Nghiên cứu chuyển gen ipt tạo cytokinin nhằm làm tăng tuổi thọ hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens - Nguyễn Thị Thanh

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 227 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN IPT TẠO CYTOKININ NHẰM LÀM TĂNG TUỔI THỌ HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Nguyễn Thị Thanh1*, Lê Thị Phương Quyên2, Nguyễn Phương Thảo2 (1*)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thanh.nguyen.itb@gmail.com 2Trường đại học Quốc tế, ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Lá cẩm chướng in vitro được cắt thành các mảnh kích thước 0,5  0,5cm và đặt trên môi trường tái sinh có TDZ 1,0 mg/l và NAA 0,1 mg/l, thời gian 5 ngày. Tiếp theo nuôi chung các mẫu mô lá với vi khuẩn chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396: promoter SAG12 mang gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin, gen hpt kháng hygromycin và gen gusA. Sau 5 ngày nuôi chung, mảnh lá được rửa sạch vi khuẩn và cấy truyền sang môi trường như trên có bổ sung cefotaxime 500 mg/l và hygromycin 5 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen, qua 3 chu kỳ chọn lọc chúng tôi chọn được một số dòng cây chuyển gen. Các dòng chuyển gen được tách và cấy truyền qua môi trường MS có bổ sung IBA 0,5 mg/l và hygromycin 10 mg/l. Một số ít dòng chuyển gen giả định được kiểm tra mô hoá tế bào GUS cũng cho kết quả dương tính. Sự hiện hiện của gen ipt, hpt và gusA được xác định bằng phương pháp PCR, sự hiện diện của các băng DNA mong đợi tương ứng 615 bp; 508 bp; 365bp. Các dòng chuyển gen được lưu giữ cho thí nghiệm tiếp theo để xác định gen chuyển bền vững trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp Southern blot. Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Dianthus caryophyllu, hoa cẩm chướng, gen hpt, gen ipt, gen gusA, GUS, PCR, promoter SAG12, TDZ. MỞ ĐẦU Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) thuộc họ Cẩm chướng (Caryophyllaceae), có nguồn gốc từ châu Âu. Hoa cẩm chướng có nhiều màu sắc đa dạng, hình dạng phong phú, nhiều chủng loại, màu sắc và mùi hương hấp dẫn. Với những ưu điểm trên, cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loại hoa cắt cành phổ biến trên thế giới, chiếm 17% sản lượng hoa cắt cành. Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng lớn nhất thế giới với sản lượng 2.500 triệu cành vào năm 1995, Hà Lan đứng thứ hai với sản lượng 1.800 triệu cành, Ba Lan đứng thứ ba với sản lượng 400 triệu cành... Colombia được xem là thiên đường hoa cẩm chướng với chất lượng hoa tốt nhất thế giới. Các nước khác cũng sản xuất hoa cẩm chướng với số lượng đáng kể, đó là Israel, Trung Quốc... [24]. Hiện nay, cẩm chướng được trồng làm hoa cảnh trong nước và xuất khẩu có khoảng trên 20 giống, chủ yếu được trồng nhiếu ở Đà Lạt. Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,5 triệu cành cẩm chướng các loại và xuất khẩu qua các nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Ôxtrâylia, Đài Loan, Pháp, Đức, Nga...[23]. Trên thế giới cũng như Việt Nam, ngoài nhân giống cẩm chướng phục vụ sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, việc nghiên cứu tạo ra giống mới như giống kháng nấm, virus... có hoa màu sắc mới lạ, tươi lâu là vấn đề đang được quan tâm. Nghiên cứu tạo giống mới bằng công nghệ gen đã và đang được thực hiện và đã có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên cứu trên thế giới về chuyển một số gen có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trên đối tượng cây cẩm chướng như gen ACC, bar, gusA, nptII, LEACO1, PttKN1, rolC, [1, 2, 3, 6, 7, 13, 22]. Trong các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen có vai trò