Một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh M145 tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 - Biền Văn Minh

Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế ISSN 1859-1612, Số 02(22)/2012, tr. 28-33 MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145 TÁCH CHIẾT TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces S16 BIỀN VĂN MINH PHẠM QUANG CHINH - LÊ THANH HẢI Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế Tóm tắt: Các tính chất lý hóa của chất kháng sinh M145 được tách chiết từ chủng Streptomyces S16 phân lập từ mẫu đất trồng Kim Long, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc nhóm polyen. Chất kháng sinh M145 có hoạt tính kháng lại các chủng vi nấm VN_T, VN_X và Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc (Arachis hypogea L.) trong điều kiện in vitro. 1. MỞ ĐẦU Chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 do chúng tôi phân lập từ đất trồng lạc Kim Long, thành phố Huế, tạo chất kháng sinh có hoạt tính chống các chủng vi nấm VN_T, VN_X và F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc (Arachis hypogea L.) trong điều kiện in vitro. Trong bài báo này, chúng tôi chỉ trình bày kết quả nghiên cứu về một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh được tách chiết từ chủng Streptomyces S16. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng Chất kháng sinh tách chiết từ chủng Streptomyces S16 Các chủng vi nấm VN_T, VN_X và Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc (Arachis hypogea L.) Vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli, Staphylococus aureus 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ với F. oxysporum [1] - Thu dịch kháng sinh thô bằng phương pháp nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 trên máy lắc sau 96 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng, sử dụng môi trường Gause-1 có thành phần tinh bột tan: 20g; K2HPO4.3H2O: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g; FeSO4.7H2O: 0,01g; KNO3: 1g; Nước cất: 1000ml, sau đó chiết bằng n-butanol ở mức pH = 7,0, tách chất kháng sinh bằng cách cho hấp phụ nhựa trao đổi ion Amberlite IR120Na đã hoạt hóa vào cột, phản hấp phụ bằng acetone 20%. Kết tủa kháng sinh bằng methanol (8/1), hòa tan chất kháng sinh vào dung dịch đệm acetate phosphate borate pH 7,0 [4]. MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145 29 - Chế môi trường Gause-1 thạch đĩa có trộn trước vi nấm F. oxysporum, dùng khoan đồng có đường kính φ = 1cm khoan bỏ thỏi thạch rồi rót vào đó một lượng dịch kháng sinh thô tách chiết từ chủng Streptomyces S16 đã pha loãng ở trên, đem đặt ở nhiệt độ 2-40C trong 6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán, vi nấm bị ức chế, sau đó ủ ấm 28- 300C sau 48- 72h quan sát vòng vô nấm. - Căn cứ vào kích thước vòng vô nấm để xác định hoạt tính kháng vi nấm. 2.2.2. Xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh Dịch kháng sinh tách chiết từ chủng Streptomyces S16 được đun cách thuỷ ở nhiệt độ 40, 50, 60, 70 và 800C, kéo dài trong khoảng thời gian 15, 30 phút rồi tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ. 2.2.3. Xác định độ bền pH theo Egorov và cộng sự, 1983 [1], [5]. 