. Để làm sáng tỏ công dụng của loại dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn với 5 loại vi khuẩn kiểm định (E. coli, B. pumilus, S. aureus, Vibrio parahaemoliticus (HU3) và Vibrio sp. (HH1). Kết quả thực nghiệm cho thấy: trong 3 loại dung môi (nước, nước muối sinh lý và cồn đốt) dùng để chiết rút thì dịch chiết lá thuốc bỏng bằng cồn đốt cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với hiệu số vòng vô khuẩn của HU3 ở tỉ lệ 4:1 là 27.33 mm, nhưng khi chiết bằng nước không thấy xuất hiện vòng vô khuẩn với E. coli, B. pumilus và HH1 ở tỉ lệ 2:1. Dịch chiết cao toàn phần của lá cây thuốc bỏng bằng dung môi cồn cho khả năng kháng khuẩn mạnh đối với cả 5 loại vi sinh vật kiểm định. Với dịch chiết flavonoid từ lá thuốc bỏng có hiệu số vòng vô khuẩn rất cao, dao động từ 23,66 - 35,16 mm ở tỉ lệ 1/50. Phân tích một số thành phần hóa sinh của lá cây thuốc bỏng cho hàm lượng vitamin C vào buổi và buổi chiều lần lượt là 0,088% và 0,077%; hàm lượng đường khử là 0,23%; flavonoid tổng số là 7,23%. Từ khóa: Flavonoid tổng số, khả năng kháng khuẩn, thuốc bỏng, vi sinh vật kiểm định. MỞ ĐẦU Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người. Một số hợp chất tự nhiên được ch chiết từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp. Mặt khác việc dùng thuốc nam hầu như không gây ra tác dụng phụ [5]. Trong số đó có cây thuốc bỏng. Lá cây thuốc bỏng có nhiều tác dụng trong điều trị một số bệnh như: giải độc, chữa bỏng, viêm loét dạ dày, viêm ruột, trĩ nội, đi ngoài ra máu, một số bệnh đường ruột và bệnh nhiễm trùng khác [6]. Bên cạnh các công trình nghiên cứu về các hợp chất chiết từ các đối tượng thực vật thì một trong những hướng quan trọng trong việc nghiên cứu cây thuốc là xem khả năng kháng khuẩn của dịch chiết khi chiết bằng các phương pháp và dung môi khác nhau, nhằm sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu vốn sẵn có trong tự nhiên. Đó cũng là lý do để chúng tôi chọn nghiên cứu này. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và một số chỉ tiêu hóa sinh của dịch chiết lá cây thuốc bỏng 118 I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Nguyên liệu - Cây Thuốc bỏng mọc tự nhiên được thu hái trên địa bàn thành phố Huế. Tên khoa học: Kalanchoe pinnata (Lam). Pers Thuộc họ Thuốc bỏng: Crasulaceae. - Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: vi khuẩn Gram dương: Bacillus pumilus và Staphylococcus aureus ; vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli ; Vibrio parahaemaliticus (HH1) và Vibrio sp. (HU3). Được cung cấp từ khoa Chống nhiễm khuẩn Bệnh viện Trung Ương Huế. Hình1. Cây thuốc bỏng (Kalanchoe pinnata (Lam). Pers) 1.2. Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp thu dịch chiết từ lá cây thuốc bỏng [3] - Thu dịch chiết lá cây thuốc bỏng bằng nước: 100 g lá tươi được nghiền kĩ bằng máy với 100 ml nước, lọc qua phểu lọc chân không lấy phần dịch (làm tương tự với các dung môi khác). - Thu dịch chiết cao toàn phần lá cây thuốc bỏng bằng cồn: 100 g lá tươi được nghiền kĩ bằng máy với 100 ml cồn, cho dịch nghiền vào cốc đong 500 ml, thêm vào 200 ml cồn và khuấy kĩ, lọc, đem dịch lọc cô cạn cách thủy ở nhiệt độ 40 - 60oC cho đến khi thu được dạng cao sệt. * Xác định hoạt tính kháng khuẩn [1, 