Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 90 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ ĐẤT THÁI NGUYÊN Vi Thị Đoan Chính - Nguyễn Thị Kim Cúc - Lê Tiến - Trịnh Ngọc Hoàng (Khoa KH Tự nhiên& Xã hội - ĐH Thái Nguyên) Trần Đức Sơn (Trường ĐH Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên) 1. Đặt vấn đề Xạ khuNn (actinomycetes) là đối tượng nghiên cứu quan trọng của ngành vi sinh vật. Các chất kháng sinh do xạ khuNn sinh ra được sử dụng rất nhiều trong y học, sinh học, trong công tác bảo vệ thực vật và trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Thái Nguyên là tỉnh có nhiều diện tích đất nông lâm nghiệp. Điều kiện tự nhiên và khí hậu ưu đãi nên nguồn tài nguyên vi sinh vật rất phong phú, đáng được đầu tư nghiên cứu. Nhằm góp phần bảo tồn, phát triển và nghiên cứu ứng dụng nguồn tài nguyên này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại một số chủng xạ khuNn có hoạt tính kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên. 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu * Đối tượng - 2 chủng xạ khu/n: NC 182, TC 32 có hoạt tính kháng sinh cao, hoạt phổ rộng và đặc biệt là có hoạt tính kháng nấm đã được tuyển chọn trong số các chủng xạ khuNn được phân lập từ đất Thái Nguyên. - Các chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli TA 1283, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium oxysporum VCM 3028, Fusarium moniliforme VCM 3027, Rhizoctonia solani VCM 3047 do Phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam cung cấp. * Phương pháp nghiên cứu + Nghiên cứu các đặc điểm hình thái bề mặt bào tử bằng kỹ thuật hiển vi + Nghiên cứu các đặc điểm nuôi cấy [1], [2] + Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý [1], [2] - Khả năng đồng hoá các nguồn C - Nhiệt độ tối ưu - Khả năng chịu muối + Xác định hoạt tính kháng sinh theo phương pháp đục lỗ + Nghiên cứu phân loại theo Chương trình xạ khuNn quốc tế ISP (International Streptomyces Programme). 3. Kết quả và thảo luận * Đặc điểm hình thái - Chủng TC 32 có bề mặt bào tử xù xì, có lông, cuống sinh bào tử hơi xoắn (Hình 1) T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 91 - Chủng NC 182 có bề mặt bào tử xù xì, cuống sinh bào tử xoắn, số lượng bào tử trên một chuỗi từ 10 – 30 (Hình 2) Hình 1: Bề mặt bào tử chủng TC 32 (x 10.000) Hình 2: Bề mặt bào tử chủng NC 182(x 15.000) * Đặc điểm nuôi cấy Chúng tôi đã nuôi cấy xạ khuNn trong 9 môi trường khác nhau để quan sát khả năng sinh trưởng của xạ khuNn và màu sắc của hệ khuNn ty. Kết quả cho thấy xạ khuNn rất đa dạng về màu sắc khi nuôi cấy trong các môi trường khác nhau và phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy. Các đặc điểm nuôi cấy được trình bày trên bảng 1. Bảng 1: Đặc điểm nuôi cấy của chủng TC 32 và NC 182 Đặc điểm Môi trường Ký hiệu chủng Màu sắc KTKS Màu sắc KTCC Màu sắc tố hoà tan Sinh trưởng Gauze 1 TC 32 NC 182 Xám Hồng Nâu Ghi - - +++ ++ Gauze II TC 32 NC 182 Trắng ngà Trắng hồng Nâu Nâu thẫm Đen Nâu ++ +++ ISP -1 TC 32 NC 182 Trắng xám Trắng Trắng Nâu - Nâu ++ + ISP - 2 TC 32 NC 182 Trắng ngà Trắng hồng Vàng Nâu đen Hơi vàng Nâu + +++ ISP - 3 TC 32 NC 182 Xám Trắng Vàng Trắng - - ++ ++ ISP - 4 TC 32 NC 182 Trắng ngà Trắng hồng Trắng Nâu - - +++ +++ ISP - 5 TC 32 NC 182 Xám nhạt Trắng Nâu Nâu nhạt - - +++ ++ ISP – 6 79 TC 32 NC 182 Xám Hồng Trắng Nâu đen Đen Nâu đen + +++ ISP - 7 TC 32 NC 182 Trắng ngà Trắng Trắng Nâu nhạt - Nâu ++ ++ Ghi chú: (+++) : Sinh trưởng tốt , (++) : sinh trưởng trung