nhất định trong điều hoà sự lão hoá. Trong đó, cytokinin đóng vai trò quan trọng trong hạn chế quá trình lão hóa. Trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật, cytokinin có vai trò rõ rệt trong quá trình giữ cho mô lá tách rời chậm thoái hoá diệp lục tố, được xanh tươi lâu. Ví dụ, như cytokinin liên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch và kéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa kinh tế rất cao. Các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới của các nhà khoa học về nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao 228 isopentenyl transferase (ipt) tạo sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin, zeatin và dihydrozeatin vào cây trồng với mục đích làm mô tế bào của cây tự sản xuất cytokinin: cây hoa giả yên (Petunia), cải bông, hoa cúc, hoa hướng dương, cây rau cải xà lách, khoai tây, thuốc lá... [4, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 20]. Tác dụng của cytokinin nội sinh còn làm tăng hoạt chất artemisinin của cây thanh hao chuyển nạp gen ipt lên 70% so với cây đối chứng không chuyển gen [8]. Ngoài ra, các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt tạo cây chuyển gen có khả năng chống lại được những điều kiện bất lợi của thời tiết như khô hạn, như trường hợp của cây thuốc lá [18, 21]. Kế thừa những nghiên cứu trên thế giới chuyển gen ipt vào thực vật, chúng tôi nghiên cứu chuyển gen ipt vào cây hoa cẩm chướng với hy vọng biểu hiện của gen chuyển sẽ có tác dụng làm tăng tuổi thọ của hoa và lá của giống cẩm chướng. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro Hạt giống cẩm chướng CCF của công ty Trang Nông (tp. Hồ Chí Minh) được khử trùng với cồn 70% trong 1 phút, sau đó với sodium hypochloride 30% [5,0 g/l (w/v), Công ty CP hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo, tp. Hồ Chí Minh] trong 10 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau cùng, các hạt đã khử trùng được gieo trên môi trường 1/2 MS, để trong tối khoảng 1 tuần, ở nhiệt độ 27-28 oC. Khi hạt bắt đầu nảy mầm, cây con được cấy chuyển 1 tháng một lần trên môi trường MS không chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST). Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô Môi trường 1, môi trường nuôi và nhân giống cẩm chướng. MS (Murashige-Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg B5 vitamin) [MSB5] không chất (ĐHST); Môi trường 2, môi trường tái sinh. MSB5 có TDZ 1 mg/l + NAA 0,1 mg/l (v/v); Môi trường 3, môi trường tạo sự vươn chồi và ra rễ. MSB5 + IBA 0,5 mg/l. Điều kiện nuôi cấy với 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 25-27oC. Chủng vi khuẩn, môi trường và điều kiện nuôi cấy Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 chứa plasmid pVDH1396 (kích thước 15,9 kb) mang các gen ipt tạo enzyme isopentenyl transferase dưới sự điều khiển của promoter SAG12 (senescence associated gene 12, từ Arabidopsis thaliana), gen gusA (có intron, promoter CaMV 35S), gen kháng hygromycin hpt dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (hình 1) do chúng tôi thiết kế. Môi trường nhân và giữ chủng vi khuẩn là môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin. Nhân giống vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen, được nuôi lắc 200 vòng/phút qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l, ở nhiệt độ 28oC. Hình 1. Sơ đồ plasmid VDH1396 kích thước 15,890 kb RB và LB. bờ phải và bờ trái; hpt. gen chọn lọc kháng hygromycin (Tnos/hpt/p35S); ipt. gen ipt (pSAG12/ipt/Tnos) và gen gusA (T35S/gus/p35S). Chuyển gen vào cây cẩm chướng nhờ khuẩn Agrobacterium tumefaciens Lá khoảng 4-6 tuần tuổi được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 0,5  05 cm được sử dụng làm vật liệu chuyển nạp gen. Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau: 1. Nuôi cấy các mẫu mô lá trên môi trường số 2 trong thời gian 5 ngày; 2. Gây nhiễm các mẫu mô lá với vi khuẩn tỉ lệ 1:10 (v/v) trong vòng 30 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 229 phút; 3. Vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc vô trùng; 4. Nuôi chung các mô lá với vi khuẩn trong 2-3 ngày. Sử dụng môi trường số 2 lỏng có bổ sung acetosyringone 100 µM. Sau 3 ngày nuôi cấy chung, rửa sạch vi khuẩn bằng nước cất có bổ sung dung dịch cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ. Vớt mẫu ra, thấm khô nước và cấy các mẫu mô lá trên môi trường chọn lọc (số 2) có bổ sung hygromycin 4 mg/l, cefotaxime 500 mg/l. Sau 3 tuần, chuyển qua môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin 5- 10 mg/l, cefotaxime 500 mg/l. Tiếp tục chu kỳ 3 tăng nồng độ hygromyicn từ 5-10 mg/l, tiếp tục chọn lọc thêm 2 chu kỳ (3 tuần/chu kỳ). Cấy truyền các mẫu mô kháng hygromycin qua môi trường số 2 chứa hygromycin 10 mg/l, đến khi vươn chồi, thời gian khoảng 2 tháng. Kiểm tra phát triển cá thể chuyển gen trên môi trường có hygromycin Tách các dòng cây chuyển gen kháng hygromycin và cấy chuyển qua môi trường số 3 có bổ sung hygromycin 10 mg/l, theo dõi sự sinh trưởng của cây. Thử GUS [20]: Ngâm mẫu mô vào dung dịch thuốc thử GUS, hút thấm chân không, ở 37oC trong 16 giờ. Phân tích PCR Tách chiết và tinh sạch DNA dòng cẩm chướng không chuyển gen và các dòng chuyển gen bằng DNesasy plant Mini kit (QIAGEN, Đức). Kiểm tra sự có mặt của các gen ipt hpt, gusA trong các dòng cẩm chướng chuyển gen giả định bằng các cặp mồi đặc hiệu của gen như sau: hpt-1: 5’-AGCTGCGCCGATGGTTT CTACAA-3’ hpt-2: 5’-ATCGCCTCGCTCCA GTCAATG-3’. Sản phẩm PCR được khuếch đại có kích thước đoạn DNA 508 bp; gusA-1:5’- CCTGTAGAAACCCCAACCCGG-3.’ và gusA-2: 5’-CCCGGCAATAACATACGGCG TG-3’. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA có kích thước 365 bp; ipt-1: 5’-TCGGTCCAAC TTGCACAGGAA-3’ và ipt-2: 5’-TACTCCTG AGCGATCCCAT-3’. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn DNA có kích thước 615 bp. Chương trình luân nhiệt: 95 oC: 2 phút; 30 chu kỳ (95oC: 1 phút, 52 -55oC: 1 phút, 72oC: 2 phút) 72 oC: 5 phút, sau cùng bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mô lá đối với kháng sinh hygromycin Kết quả nghiên cứu tính chống chịu tự nhiên của mẫu mô lá giống cẩm chướng CCF có khả năng kháng hygromycin tự nhiên 4 mg/l. Vì vậy, chúng tôi sử dụng nồng độ hygromycin chọn lọc các dòng chuyển nạp gen, nồng độ từ thấp lên cao từ 5-10 mg/l (đối chứng hygromycin 4 mg/l, gây chết mẫu mô lá sau 3 tuần nuôi cấy). Ở thí nghiệm của chúng tôi, nếu chọn ngay lúc đầu nồng độ hygromycin 10 mg/l thì không thu nhận được kết quả. Giai đoạn nuôi chung mẫu mô lá với vi khuẩn Nhiều nghiên cứu công bố trên thế giới đã dùng phương pháp chuyển nạp gen vào cây trồng, thời gian nuôi cấy chung khoảng 2-3 ngày [8, 10, 15]. Nhưng ở đối tượng cẩm chướng, thời gian nuôi chung với vi khuẩn sau 2-3 ngày nuôi cấy mọc rất yếu [3, 5]. Vì vậy, chúng tôi đã tăng thời gian nuôi ủ chung với vi khuẩn lên 5 ngày. Có nhiều khả năng, trong quá trình nuôi cấy chung với vi khuẩn một số giống cẩm chướng tiết ra phenol gây cản trở sự phát triển của vi khuẩn. Chính vì lý do này, thí nghiệm của chúng tôi nuôi chung mẫu mô lá với vi khuẩn tốt nhất thời gian là 5 ngày và nồng độ kháng sinh hygromycin bước đầu cho chọn lọc các các thể chuyển nạp gen giả định là 5 mg/l. Chọn lọc cá thể chuyển nạp gen Sau giai đoạn nuôi chung với vi khuẩn, nếu cấy chuyển các mẫu mô trên môi trường tái sinh có bổ sung hygromycin 10 mg/l, các mẫu mô này bị chết (số liệu chưa công bố). Vì vậy, chế độ chọn lọc các tế bào chuyển nạp gen lần lượt từ thấp đến cao (hygromycin 5-10 mg/l). Sau khoảng một tháng chọn lọc, có nhiều mẫu mô bị chết, và có sự hình thành một số cụm callus mới tăng sinh trên môi trường có hygromycin 5mg/l. Tiếp theo, cấy chuyển callus qua môi trường có hygromycin 6-10 mg/l và tăng dần của lần chọn lọc thứ 3 là 10 mg/l (hình 2). Sau 3 chu kỳ chọn lọc triệt để, chúng tôi đã thu nhận được 5 dòng chuyển gen giả định từ 135 mẫu mô lá. Tần số chuyển gen 3,7%. Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao 230 Kiểm tra khả năng phát triển rễ trên môi trường có hygromycin Năm dòng chuyển gen giả định thu nhận được trên môi trường chọn lọc có hygromycin 10 mg/l được cấy chuyển qua môi trường số 3 có bổ sung hygromycin 10 mg/l. Kết quả các chồi phát triển và ra rễ tốt (hình 2). Hình 2. Chọn lọc và tái sinh các dòng cẩm chướng chuyển gen và kiểm tra tính kháng hygromycin của cá thể chuyển gen a. (DC. đối chứng không chuyển gen; CG. Callus phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l); b: Callus kháng hygromycin; c. Chồi phát triển trên môi trường tái sinh có hygromycin 5 mg/l; d, e. cây con chuyển gen trên môi trường 3 có hygromycin 10 mg/l; g. Cẩm chướng đối chứng không được chuyển gen. Thử GUS: Lấy ngẫu nhiên 3 dòng cẩm chướng chuyển gen giả định (CCF-T1; CCF-T3 và CCF- T5) thử với X-GUC. Kết quả, hầu hết các mô của cẩm chướng kháng hygromycin đều có kết quả dương tính với thuốc thử GUS (hình 3d). Phân tích PCR các gen ipt, hpt và gen gusA Các dòng cẩm chướng kháng hygromycin sinh trưởng bình thường trên môi trường có hygromycin 10 mg/l được tách chiết DNA và kiểm tra PCR. Kết quả PCR cho thấy, các gen ipt, hpt và gen gusA với các cặp mồi đặc hiệu cho thấy sự hiện diện của các băng DNA được khuếch đại tương ứng là 615 bp, 508 bp và 365 bp (hình 3a, 3b, 3c). KẾT LUẬN Nghiên cứu chuyển nạp gen vào mẫu mô lá cẩm chướng bằng phương pháp gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH1396 mang gen, hpt, ipt và gen gusA, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây chuyển nạp gen. Qua phân tích các dòng cây này sinh trưởng in vitro bình thường trên môi trường có hygromycin 10mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS. Phân tích PCR các gen hpt, ipt và gen gusA đã cho thấy, các băng DNA dương tính lần lượt 508 bp, 615 bp và 365 bp. Các dòng chuyển nạp gen này tiếp tục được giữ giống để phục vụ các bước nghiên cứu tiếp theo, như phân tích sự có mặt của gen chuyển trong bộ gen cây hoa cẩm chướng bằng kỹ thuật Southern bot và trồng thử nghiệm trong nhà lưới, theo dõi và đánh giá khả năng tăng tuổi thọ của hoa và lá các dòng đã được chuyển gen. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 231 Hình 3. Phân tích PCR và thử GUS các dòng cẩm chướng chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (a). gen ipt dương tính với băng DNA 615 bp; M. Thang chuẩn 1,0 kb (BioLabs, Mỹ); 1. Đối chứng âm (cây không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen ipt), 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen. (b). gen hpt dương tính với băng DNA 508 bp; M. Thang chẩn DNA 100 bp (Sigma, Mỹ); 1. Đối chứng âm (cây không chuyển gen); 2. Đối chứng dương (plasmid); 7. Đối chứng dương tính dòng phong lan chuyển gen hpt); 2, 3, 4, 5 và 6. Các dòng cây chuyển nạp gen. (c). gen gusA dương tính với băng DNA 365 bp; M. Thang chuẩn 1 kb (BioLabs, Mỹ); 1, 2 và 3. Các dòng cây cẩm chướng chuyển gen; 4. Đối chứng âm (cây không chuyển gen). (d). Biểu hiện của gen gusA sau khi nhuộm với thuốc thử GUS; -ve. đối chứng không chuyển nạp gen; 1, 2 và 3. các dòng cẩm chướng chuyển nạp gen. Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Đại học quốc gia tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ về kinh phí; Phòng Thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ Tế bào thực vật phía Nam, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ trang thiết bị cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amir Zucker A., Chang R. F. L., Ahroni A., Cheah K., Woodson W. R., Bressan R. A., Watad A. A., Hasegawa P. M., Vainstein A., 2010. Transformation of carnation by microprojectile bombardment. Sci Hortic, 64:177-185. 2. Amir Zucker, Ahroni A., Tzfira T., Ben- Meir H., Vainstein A. 1999. Wounding by bombardment yields highly efficient Agrobacterium - mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyllus L.). Mol Breed, 5: 367-375. 3. Chalermsri Nontaswatsri., Seiichi F., Masanori G. 2003. Revised cocultivation conditions produce effective Agrobacterium - mediated genetic transformation of Nguyen Thi Thanh, Nguyen Thi Phuong Quyen, Nguyen Phuong Thao 232 carnation (Dianthus caryophyllus L.). Plant Sci., 166: 59-68. 4. Chang H., Jones M. L., Baz G. M., Clarke D. G., 2003. Overproduction of cytokinin in Petunia flowers transformed with PSAG12- IPT delays Corolla senescence and decrease sensitivity to ethylene. Plant Physiol., 132: 2174-2138. 5. Chin-Yi L., Greg N., Terese W.R., Stephen F.C., Richard Y. Michael J. D. 1999. Agrobacterium-mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyllus L.). Nature Biotech., 9:864-868. 6. Estopa M., Marfa V., Mele E and Messeguer J., 2001. Study of different antibiotic combination for use in the elimination Agrobacterium with kanamycin selection in carnation. Plant Cell Tiss Org., 65: 211-220. 7. Eva C., Ana E. V., Amir Z., Belen F., Alexander V., Maria I. T., Lluisa M., 2004. rolC-transgenic carnation plants: adventitious organogenesis and levels of endogenous auxin and cytokinins. Plant Sci., 167: 551-560. 8. Geng Sa., Ma M., Ye H., Liu B., Li G., Chong Kang, 2001. Effects of ipt gene expression on the physiological and chemical characteristics of Artemisia annua L. Plant Sci., 160: 691-698. 9. Hsiang Chang, Michelle L. J., Gary M. B., and David G. C., 2003. Overproduction of cytokinins in Petunia flowers transformed with pSAG12- IPT delays corolla senescence and decreases sensitivity to Ethylene. Plant Physiol., 132: 2174-2183. 10. Kim-Hong Nguyen., Wilco J., Kees Van D, Frank S., Evert D., Geert S., Philip J. Dix., and Eugene J. K., 2008. Delayed senescence in cauliflower transformed with an autoregulated isopentenyl transferase gene. Int. J. Plant Sci., 169(3): 339-347. 11. Lai-Sheng Meng., Jiang-Ping S., Shao-Bu S., Chong-Ying W., 2009. The ectopic PttKN1 gene causes pleiotropic alternating of morphology in transgenic carnation (dianthus caryophyllus L.). Act. Physiol. Plant, 31(6): 1155-1164. 12. Long-Fang O., Chen, Jia-Yuan H., Yee- Yung C., Chi-Wen S., Shang-Fa Ya., 2001. Transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) with isopentenyl- transferase gene via Agrobacterium tumefaciens for post-harvest yellowing retardation. Mol. Breed, 7: 243-257. 13. Mariya K., Degang Z., William S., Yi Li, Richard McAvoy, 2006. Expression of ipt gene controlled by an ethylene and auxin responsise fragment of the LEACO1 promoter increases flower number in transgenic Nicotiana tabacum. Plant Cell Rep., 25: 1181-1192. 14. Mariya K., Radomira V., Jiri M., Aizhen L., Yi Li, Richard McAvoy, 2009. Enhancement of flowering and branching phenotype in chrysanthemum by expression of ipt under the control of a 0.821 kb fragment of the LEACO1 gene promoter. Plant Cell Rep., 28: 1351-1362. 15. Matthew S. McCabe., Lee C. G., Frank S., Wilco J. R. M Jordi, Geert M. S., Evert D., J. Hans A. van R., J. Brian P., Michael R. D., 2001. Effects of PSAG12-IPT gene expression on development and senescence in transgenic lettuce. Plant Physiol., 127: 505-516. 16. Molinier J., Thomas C., Brignou M., Hahne G., 2002. Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices (Helianthus annuus L.). Plant Cell Rep., 21: 251-256. 17. Nigel E. Gapper., Marian J. M., Mary C. C., Robert H. B., Simon A. C., Ross E. L, Paula E. J., 2002. Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation to alter ethylene and cytokinin biosynthesis in broccoli. Plant Cell, Tiss. and Organ. Cul., 70: 41-50. 18. Rivero R. M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E., 2007. Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowring plant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 19631-19636. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 227-233 233 19. Song Z., Li-Hua Z., Xue-Yuan L., Annelie A., Margareta W., 2004. Infection by Agrobacterium tumefaciens increased the resistance of leaf explants to selective agent in carnation (Dianthus caryophyllus L. and D. chinensis). Plant Sci., 168: 137-144. 20. Thanh T. Nguyen., Philip J Dix, Greg D. Nugent, 2010. Transformation of potato via Agrobacterium coated microparticle bombardment. Biologia. Plantarum., 54(1): 141-144. 21. Yan Xu., Jiang T., Thomas G., Bingru H., 2009. Effects of SAG12-ipt expression on cytokinin production, growth and senescence of creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.) under heat stress. Plant Growth Regul., 57: 281-291. 22. Yusuke K., Kenichi S., Nanako T., Yujiro I., Atsushi M., Toshihito Y., Teruyoshi H., Shigeru S., 2000. Expression of genes responsible for ethylene production and wilting are differently regulated in carnation (Dianthus caryophyllus L.) petals. Plant Sci., 158:139-145. 23. 24. Đặng văn Thông, Đinh Thế Lộc, 2005. Hoa Cẩm Chướng. Nxb. Lao Động - Xã Hội. A STUDY ONE ISOPENTENYL TRANSFERASE GENE BY USING Agrobacterium tumefaciens TO INCREASE THE LONGEVITY OF CARNATION (Dianthus caryophyllus L.) Nguyen Thi Thanh1*, Nguyen Thi Phuong Quyen2, Nguyen Phuong Thao2 (1)Institute of Tropical Biology, VAST (2)International University, Vietnam National University-Ho Chi Minh City SUMMARY In vitro leaves of carnation (cut-off flower) variety CCF cut into small pieces about 1x1cm in size were precultured for 5 days and were co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harbouring the plasmid pVDH1396 contained the β-glucuronida gene (gusA), hygromycin phosphotransferase gene (hpt) under the control of cauliflower Mosaic virus 35S promoters, terminators, and an isopentenyl transferase (ipt) gene from Agrobacterium tumefaciens, driven by the SAG12 promoter from senescence associated gene 12 of Arabidopsis thaliana and its terminator. After 5 days of co-cultivation, explants were transferred onto the MS selection medium containing 1.0mg/l TDZ and 0.1mg/l NAA, 5mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime. Some putative shoots were tested for GUS assay. Putative shoots were transferred on MS medium 3 containing 0.5 mg/l IBA and 10 mg/l hygromycin. PCR analyses on hygromycin resistant shoots generated via Agrobacterium tumefaciens transformation to confirm the presence of the, ipt, hpt and gusA genes with expected bands 615bp, 508bp and 365bp. Analysis of putative carnation transformants to confirm that the foreign genes are inserted into the carnation genome by Southern blot analyses will be done in the future. Keywords: Agrobacterium tumefaciens, carnation, hpt, gusA, ipt, GUS, mediated transformation, PCR, promoter SAG12, TDZ. Ngày nhận bài: 21-6-2012