2] - Nuôi cấy các chủng vi sinh vật kiểm định trên môi trường thạch - thịt - peptone. - Môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn: sử dụng môi trường có thành phần như trên, phân vào bình tam giác khử trùng ở 1 atm trong 30 phút, để nguội đến 40oC, cho riêng từng loại vi sinh vật kiểm định vào từng bình, lắc cho vi khuẩn phân bố đều, rồi rót vào đĩa petri Đợi thạch nguội, dùng khoan (Φ:2 mm) khoan bỏ các thỏi thạch. Nhỏ dịch chiết lá thuốc bỏng vào lỗ khoan trên môi trường cấy sẵn vi sinh vật kiểm định. Cho các đĩa này vào tủ lạnh 2- 4oC từ 10 - 12 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 28 - 30oC trong 18 - 20 giờ. Quan sát và đo vòng vô khuẩn xung quanh lỗ khoan. Tùy theo kích thước vòng vô khuẩn to nhỏ khác nhau để biết được khả năng kháng khuẩn của dịch chiết. * Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand [7] * Định lượng vitamin C bằng phương pháp sử dụng Iodine [7] * Định lượng flavonoid tổng số theo quy trình B.C.Tali [4] TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học Huế Tập 3, Số 1 (2015) 119 Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với phần mềm Microsoft-Excel 2003. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây thuốc bỏng Sau khi chiết lá cây thuốc bỏng bằng nước và các dung môi khác nhau ta thu được dịch chiết tương ứng với từng loại dung môi. Thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết với các vi khuẩn kiểm định trên môi trường thạch - thịt - peptone, bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lá cây thuốc bỏng bằng các dung môi khác nhau Tỷ lệ mẫu lá : nước (g/ml) Vi sinh vật kiểm định Hiệu số vòng vô khuẩn (mm) Nước NaCl 0,9% Cồn 2 :1 B. pumilus 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 16,16 ± 0,28 S. aureus 3,33 ± 0,57 5,50 ± 0,50 20,66 ± 0,57 E. coli 0,00 ± 0,00 7,33 ± 0,57 18,33 ± 0,28 HU3 12,25 ± 0,57 21,33 ± 0,57 23,83 ± 0,28 HH1 0,00 ± 0,00 3,33 ± 0,28 19,00 ± 0,50 3:1 B. pumilus 5,33 ± 0,28 4,00 ± 0,00 20,16 ± 0,28 S. aureus 7,33 ± 0,57 7,16 ± 0,28 20,16 ± 0,28 E. coli 0,00 ± 0,00 11,66 ± 0,57 21,33 ± 0,57 HU3 23,50 ± 0,50 21,83 ± 0,28 25,33 ± 0,57 HH1 0,00 ± 0,00 5,16 ± 0,28 23,50 ± 0,50 4:1 B. pumilus 13,00 ± 0,00 11,83 ± 0,28 21,33 ± 0,57 S. aureus 12,16 ± 0,28 11,83 ± 0,57 21,16 ± 0,28 E. coli 3,50 ± 0,50 14,33 ± 0,28 23,50 ± 0,50 HU3 26,33 ± 0,57 23,33 ± 0,57 27,33 ± 0,57 HH1 3,33 ± 0,57 11,50 ± 0,50 23,00 ± 0,00 Hình 2. Vòng vô khuẩn của dịch chiết lá thuốc bỏng bằng nước đối với S. aureus Hình 3. Vòng vô khuẩn của dịch chiết lá thuốc bỏng bằng NaCl 0,9% đối với E. coli Qua kết quả trên cho thấy: dịch chiết của lá thuốc bỏng khi chiết bằng nước cất cho khả năng kháng khuẩn tương đối thấp. Ở tỉ lệ 2:1 chỉ xuất hiện vòng vô khuẩn đối với S. aureus Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và một số chỉ tiêu hóa sinh của dịch chiết lá cây thuốc bỏng 120 (3,33 mm) và HU3 là 12,25 mm, còn B. pumilus, E. coli và HH1 không xuất hiện vòng vô khuẩn. Nhưng khi chiết lá thuốc bỏng bằng dung dịch muối sinh lý đã cho khả năng kháng khuẩn mạnh hơn so với dung môi nước. Hiệu số vòng vô khuẩn tăng dần từ tỉ lệ 2:1 đến tỉ lệ 4:1 và cho khả năng kháng mạnh nhất đối với HU3 với hiệu số vòng vô khuẩn ở tỉ lệ 4:1 là 23,33 mm. Đối với dung môi