bình, (+) : sinh trưởng yếu, ( - ) : Không có sắc tố tan; KTCC : khuNn ty cơ chất ; KTKS : khuNn ty khí sinh T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 92 Kết quả cho thấy trong 9 loại môi trường trên, chủng NC 182 sinh trưởng tốt trên các môi trường: Gause - 2, ISP-2, ISP-4 và môi trường 79. Sinh trưởng yếu trên môi trường Gauze -1. Không có khả năng hình thành sắc tố tan trên môi trường có chứa sắt. Chủng TC 32 sinh trưởng tốt trên môi trường Gauze -1 và ISP – 4, sinh trưởng yếu trên môi trường ISP – 2 và ISP -6. * Các đặc điểm sinh lý + Khả năng đồng hoá đường Để đánh giá khả năng đồng hoá đường, các chủng NC 182 và NC 32 được nuôi trong môi trường ISP-9 có bổ sung các nguồn đường khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 – 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 2. Bảng 2: Khả năng đồng hoá đường của các chủng NC 182 và TC 32 STT Nguồn đường Chủng NC 182 Chủng TC 32 1 Glucose (đối chứng dương) + + 2 Saccasose ++ + 3 Fructose - + 4 Maltose ++ ++ 5 Inositol + ++ 6 Lactose ± + 7 Tinh bột ++ ++ 8 Không có đường (đối chứng âm) - - Ghi chú: (++ ): sinh trưởng tốt, (+): Sinh trưởng bình thường, ( ±) : sinh trưởng yếu, ( -) : không sinh trưởng Kết quả trên bảng 2 cho thấy: Cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng được nhiều loại đường ở các mức độ khác nhau. Nhìn chung, khả năng đồng hoá tinh bột và các loại đường đôi mạnh hơn so với các loại đường đơn. + Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu Chủng TC 32 và NC 182 được nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng sau 5 ngày được thể hiện trên bảng 3. Bảng 3. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của 2 chủng TC 32 và NC 182 28 oC 30 oC 32 oC 35 oC 40 oC 45 oC TC 32 + ++ ++ ++ + - NC 182 + + ++ ++ + - Ghi chú: (++) : Sinh trưởng mạnh, (+) : Sinh trưởng bình thường, (-) : Không sinh trưởng Hai chủng có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong khoảng 32 – 35 oC. TC 32 còn có thể sinh trưởng tốt ở 30 oC. Đây là những xạ khuNn ưa ấm trung bình. Nhiệt độ 45 oC là giới hạn trên của sinh trưởng. Ở nhiệt độ này, cả 2 chủng đều không phát triển được. + Khả năng chịu muối Khi nuôi cấy trong môi trường ISP 1 có bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,5; 1; 3; 5; 7% và 0% đối chứng, kết quả thu được như sau: T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 93 Bảng 4: Khả năng chịu muối của 2 chủng TC 32 và NC 182 0 % 0,5 % 1% 3% 5% 7% TC 32 + ++ ++ + ± - NC 182 + ++ + + ± - Ghi chú: (++): Sinh trưởng tốt, (+): Sinh trưởng bình thường, (+)Sinh trưởng kém, (-): Không sinh trưởng Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuNn. Kết quả nghiên cứu cho thấy: TC 32 và NC 182 có khả năng chịu được nồng độ muối tới 5%. Ở nồng độ muối cao hơn, 2 chủng không phát triển được. Chúng là các chủng ít ưa mặn. Đặc biệt, nếu môi trường có muối NaCl ở nồng độ 0,5 % lại có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của 2 chủng này. * Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng nghiên cứu Dịch lên men của 2 chủng được sử dụng để thử hoạt tính kháng sinh. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh được thể hiện trong bảng 5 Bảng 5: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khu/n (mm) Chủng Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm) B. subtilis E. coli R. solani F. oxysporum F. moniliform TC 32 16 17 14 14 13 NC 182 16 11 16 17 19 Ghi chú: D: đường kính vòng vô khu/n, d: đường kính lỗ tra dịch lên men Kết quả cho thấy cả 2 chủng đều có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, chống vi khuNn G -, G + và các nấm gây bệnh thực vật điển hình. TC 32 có hoạt tính chống vi khuNn tốt trong khi NC 182 có khả năng chống nấm mạnh hơn. * Hệ thống phân loại Từ kết quả quan sát cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử trên kính hiển vi, đồng thời căn cứ vào khóa phân loại của Gause và các mô tả của ISP chúng tôi nhận thấy: chủng TC 32 có các đặc điểm giống với loài Streptomyces griseocastaneus, chủng NC 182 có đặc điểm giống với loài Streptomyces flavovariabilis S. griseocastaneus và S. flavovariabilis là 2 loài chuNn đã được nghiên cứu. Bảng 6: So sánh TC 32 và NC 182 với 2 loài chu/n Môi trường Điểm so sánh TC 32 S. griseocastaneus NC 182 S. flavovariabilis Gause I CSBT Bề mặt bào tử KTKS KTCC Sắc tố Xoắn Xù xì Xám Nâu - Xoắn đơn Xù xì, có lông Xám Nâu → nâu đậm - Xoắn Xù xì Hồng Ghi - Xoắn Xù xì/ có lông Vàng/ hồng Ghi/ vàng - Gause II KTKS KTCC Sắc tố Trắng Nâu Đen Trắng ngà Nâu Đen Trắng Nâu thẫm Nâu Trắng/ cream Nâu Nâu ISP 3 KTKS KTCC Sắc tố Xám Vàng - Xám Vàng - Trắng Trắng - Vàng/ hồng Ghi/ vàng - ISP 6 Sinh melanin Có Có Có Có Ghi chú: CSBT: cuống sinh bào tử, KTKS: khu/n ty khí sinh, KTCC: khu/n ty cơ chất, (-): không có sắc tố T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 3(43)/N¨m 2007 94 Kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 chủng nghiên cứu với các loài chuNn. 4. Kết luận * Về đặc điểm hình thái: Chủng TC 32 và NC 182 có bề mặt bào tử xù xì, cuống sinh bào tử xoắn. Bề mặt bào tử TC 32 còn có lông. * Về đặc điểm sinh lý: Chủng TC 32 và NC 182 có khả năng đồng hoá nhiều nguồn đường khác nhau, đồng hoá tốt tinh bột và đường một số đường đôi. Hai chủng này là những chủng ưa ấm trung bình, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 32 - 35 oC, chịu được nồng độ muối tới 5%. * Về hoạt tính kháng sinh: TC 32 và NC 182 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng chống được vi khuNn Gram -, Gram + và các nấm mốc gây bệnh thực vật điển hình. * Về hệ thống phân loại: + Chủng TC 32 có tên loài là Streptomyces griseocastaneus TC 32. + Chủng NC 182 có tên loài là Streptomyces flavovariabilis NC 182
SUMMARY Research on biological characteristics and classification of some kinds of antibiotic actinomycetes subdivided from land in Thai Nguyen This study focuses on 2 strains TC 32 and NC 182 isolated in Trai Cau and Nui Coc. These strains have the antibiotic activity against bacteria G-, G+ and some typical plant molds. The biocharacteristics and classifications have been determined: Strain TC32 named Streptomyces griseocastaneus TC 32 and - Strain NC 182 named Streptomyces flavovariabilis NC 182. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB KHKT HN, 328 – 345. [2]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khu/n sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án TS sinh học, Hà Nội. [3]. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khu/n sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn, thối cổ rễ phân lập tại Việt Nam, Luận án PTS sinh học, Hà Nội. [4]. Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Anh Đào (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khu/n kháng Pseudomonas solanacearum gây héo cây trồng, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Hà Nội. [5]. Shirling E.B, Gotilieb D (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, International Journal of Systematic Bacteriology, Vol 16, No 3, 313 – 340.