2.2.4. Định loại chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra theo Blinov và Khokhlov; Amman và Gottlieb, với vi nấm kiểm định là F. oxysporum [3], [4]. Các bước tiến hành: - Nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 trên môi trường Gause-1 trong hộp petri. Sau 7 ngày đêm nuôi ở nhiệt độ 300C cho mọc kín bề mặt hộp thạch các khuẩn lạc, đem cắt nhỏ khối thạch trong hộp petri có chứa khuẩn lạc xạ khuẩn cho vào bình tam giác bổ sung thêm 5ml dung dịch methanol. Ngâm thạch trên trong dung môi này trong khoảng thời gian 2-3 giờ để chất kháng sinh chiết rút ra hết. Lọc dịch có chứa kháng sinh này bằng phễu thuỷ tinh có giấy lọc (các dụng cụ này tuyệt đối sạch về mặt hoá học). Để trong phòng tối thoáng gió làm cho dung môi bay hơi bớt. - Chấm dịch chất kháng sinh lên giấy sắc ký Whatman N01 loại chạy chậm với kích thước 1 x 20cm hệ dung môi n-butanol : acetic acid : nước (4:1:5); n-butanol : pyridine : nước cất (4:3:7). Dịch được chấm đi chấm lại nhiều lần dùng đèn cồn hơ nóng nhẹ giúp cho chóng khô vết chấm. - Sau khi sắc ký giấy kết thúc, dải giấy sắc kí trên được cắt thành từng mẫu nhỏ ghi kí hiệu mẫu, đặt lên bề mặt đĩa thạch đã trộn vi nấm F. oxysporum, đặt ở nhiệt độ 2-40C trong 6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán ra trong khi F. oxysporum bị ức chế không phát triển, rồi nuôi ở nhiệt độ 28-300C trong 72 giờ, quan sát và phát hiện vị trí có vòng vô nấm. Xác định trị Rf theo công thức: Rf = Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm điểm hiện vòng vô nấm Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi chạy đến Căn cứ vào kết quả xác định trị Rf, đối chiếu với tài liệu định loại kháng sinh sẽ xác định được nhóm kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra [4]. BIỀN VĂN MINH và cs. 30 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra 3.1.1. Độ bền nhiệt của chất kháng sinh nghiên cứu Kết quả được trình bày ở hình 1. 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 80 30 phút 15 phút Hình 1. Đồ thị minh họa độ bền nhiệt của chất kháng sinh nghiên cứu Kết quả ở hình 1 cho thấy chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra kém chịu nhiệt, sau 15 phút ở ngưỡng nhiệt độ 500C hoạt tính kháng sinh giảm. Khi nhiệt độ ≥ 800C thì hoạt tính kháng nấm hầu như không còn tác dụng với F. oxysporum gây bệnh, sau 15 phút ở ngưỡng nhiệt độ 800C hoạt tính kháng F. oxysporum (−) âm tính. Sau 30 phút hoạt tính kháng sinh ở các mức nhiệt độ đều giảm manh hơn sau 15 phút xử lý. 3.1.2. Độ bền pH của chất kháng sinh nghiên cứu Bảng 1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum Chất kháng sinh Mức pH Kích thước vòng vô nấm (D − d) mm Chủng Streptomyces S16 tạo ra 5 6 7 8 9 13,0 ± 0,5 17,0 ± 0,5 21,5 ± 0,5 16,5 ± 0,5 11,0 ± 0,5 Ghi chú: D: đường kính vòng vô nấm; d: đường kính lỗ khoan đồng Kết quả thử nghiệm với F. oxysporum trong khoảng pH từ 5 − 9 cho thấy hoạt tính kháng nấm bền ở mức pH từ 6 − 8, kém bền ở mức pH ≥ 8 hoặc ≤ 6. 3.2. Định loại chất kháng sinh do chủng Streptomyces S16 tạo ra 3.2.1. Xác định trị Rf của chất kháng sinh nghiên cứu Bằng phương pháp hiện hình sinh học. Căn cứ vào vị trí dải giấy sắc ký whatman №1 có vòng vô nấm. Kết quả xác định trị Rf thu được như sau: H iệ u số v òn g vô n ấm (m m ) Nhiệt độ 0C MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145 31 Bảng 2. Kết quả sắc ký giấy Whatman №1 chất kháng sinh nghiên cứu Chất kháng sinh Hệ dung môi đã sử dụng Rf Chất kháng sinh Chủng Streptomyces S16 tạo ra n-Butanol : acid acetic : nước cất (4:1:5) 0,38 Antivirubin n-Butanol : pyridine : nước cất (4:3:7) 0,61 Kết quả sắc ký giấy cho thấy, khi chạy sắc ký giấy trong hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước cất (4:1:5) có trị Rf = 0,38; và hệ dung môi n-butanol : pyridine : nước cất (4:3:7) có Rf = 0,61 3.2.2. Đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu Đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu tại Trung tâm phân tích Đại học Huế. Kết quả đo quang phổ tử ngoại của chất kháng sinh thu được như hình 2: Hình 2. Hình quang phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu Kết quả đo phổ tử ngoại chất kháng sinh nghiên cứu do chủng Streptomyces S16 có đỉnh hấp cực đại (λ= 317 – 325 nm). Căn cứ vào kết quả xác định trị Rf khi sắc ký giấy whatman №1 và kết quả đo quang phổ tử ngoại cực đại, chúng tôi cho rằng chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 tạo ra có trị Rf tương tự chất kháng sinh antivirubin (T.Kusaka, H., M.Shibata et, al, 1968) tưng ứng pentaen, thuộc nhóm polyen và chúng tôi tạm đặt tên là chất kháng sinh M145. 