cồn đốt thì chiết dịch lá thuốc bỏng cho khả năng ức chế rất mạnh đối với cả hai loại vi khuẩn G+ và G-, hiệu số vòng vô khuẩn từ 16,16 - 27,33 mm, trong đó khả năng kháng mạnh nhất là đối với HU3 với hiệu số vòng vô khuẩn là 27,33 mm ở tỉ lệ 4:1. Hình 4. Vòng vô khuẩn của chiết dịch lá thuốc bỏng bằng cồn đối với HH1 ; S. aureus và E. coli Kết quả trên cho thấy: khi chiết lá thuốc bỏng bằng dung môi cồn đốt và nước muối sinh lý ở tỉ lệ 2:1, 3:1, 4:1 đều cho khả năng kháng khuẩn với cả 5 vi sinh vật kiểm định, còn riêng với dung môi nước thì vòng vô khuẩn chỉ xuất hiện trên cả 5 đối tượng vi sinh vật kiểm định ở tỉ lệ chiết cao hơn (4:1). Trong đó, hiệu số vòng vô khuẩn của dịch chiết bằng dung môi cồn là lớn nhất, tiếp theo đến NaCl 0,9% và dịch chiết với nước cho kết quả kháng khuẩn thấp. Mặc dù vòng vô khuẩn của dịch chiết lá thuốc bỏng đã xuất hiện đối với cả ba loại dung môi mà chúng tôi sử dụng, nhưng khi so sánh với kết quả nghiên cứu của Thái Thị Hồng trên đối tượng lá Trầu không thì kết quả của chúng tôi có thấp hơn. 2.2. Chiết cao toàn phần với dung môi cồn Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành chiết cao toàn phần lá cây thuốc bỏng với dung môi cồn. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cao toàn phần được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cao toàn phần lá thuốc bỏng Dịch chiết cao toàn phần lá thuốc bỏng (tỷ lệ cao:nước (g/ml)) Vi sinh vật kiểm định Hiệu số vòng vô khuẩn (mm) 1 : 10 B. pumilus 36,50 ± 0,50 S. aureus 23,16 ± 0,28 E. coli 38,33 ± 0,57 HU3 52,50 ± 0,50 HH1 40,50 ± 0,50 1 : 20 B. pumilus 28,50 ± 0,50 S. aureus 18,33 ± 0,57 E. coli 33,33 ± 0,57 HU3 43,50 ± 0,50 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học Huế Tập 3, Số 1 (2015) 121 HH1 34,00 ± 0,00 1 : 30 B. pumilus 23,33 ± 0,57 S. aureus 15,50 ± 0,32 E. coli 29,25 ± 0,27 HU3 40,00 ± 0,05 HH1 28,50 ± 0,25 Hình 5. Vòng vô khuẩn của cao toàn phần lá thuốc bỏng đối với HU3; E. coli và B. pumilus Từ kết quả ở bảng 2 cho thấy: khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cao toàn phần của lá cây thuốc bỏng là rất cao. Hiệu số vòng vô khuẩn từ 15,5 – 52,5 mm. Trong đó HU3 thể hiện vòng vô khuẩn to và rõ nhất với hiệu số vòng vô khuẩn là 52,5 mm lớn hơn so với lá Trầu không là 24 mm ở cùng tỷ lệ (1 g cao/10 ml nước). 2.3. Một số thành phần hóa sinh của lá cây thuốc bỏng + Hàm lượng vitamin C Vitamin C hoạt động như một chất chống oxy hóa trong môi trường nước của cơ thể cả nội bào lẫn ngoại bào. Vì vậy cùng với flavonoid, vitamin C cũng là một trong những chất có ý nghĩa quan trọng trong mọi hoạt động sống của cơ thể, làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể [9]. Kết quả xác định hàm lượng vitamin C, FT và đường khử của lá cây thuốc bỏng ở hai thời điểm sáng lúc 7 giờ và chiều lúc 4 giờ được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả định lượng vitamin C , FT và đường khử Chỉ tiêu Hàm lượng (%) Đường khử 0,24 ± 0,05 FT (flavonoid tổng) 7,23 ± 0,50 Vitamin C Sáng 0,088 ± 0,06 0,077 ± 0,05 Chiều Kết quả bảng 3 cho thấy: hàm lượng vitamin C của lá cây thuốc bỏng đạt được là 0,088% vào buổi sáng và 0,077% vào buổi chiều. Kết quả trên cho thấy hàm lượng vitamin C trong lá cây thuốc bỏng tương đối thấp và giảm dần theo thời gian trong ngày. Kết quả này thấp hơn nhiều so với các đối tượng thực vật khác như: Tim sen (0,263%), rau Ngót (0,250%), trái Sơ-ri (1,745%), lá Trầu không (0,924%) và tương đương với hàm lượng vitamin C có trong nấm Hoàng chi (0,089%) [9]. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và một số chỉ tiêu hóa sinh của dịch chiết lá cây thuốc bỏng 122 + Hàm lượng đường khử Kết quả bảng 3 cho thấy: hàm lượng đường khử của lá thuốc bỏng mà chúng tôi nghiên cứu là 0,24% tương đương với hàm lượng đường khử của lá Trầu không (0,23%) và thấp hơn nhiều so với các đối tượng khác như: lá rau Ngót (2,45%), Cà tím (4,2%), Tim sen (7,98%), Xương rồng bà không gai, Nha đam, Táo ta, Cam [6]. + Flavonoid Kết quả xác định hàm lượng flavonoid tổng số của lá thuốc bỏng là 7,23 % cao hơn so với một số đối tượng thực vật khác như: bắp Chuối sứ (2,95%), quả Dứa dại (4,36%), nhưng thấp hơn lá rau Ngót (11,68%), Tim sen (10,68%) [6], nấm Hoàng chi (7,38%) [9]. Thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid tổng số với các vi sinh vật kiểm định trong môi trường thạch - thịt - peptone bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được trình bày ở bảng 4. Bảng 4. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid tổng số Tỷ lệ FT : nước (g/ml) Vi sinh vật kiểm định Hiệu số vòng vô khuẩn (mm) 1 : 50 B. pumilus 31,16 ± 0,28 S. aureus 30,33 ± 0,57 E. coli 30,50 ± 0,50 HU3 35,16 ± 0,28 HH1 23,66 ± 0,57 1 : 100 B. pumilus 28,83 ± 0,76 S. aureus 29,33 ± 0,28 E. coli 27,16 ± 0,28 HU3 33,00 ± 0,00 HH1 23,33 ± 0,57 1 : 150 B. pumilus 22,50 ± 0,50 S. aureus 23,16 ± 0,28 E. coli 21,33 ± 0,57 HU3 26,66 ± 0,57 HH1 19,16 ± 0,28 a) b) c) Hình 6. Vòng vô khuẩn của chế phẩm flavonoid ở tỉ lệ 1:50 đối với a. S. aureus b. E. coli c. HU3 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học Huế Tập 3, Số 1 (2015) 123 Kết quả trên cho thấy: chế phẩm FT của lá cây thuốc bỏng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất cao đối với cả 5 loại vi sinh vật kiểm định. Trong đó, thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với vi khuẩn HU3 (35,16 mm), tiếp đến là B. pumilus (31,16 mm), E. coli và S. aureus là (30 mm), yếu nhất là HH1 với (23,66 mm) ở tỉ lệ 1/50 (g/ml). Tác dụng ức chế của chế phẩm FT chiết từ lá thuốc bỏng đối với các loại vi sinh vật kiểm định là rất mạnh, so với tác dụng của chế phẩm FT của lá Muồng trâu (E. coli: 21,75 mm; B. pumilus: 17,5 mm; S. aureus: 16,5 mm) [10], lá Trầu không là (E. coli : 27,5mm ; B.pumilus : 30,5 mm ; S. aureus : 30,5 mm) [4]. III. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Trong 3 loại dung môi đã dùng để chiết rút thì dịch chiết lá thuốc bỏng bằng cồn cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với hiệu số vòng vô khuẩn của HU3 ở tỉ lệ 4:1 là 27,33 mm, thấp nhất khi chiết bằng nước là không xuất hiện vòng kháng khuẩn với E. coli, B. pumilus và HH1 ở tỉ lệ 2:1. 2. Dịch chiết cao toàn phần của lá cây thuốc bỏng bằng dung môi cồn cho khả năng kháng khuẩn rất cao đối với cả 5 loại vi sinh vật kiểm định. Hiệu số vòng vô khuẩn lớn nhất là 52,5 mm đối với HU3, 38,33 mm đối với E. coli ở tỉ lệ 1/10 và 40 mm đối với HU3 ở tỉ lệ 1/30. 3. Thành phần hóa sinh của lá cây thuốc bỏng: - Hàm lượng vitamin C: sáng 0,088% ; chiều 0,077% - Hàm lượng đường khử: 0,24% - Hàm lượng FT: 7,23% 4. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ lá thuốc bỏng có hiệu số vòng vô khuẩn rất cao, dao động 23,66 mm - 35,16 mm ở tỉ lệ 1/50. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Thanh Bảo (2003) Vi khuẩn học, Đại học Y Dược TpHCM. [2]. Nguyễn Văn Cách (2004). Công nghệ lên men các chất kháng sinh. Nxb KH & KT. Hà Nội. [3]. Nguyễn Khắc Quỳnh Chi, Nguyễn Tuấn Dũng (1997). Chiết xuất dược liệu, Đại học Y Dược Tp HCM. [4]. Nguyễn Quốc Khang, Bá Thị Châm (2002). Một vài hoạt tính sinh học của thành phần polyphenol và flavonoid cây mướp đắng. Tạp chí Dược học 3: 13-16. [5]. Đỗ Tất Lợi (1991) Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. KH & KT, Hà Nội. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và một số chỉ tiêu hóa sinh của dịch chiết lá cây thuốc bỏng 124 [6]. P. D. Mai (dịch) (2004). Tác dụng bảo vệ gan của lá cây Kalanchoe pinnata. Pers (cây Thuốc bỏng). Bản tin dược liệu, Tập III, số 3 – 2004. [7]. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hóa sinh học. Nxb. KH & KT, Hà Nội. [8]. Nguyễn Thị Phượng (dịch) (2005). Tác dụng chống cảm nhận đau, chống viêm và chống đái tháo đường của cao chiết nước lá cây thuốc bỏng. Bản tin dược liệu: 267 - 273 [9]. Nguyễn Thị Thu Thủy, Đoàn Suy Nghĩ (2009). Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng khuẩn của nấm hoàng chi. Tạp chí Khoa học ĐHH, số 22(56), 25-32. STUDY ON THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND THE BIOCHEMICHAL INDEX OF EXTRACT FROM LEAVES OF LIFE PLANT (Kalanchoe pinnata (LAM.) PERS) Nguyen Thi Thu Thuy Department of Biology, Hue University of Sciences Email: thuthuy.dhkh@yahoo.com ABSTRACT Life Plant (Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers.), also known as Miracle Leaf, is used popularly as a traditional medicinal treatment for detoxication, boils, burns, slight injury and hemostatic. Additionally, Micracle Leaf is also uses for gastritis, stomach problems and some infection diseases. In order to elucidate its medicinal use, we conducted to examined the anti-bacterial effect of this plant extract obtained from three different solvents (water, NaCl 0.9% and ethanol 700) on 5 microorganisms (E. coli, B. pumilus, S. aureus, HU3 and HH1). The experimental results show that the extract by ethanol indicate the highest anti-bacterial effect, with the zone of inhibition on HU3 (in ratio of 4:1) is of 27.33 mm, while the extract obtained from water indicate no inhibition zone on E. coli, B. pumilis and HH1 in ratio of 2:1. The extraction of the total jelly from Life Plant leaves indicate the high anti-bacterial effect on all 5 tested microorganisms. Moreover, the flavonoid extraction from Life Plant also present the big size of inhibition zone obtaining from 23.66 mm to 35.16 mm in ratio of 1/50. The analysis of some biochemical components of Life Plant resulted in vitamin C contents in the morning and in the afternoon are of 0.088% and 0.077%, respectively; while the contents of reducing sugar and total flavonoid are of 0.23% and 7.23%, respectively. Keywords: Antibacterial activity, Life plant (Kalanchoe pinnata (Lam.) Pers), Test microorganism, Total flavonoid.