Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết cám gạo đến hoạt tính của vi khuẩn Probiotics - Hoàng Văn Tuấn

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT CÁM GẠO ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA VI KHUẨN PROBIOTICS Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn*, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Lài Trung tâm Sinh học thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, *sonph@most.gov.vn TÓM TẮT: Dịch chiết cám gạo có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng đặc biệt là giàu chất xơ hòa tan cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định sự ảnh hưởng của dịch chiết cám gạo đến hoạt tính của vi khuẩn probiotics. Kết quả thu được cho thấy, dịch chiết cám gạo có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của vi khuẩn probiotics, cụ thể hàm lượng sinh khối thu được của chủng Lactobacillus acidophilus A1 và Bifidobacterium bifidum A2 tăng cao, riêng Lactobacillus bulgaricus A3 thấp hơn, lần lượt là 2.5.108, 3.4.108, 5.9.107 (CFU/ml). Hoạt tính sinh axit lactic, sinh enzyme ngoại bào và kháng khuẩn đều ở mức cao: hàm lượng axit lactic đạt 40,5; 37,8; 26,2 (g/l); hoạt tính amylaza thể hiện qua đường kính vòng phân giải đạt 23, 22, 7 (mm) và proteaza đạt 26, 24, 10 (mm). Chủng A1 khi phát triển trong môi trường chứa dịch chiết cám gạo có khả năng kháng được 6 chủng kiểm định, chủng A2 kháng được 3 chủng, chủng A3 kháng được 1 chủng. Từ khóa: Cám gạo, chất xơ hòa tan, enzyme ngoại bào, kháng khuẩn, probiotics. MỞ ĐẦU Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm. Cám gạo chiếm 8-10% trọng lượng và chứa khoảng 90% các chất dinh dưỡng của hạt. Trước đây, cám gạo thường được sử dụng trong chăn nuôi và ít được sử dụng trong thực phẩm vì trong thành phần chứa một lượng lớn xơ không tan và dầu (15-20%) làm cho cám dễ bị oxy hóa gây mùi hôi [5]. Ngày nay, cám gạo đã được ổn định bằng cách xử lý nhiệt để làm giảm sự thủy phân và oxy hóa của dầu. Cám gạo chứa nhiều thành phần dinh dưỡng cơ bản như protein, tinh bột, axit béo, các hợp chất phenolic, vitamin nhóm B, khoáng vi lượng, xơ hòa tan. Cám gạo rất giàu chất xơ hòa tan, mặc dù không được tiêu hóa trong ruột nhưng nó có nhiều chức năng sinh học khác, một trong những chức năng quan trọng là sự kích thích sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn có lợi [7]. Các vi sinh vật có lợi ở ruột già có thể sử dụng tốt chất xơ hòa tan, sản sinh ra nhiều hoạt chất chống lại các vi khuẩn lên men thối và vi khuẩn gây bệnh [3]. Cicero et al. (2005) [1] đã chứng minh được rằng các thành phần có trong dịch chiết cám gạo như axit béo không no, phytosterol, tocotrienols có khả năng làm giảm nguy cơ gây bệnh tim mạch. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chủng Probiotics: Lactobacillus acidophilus A1, Bifidobacterium bifidum A2, Lactobacillus bulgaricus A3 lấy từ bộ sưu tập giống của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện ứng dụng Công nghệ. Chủng kiểm định: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923, Bacillus subtillis ATCC 27212, Staphylococus aureus ATCC 12222, Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M42, Candida albicans ATCC 7754, Saccharomyces cerevisiae SH20. Hóa chất: cao thịt, pepton, cao nấm men, glucoza, CH3COONa, MgSO4.7H2O, Phenolphtalein (Trung Quốc, Đức). Môi trường MRS (g/l): Glucoza-20,2; K2HPO4-2,0; CH3COONa-5,0, Cao thịt-10,0; Pepton-10,0, MgSO4.7H2O-0,58; Cao nấm men-5,0, MnSO4.4H2O-0,28; Tween 80-1ml, Thạch-15, Nước cất vừa đủ-1lit, pH 6, khử trùng 121oC/20 phút. Phương pháp Phương pháp ổn định cám gạo Cám gạo được ổn định bằng cách làm nóng đến 125-135°C trong 1-3 giây, với độ ẩm từ 11-15% sau đó giữ ở nhiệt độ cao 97-99°C trong 3 phút trước khi làm nguội [6]. Phương pháp xác định khả năng sinh axit Hàm lượng axit lactic được sinh ra trong quá trình lên men của các chủng probiotics được xác định bằng phương pháp chuẩn độ theo mô tả của Emanuel et al. (2005) [2]. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật Số lượng vi khuẩn được xác định theo phương pháp đếm số khuẩn lạc (CFU) trên môi trường thạch trong hộp petri [3]. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào Xác định khả năng sinh enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch sử dụng các cơ chất là tinh bột, casein. Nhỏ phần dịch nuôi cấy vào các lỗ đã đục ở đĩa petri chứa cơ chất, sau đó đặt các đĩa thạch ở 37oC. Sau 48 giờ tráng dung dịch Lugol. Quan sát vòng phân giải tạo thành. Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng phân giải (ΔD). ΔD = D - d (mm) D: đường kính vòng phân giải (mm); d: đường kính lỗ thạch (mm). Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định bằng phương pháp đục lỗ. Nhỏ phần dịch đã nuôi cấy vi khuẩn lactic (sau 24 giờ) vào các lỗ thạch trên đĩa petri đã cấy vi sinh vật kiểm định, giữ 4oC trong 8 giờ, sau đó đặt các đĩa thạch ở 37oC đối với vi khuẩn kiểm định và 30ºC đối với nấm kiểm định. Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng được xác định tương tự như xác định khả năng sinh enzyme. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của dịch chiết cám gạo đến sự sinh trưởng của các chủng probiotics Các chủng probiotics được nuôi trên môi trường có bổ sung 10-60% (ml/ml) dịch chiết cám gạo, số lượng các vi sinh vật được xác định ở các nồng độ cám gạo khác nhau so với môi trường MRS (ĐC) sau 24 giờ nuôi cấy. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dịch chiết cám gạo bổ sung đến sự sinh trưởng của các chủng probiotics được chỉ ra trong bảng 1. Bảng 1. Sinh trưởng của các chủng probiotics (CFU/ml) Chủng vi sinh vật Tỉ lệ cám gạo bổ sung ĐC 10% 20% 30% 40% 50% 60% A1 8,7×106 1,2×107 5,7×107 2,5×108 3×107 1,2×107 1,1×106 A2 9,2×106 2×107 2,6×107 3,4×108 1,7×108 1,2×107 7,8×106 A3 7,7×105 1,3×106 2,1×106 1,3×107 5,9×107 2,3×107 8,1×106 Bảng 1 cho thấy, dịch chiết cám gạo có ảnh hưởng tốt đến sự sinh trưởng của các chủng nghiên cứu, cụ thể số lượng các vi sinh vật tăng dần ở các nồng độ dịch chiết khác nhau, đạt cực đại ở 30% (chủng A1, A2) và 40% (chủng A3). Từ các giá trị xác lập được, khả năng sinh axit lactic, sinh enzyme, kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng đã được nghiên cứu với việc bổ sung 30% dịch chiết cám gạo cho chủng A1, A2; 40% cho chủng A3. Khả năng sinh axit lactic Các chủng probiotics được tiến hành nuôi cấy trên môi trường MRS bổ sung dịch chiết cám gạo ở các tỷ lệ đã được xác định, tại 37ºC từ 24-96 giờ, sau đó xác định lượng axit lactic được sinh ra. Kết quả cho thấy khả năng sinh axit lactic của cả 3 chủng đã tăng lên đáng kể khi bổ sung dịch chiết cám gạo, hàm lượng axit lactic cao nhất được xác định sau 72 giờ lên men, lần lượt đạt 40,5; 37,8; 26,2 (g/l) (hình 1), lượng axit sinh ra khi so sánh trên môi trường MRS trung bình đạt 23,1 g/l. Khả năng sinh enzyme Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo để so sánh khả năng sinh enzyme của các chủng probiotics và ảnh hưởng của dịch chiết cám gạo đến khả năng sinh enzyme, kết quả được trình bày ở bảng 2. Hình 1. Khả năng sinh axit latic của các chủng probiotics Bảng 2 cho thấy, chủng A1 và A2 có khả năng sinh enzyme cao, chủng A1 khả năng sinh enzyme amylaza và proteaza cao nhất, đặc biệt khi bổ sung dịch chiết cám gạo giàu chất xơ hòa tan thì hoạt tính enzyme cũng tăng hơn so với môi trường MRS, chủng A3 hoạt tính enzyme thấp, ảnh hưởng của dịch chiết cám gạo đến khả năng sinh enzyme của chủng A3 không lớn. Theo nghiên cứu của Đào Thị Lương và nnk. (2010) [4], phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic để thử hoạt tính sinh enzyme thì đường kính vòng phân giải amylaza từ 7-13 mm, proteaza từ 5-12 mm. Bảng 2. Khả năng sinh enzyme của các chủng probiotics Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân giải (D-d, mm) Amylaza Proteaza MRS M - C MRS M - C A1 21 23 25 26 A2 20 22 23 24 A3 6 7 12 10 M-C: Môi trường MRS có bổ sung dịch chiết cám gạo 30% đối với chủng A1, A2; 40% với chủng A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 Hình 2. Hoạt tính sinh enzym amylaza của các chủng probiotics Hình 3. Hoạt tính sinh enzyme proteaza của các chủng probiotics Khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các chủng probiotics thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn, kết quả thu được như ở bảng 3. Chủng A1 có khả năng kháng 6 chủng kiểm định và đường kính vòng kháng khuẩn cao hơn so với chủng A2 chỉ có khả năng kháng 3 chủng kiểm định, chủng A3 có khả năng kháng B. subtillis nhưng mức độ kháng thấp. Các chủng có tiềm năng probiotics trong nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và nnk. (2011) [3] có khả năng kháng E. coli ATCC 25922 với đường kính vòng kháng khuẩn từ 2-4 mm. Bảng 3. Khả năng kháng vi sinh vật của các chủng probiotics Chủng vi sinh vật kiểm định Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) A1 A2 A3 MRS M - C MRS M - C MRS M - C Escherichia coli 3 5 5 8 - - Bacillus subtillis 6 7 - 18 - 3 Staphylococus aureus 18 20 4 5 - - Pseudomonas aeruginosa - 8 - - - - Aspergillus niger 11 12 - - - - Fusarium oxyporum - - - - - - Candida albicans 13 16 - - - - Saccharomyces cerevisiae - - - - - - (-). Không biểu hiện kháng. Hình 4. Khả năng kháng khuẩn của chủng A1 Hình 5. Khả năng kháng khuẩn của chủng A2 KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, dịch chiết cám gạo giàu chất xơ hòa tan đều có ảnh hưởng tốt tới khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng probiotics. Hoạt tính của các chủng khi phát triển trên môi trường bổ sung dịch chiết cám gạo 30% đều ở mức cao đối với 2 chủng A1 và A2, chủng A3 ở mức thấp hơn, cụ thể: Hàm lượng sinh khối đạt lần lượt 2,5×108, 3,4.108, 5,9.107 (CFU/ml); hàm lượng axit lactic đạt 40,5; 37,8; 26,2 (g/l); hoạt tính amylaza thể hiện qua đường kính vòng phân giải đạt 23, 22, 7 (mm) và proteaza đạt 26, 24, 10 (mm); Chủng A1 có khả năng kháng được 6 chủng kiểm định, chủng A2 kháng được 3 chủng và chủng A3 kháng được 1 chủng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Cicero A. F. G., Deroso G., 2005. Rice bran and its main components: Potential role in the management of coronary risk factors. Current Topics in Nutraceutical Reseach, 3(1): 29-46. Emanue V., Adrian V., Ovidiu P., Gheorghe, 2005. Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders. African Journal of Biotechnology, 4(5): 403-408. Hoàng Quốc Khánh, Phạm Thị Lan Thanh, 2011. Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotics từ phân trẻ sơ sinh. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 14(6): 62-76. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền, 2010. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại. Di truyền học - Chuyên san Công nghệ sinh học, 6: 11-16. Melissa M. K., Michael J. M., Gregort G. F., 2012. The health benefits of dietary fiber: Beyond the usual suspects of type 2 diabetes mellitus, cardiovascular disease and colon cancer. Metabolism-Clinical and Experimental, 62: 1058-1066. Randall J., Sayre R. N., Schultz W. G., Fong R. Y., Mossman A. P., Tubelhorn R. E., Saunders R. M., 1985. Rice bran stabilization by extrusion cooking for extraction of edible oil. I. Food Sci., 50: 361-364. Vogt T. M., Zieqler R. G., Graubard B. I., Swanson R. S., Greenberq R. S., Schoenberq J. B., Swanson G. M., Hayes R. B., Mayne S. T., 2003. Serum selen and risk of prostate cancer in US blacks and whites. Int. J. Cancer, 103(5): 664-670. EFFECTIVE INVESTIGATION OF RICE BRAN EXTRACTS TO ACTIVITIES OF PROBIOTICS BACTERIA Hoang Van Tuan, Pham Huong Son, Nguyen Thi Hien, Nguyen Thi Lai Center for Experimental Biology, National Center for Technological Progress SUMMARY Rice bran extracts is not only rich in soluble fiber, but also contains many nutritional ingredients which support for growth of microorganisms. The purpose of this research is determined effect of rice bran extracts to activities of probiotics bacteria. The results shown that the rice bran extracts has good effected on increasing biomass of Lactobacillus acidophilus A1, Bifidobacterium bifidum A2 and Lactobacillus bulgaricus A3 was lower. The level of biomass reached 2.5×108, 3.4×108, 5.9×107 (CFU/ml), respectively. The produced activities of lactic acid, extracellular enzyme and antibacteria have increased. The level of lactic acid reached 40.5, 37.8, 26.2 (g/l), respectively; amylase and protease activities reached 23, 22, 7 and 26, 24, 10 (mm), respectively; Antibacterial activity reached 6, 3, 1 (Tested Strains), respectively. Keywords: antibacterial, extracellular enzyme, probiotics, rice bran, soluble fiber. Ngày nhận bài: 23-4-2013