3.3. Thử nghiệm hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh trong điều kiện in vitro Kết quả thử nghiệm hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh thối cổ rễ (VN_T, VN_X và F.oxysporum) của dịch kháng sinh tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces S16 sau lên men 72h trong môi trường Gauze-1 ở điều kiện in vitro được trình bày ở bảng sau: BIỀN VĂN MINH và cs. 32 Bảng 3. Hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh của dịch lên men Streptomyces S16 Chủng Đường kính vòng vô nấm (D-d)mm 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày VN_T 20 19 18 16 VN_X 18,5 17,5 17 15 F. oxysporum 20 19 18 17 Ghi chú: - D: Kích thước vòng vô nấm; d: Kích thước thỏi thạch - Chủng vi nấm gây bệnh VN_T và VN_X là do chúng tôi phân lập từ rễ cây đậu lạc bị bệnh thối gốc; F. oxysporum là đối chứng. Kết quả bảng 3 cho thấy sau 2 ngày hiệu quả diệt vi nấm gây bệnh VN_T và VN_X và F. oxysporum của dịch lên men chưa cô đặc là cao nhất. Sau 3-5 ngày tiếp theo kích thước vòng vô giảm do hệ sợi nấm sinh trưởng phát triển mạnh mọc vươn ra làm che lấp vòng vô nấm. Vì vậy, cần cô đặc dịch lên men để tăng hiệu quả diệt nấm. 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Các tính chất hóa lý của chất kháng sinh M145 được tách chiết từ chủng Streptomyces S16 từ đất Kim Long, thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc nhóm polyen. Chất kháng sinh M145 có hoạt tính kháng lại các chủng vi nấm VN_T, VN_X và F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc Arachis hypogea L. trong điều kiện in vitro. Đề xuất sử dụng chủng Streptomyces S16 làm đối tượng tạo chế phẩm kháng lại các chủng vi nấm VN_T, VN_X và F. oxysporum gây bệnh thối cổ rễ cây lạc Arachis hypogea L. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng và các tác giả (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [2] Lê Gia Hy và các tác giả (1992), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn Streptomyces phân lập ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, số 14(4). [3] Biền Văn Minh, Nguyễn Văn Độ (2008), Một số tính chất lý hóa của chất kháng sinh M105 tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.S6, Tạp chí Khoa học & Giáo dục, trường ĐHSP Huế, số 02(06), tr.10-14. [4] Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu xạ khuẩn kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án Tiến sỹ sinh học, Hà Nội. [5] Egorov N.X.(1983), Thực tập Vi sinh vật, NXB Mir, Maxcơva, Nguyễn Lân Dũng dịch, NXB ĐH&THCN, Hà Nội. MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CHẤT KHÁNG SINH M145 33 Title: THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF ANTIBIOTIC FROM ACTINOMYCETES STRAIN Streptomyces S16 Abstract: The physicochemical properties of M145 antibiotic that was isolated from Streptomyces S16 at Kim Long’s land samples, in Hue City, Thua Thien Hue Province belongs to polyen group. The M145 antibiotic againsts to VN_T, VN_X and Fusarium oxysporum that causes collar rot in peanut plant (Arachis hypogea L.) in vitro. PGS.TS. BIỀN VĂN MINH Khoa Sư phạm Kỹ thuật, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế ĐT: 0913439685. Email: minhs56@gmail.com TS. PHẠM QUANG CHINH Khoa Sư phạm Kỹ thuật, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế KS. LÊ THANH HẢI Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế