Một số phản ứng sinh hóa định danh vi sinh vật

trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37oC/24 – 48h. Số lượng Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản ứng đông huyết tương dương tính. 2. Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. NỘI DUNG 1.Thiết bị, dụng cụ - Tủ sấy 180 – 200oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 ±1oC - Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met hoặc giấy đo pH 2.Dung dịch pha loãng, môi trường, hoá chất Nước đệm pepton Môi trường Bair parker Dung dịch Kali Tellurit 1% Dung dịch sulphamezatin (sulphadimidin, INH) 0,2% Dung dịch Natri pyruvat 20% Dung dịch lòng đỏ trứng Canh thang tim óc ( Brain Heart Infusion) Huyết tương thỏ 3.Các bước tiến hành 3.1 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml mẫu thử cho vào bình 90ml nước đệm pepton(đậm độ 10-1). Từ đậm độ này pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử. Sản phẩm dạng khác: caan 10g mẫu thử cho vào 90 ml nước đệm pepton (đậm độ10-1). Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử. 3.2 Cấy mẫu Sản phẩm dạng lỏng: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml mẫu thử ban đầu. Lặp lạii với các đậm độ pha loãng khác. Sản phẩm dạng khác: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml đậm độ pha loãng ban đầu (đậm độ 10 –1) Lặp lại với các đậm độ pha loãng khác. Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô. Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào tủ ấm 35-37 ± 1oC/ 24-48h 3.3 Đếm khuẩn lạc Chỉ tính những đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc. Đếm tất cả những khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường kính từ 1-1,5 mm, bao quanh bởi một vùng đục sát khuẩn lạc và vùng trong phía bên ngoài) và không điển hình (không có vùng trong). 3.4 Thử khẳng định Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, mỗi khuẩn lạc cho vào một ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi ở 35-37oC/20 -24h Cho 0,1ml môi trường đã nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để ở 35-37oC / 4-6h. Phản ứng được coi là dương tính khi phần đông huyêt tương chiếm 1/2 thể tích dung dịch. Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận dạng trên mỗi đĩa bc bnc a = ----- Cc + ----- Cnc Ac Anc Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase Anc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase bc số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase bnc số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase Cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa Cnc là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử Σa N = --------------------- V (n1+ 0,1 n2) d Σa là tổng số khuẩn lạcc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được nhận dạng có mặt trong mẫu thử V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng) 4 Biểu thị kết quả Độ pha loãng 10-2 Đĩa 1: 65 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=65 Đĩa 2: 85 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=85 Độ pha loãng 10-3 Đĩa 1:3 KLĐH, 3KL có coagulase(+), a=3 Đĩa 2: 7 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=7 N= 65+85+3+7/0,1(2+ 0,1x2) 10-2 = 57272 = 5,7 x 104 CFU/g(ml) CHUẨN BỊ DUNG DỊCH LÒNG ĐỎ TRỨNG Dung dịch Kali Tellurit Kali Tellurit 1g Nước cất VT 100ml Làm ấm để hòa tan, bảo quản 0-5oC/vài tháng Dung dịch Natri Pyruvat Natri Pyruvat 20g Nước cất VT 100ml Cho Natri Pyruvat vào một phần nước, sau đó thêm cho đủ 100ml, hòa tan, lọc vô trùng, bảo quản ở 0-5oC/1 tháng Rửa sạch vỏ trứng Ngâm trong cồn 70o/5-10 phút Tách đôi vỏ trứng, đổ từ vỏ nọ sang vỏ kia để loại phần lớn lòng trắng Dùng pipet hút hết lòng rắng còn lại Hút lòng đỏ trứng, pha với nước cất VT theo tỷ lệ ¼ Dùng ngay hoặc để cách thủy ở 45oC/2h rồi để ở 0-5oC/18-24h, lấy phần dung dịch nổi phía trên. Bảo quản ở 0-5oC/72h MÔI TRƯỜNG BAIR-PARKER LÒNG ĐỎ TRỨNG Môi trường BP 90ml Dung dịch Kali Tellurit 1ml Dung dịch Natri pyruvat 5ml Dung dịch lòng đỏ trứng 5ml Đun tan thạch, để nguội khoảng 50oC, thêm các thành phần, trộn đều (không tạo thành bọt) Đổ đĩa, làm khô mặt thạch trước khi sử dụng. ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS ĐẶC ĐIỂM Họ Bacillusaceae Trực khuẩn Gram (+) Hiếu, kỵ khí tùy ý Di động Sinh nội bào tử Lên men Glucose sinh hơi VP(+) Nitrat (+) ĐỘC LỰC Sinh độc tố ruột bền và không bền nhiệt Độc tố tan máu (haemolysin GÂY BỆNH Nôn mửa Tiêu chảy Viêm dạ dày ruột Hoại tử sau chấn thương, đặc biệt ở mắt Các nhiễm trùng cơ hội khác Ngộ độc thực phẩm: thể nôn (do độc tố chịu nhiệt) và thể tiêu chảy (do thức ăn bị nhiễm khuẩn) Thời gian ủ bệnh trên 6 giờ, thường từ 10 – 12 giờ DỊCH TỄ Phân bố rộng rãi trong tự nhiên Có nhiều trong đất và thực phẩm bị ô nhiễm Thực phẩm nguy cơ cao: gạo, các loại ngũ cốc, thịt, rau… ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS Nguyên lý phương pháp Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT thạch MYP chọn lọc khi ủ ở 30oC /24h và có phản ứng VSHH phù hợp trong phép thử khẳng định Phạm vi áp dụng: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ DỤNG CỤ Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1oC. Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1oC. Tủ sấy khô. Nồi hấp áp lực . Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG Nước đệm pepton . Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) hoặc thạch Cereus Selective Agar (MOSSEL). Nhũ tương lòng đỏ trứng, 50% Canh thang Phenol Red Glucose. Môi trường Voges-Proskauer. Canh thang Nitrate –(Nitrat Broth). Thạch dinh dưỡng Thạch máu cừu hoặc thỏ. Môi trường kiểm tra sự di động. Thuốc thử nitrate (dung dịch A, dung dịch B). Thuốc nhuộm Gram CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút). Môi trường chọn lọc được bổ sung nhũ tương lòng đỏ trứng theo công thức. Chuẩn bị mẫu - Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 25g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 225 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH Pha loãng mẫu - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, trộn đều để thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy 2 đĩa petri và dùng một pipet đã tiệt khuẩn riêng. Lấy 0,1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào đĩa thạch chọn lọc Dùng que cấy thủy tinh vô trùng trải đều mẫu thử. Lật ngược đĩa và ủ ở 30 ± 1oC /24 giờ. ĐỌC KẾT QUẢ Do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymycin nên trên môi trường MYP khuẩn lạc B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa (có mặt lecithinase). Trường hợp sử dụng môi trường MOSSEL, khuẩn lạc B.cereus to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng. Chọn từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc điển hình cấy sang thạch dinh dưỡng ở 30 ± 1oC /24 giờ. để thử các phản ứng khẳng định THỬ KHẲNG ĐỊNH Gram (+) Lên men kỵ khí Glucose Khử Nitrat – nitrit (+) VP (+) Tan máu ß Di động (+) (Các phản ứng thử ở 35 ± 1oC /24 giờ) TÍNH KẾT QUẢ: Như đối với S.aureus CLOSTRIDIUM PERFRINGENS (C.WELCHII) Clostridium perfringens (C.welchii) Lớp: Clostridia Bộ: Clostridiales Họ: Clostridiaceae Giống: Clostridium Loài: perfringens * Đặc điểm và phân bố Trực khuẩn Gram dương,đầu vuông Sinh bào tử Kỵ khí chịu nhiệt Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, đường ruột của người và các loại động vật có xương sống * Khả năng gây bệnh và sinh độc tố: Gây hoại tử Nhiễm trùng huyết Viêm túi mật Hoại thư sinh hơi Đôi khi dẫn tới tử vong Sinh độc tố ruột α- toxin xâm nhập màng tế bào, hình thành các lỗ hổng trên bề mặt và phá hủy chức năng của màng tế bào Sinh độc tố β-toxin gây loét hoại tử * Khả năng gây ngộ độc thực phẩm Do typ C sinh α-toxin Thời gian ủ bệnh: 8 – 12 giờ Triệu chứng: đau quặn bụng, nôn mửa, tiêu chảy, đôi khi có sốt Liều gây bệnh: khoảng 10 triệu TB/gam Thực phẩm nguy cơ cao: thịt và sản phẩm thịt, thực phẩm chế biến có thời gian bảo quản dài, thực phẩm đông lạnh * Đặc điểm nuôi cấy Trên thạch máu:khuẩn lạc phẳng, lan, dạng R, mờ, mép không đều, tan máu β Trên thạch trứng: có vùng phân giải trứng mờ xung quanh khuẩn lạc Trên thạch chọn lọc TSC: khuẩn lạc có màu đen, tròn Phát triển tối ưu ở 40oC * Tính chất sinh vật hóa học Gram dương Không di động Lecithinase (+) Nitrit (+) Lên men sinh hơi lactose (+) Hóa lỏng gelatin (+) Clostridium perfringens (C.welchii)- Phương pháp định lượng * Nguyên lý: C.perfringens là vi khuẩn có màu đen khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Tryptose – sunfit – cycloserin trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC/ 20h và có những tính chất sinh hoá đặc trưng trong phép thử khẳng định, được tính theo số lượng có trong một ml hay một g sản phẩm kiểm nghiệm. * Phạm vi áp dụng Định lượng Cl.perfringens trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. * Thiết bị - dụng cụ - Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử: - Tủ sấy 180 – 2000C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 ±1oC- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm - Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC - Máy đếm khuẩn lạc - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met hoặc giấy đo pH * Môi trường nuôi cấy và thuốc thử - Thạch Tryptose- sulfit-cycloserin (TSC) - Canh thang Thioglycolat - Môi trường nitrat di động - Môi trường gelatin-lactose - Thuốc thử phát hiện nitrit - Bụi kẽm * Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu -Sản phẩm dạng lỏng: Thường dùng mẫu nguyên cho đậm độ nuôi cấy ban đầu. Hút 25ml mẫu thử cho vào BÌNH 225ml dung dịch đệm pepton để có đậm độ pha loãng 10-1, tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo tuỳ từng mẫu thử. - Sản phẩm dạng khác: Cân 25g mẫu thử đã đồng nhất cho vào bình có 225ml nước đệm pepton. Từ đậm độ pha loãng ban đầu này (10-1) pha loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử. Cấy mẫu - Sản phẩm dạng lỏng: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml mẫu nguyên. Tiến hành tương tự nếu cần có các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa. - Sản phẩm dạng khác: cho vào 2 đĩa petri, mỗi đĩa 1ml đậm độ pha loãng ban đầu (10-1), tương tự với các đậm độ pha loãng tiếp theo, mỗi đậm độ cấy hai đĩa. Rót vào mỗi đĩa 10-15 ml thạch TSC( Đã đun chảy và để nguội tới 450), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo hai chiều trái, phải. Để đông tự nhiên, sau đó phủ lên trên bề mặt thạch của mỗi đĩa 10ml thạch màng TSC. Để đông. Ủ ám trong điều kiện kỵ khí ở 35 – 37oC / 20h ± 2h Đếm và chọn khuẩn lạc - Chọn tất cả các đĩa có ≤ 150 khuẩn lạc. - Nếu hai đĩa của cùng một đậm độ có ít hơn hoặc bằng 150 khuẩn lạc điển hình, đếm tổng số khuẩn lạc trên cả hai đĩa và lấy giá trị trung bình. - Nếu bốn đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15-150 khuẩn lạc điển hình, tính giá trị trung bình của hai đậm độ. Nếu tỷ số giữa giá trị trung bình cao hơn của hai đĩa cùng một đậm độ trên giá trị trung bình thấp hơn của đậm độ liền kề lớn hơn 2 thì lấy giá trị trung bình thấp hơn. - Nếu đĩa cấy bị đen hoặc không thể đếm được các khuẩn lạc riêng rẽ thì đếm các đĩa của độ pha loãng cao hơn kế tiếp. Đếm số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và chọn ra 5 khuẩn lạc để thử khẳng định sinh hoá. Thử khẳng định sinh hoá a) Khả năng di động: trên môi trường nitrat di động, nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí, 35-37oC/ 24h. Sau đó thử phản ứng chuyển nitrat thành nitrit: - Nhỏ 0,2-0,5 ml thuốc thử phát hiện nitrit lên môi trường nitrat di động / 15 phút. Nếu sau 15 phút mà không thấy xuất hiện màu đỏ thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút.Nếu vẫn không thấy xuất hiện màu thì kết luận phản ứng dương tính . Lưu ý: phản ứng này phải làm trong hốt. b) Khả năng lên men lactose và hoá lỏng gelatin: cấy vi sinh vật vào môi trường lactose – gelatin. Nuôi cấy kỵ khí ở 35 – 37oC / 24h. Nếu môi trường chuyển sang màu vàng là vi khuẩn đã lên men đường lactose. Làm lạnh 1h các ống nuôi cấy ở 5oC và kiếm tra sơ bộ sự hoá lỏng gelatin Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc thì để thêm 24 h nữa. Tính kết quả: Nếu số khuẩn lạc thử khẳng định sinh hoá đúng lớn hơn hoặc bằng 80% tổng số khuẩn lạc đã đếm thì toàn bộ số khuẩn lạc này được coi là Cl. perfringens. Trong tất cả các trường hợp khác, số khuẩn lạc Cl. perfringens được tính như sau: Ví dụ: Số khuẩn lạc trung bình trên hai đĩa là 75 Số khuẩn lạc chọn để thử khẳng định là 10 Số khuẩn lạc xác định đúng là 6 (60%) Số khuẩn lạc Cl. perfringens = 75 x 0,60 = 45 Chỉ để lại hai chữ số có nghĩa trong kết quả cuối cùng: Nếu số đó nhỏ hơn 100 thì làm tròn bằng bội số của 5 gần nhất. Nếu số đó lớn hơn 100 và tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 20 gần nhất. Nếu số đó lớn hơn 100 nhưng không tận cùng bằng 5 thì làm tròn bằng bội số của 10 gần nhất. Để đánh giá những số thấp, lấy giá trị trung bình của phép đếm khuẩn lạc điển hình đã xác định và làm tròn tới số nguyên lớn nhất liền đó và đem nhân với giá trị nghịch đảo của độ pha loãng. Báo cáo kết quả - Nêu rõ phương pháp đã áp dụng, nhiệt độ nuôi cấy và kết quả ghi nhận được cũng như tất cả các chi tiết có thể có ảnh hưởng đến kết quả. SƠ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG C. PERFRINGENS SHIGELLA SPP SHIGELLOSIS - Là bệnh nhiễm trùng do Shigella gây nên - 1994: 500 000 - 800 000 người Rwanda mắc S.dysenteriae typ 1, chỉ tháng đầu đã có 20 000 người chết (kháng kháng sinh) - Khoảng 18000 người mắc/năm (Mỹ) - Xảy ra ở mùa hè nhiều hơn mùa đông - Thường gặp ở trẻ nhỏ, đặc biệt từ 2 – 4 tuổi LỊCH SỬ - Phát hiện cách đây hơn 100 năm - Người phát hiện: nhà khoa học Nhật bản (Shiga) PHÂN LOẠI Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Shigella Loài: S. boydii thuộc nhóm C S. dysenteriae thuộc nhóm A(typ I đặc biệt nguy hiểm vì lan truyền thành dịch, có thể tử vong) S. flexneri thuộc nhóm B S.sonnei thuộc nhóm D KHẢ NĂNG GÂY BỆNH - Sinh hai loại độc tố ruột ShET1 và ShET2 - S.dysenteriae typ 1 sinh độc tố tế bào độc tính cao là Shigatoxin (verotoxin): phá hủy màng trong mao quản dẫn tới thiếu máu cục bộ tại các mô của ruột non DỊCH TỄ HỌC Tác nhân: Giống Shigella 4 loài: S. sonnei, (D) S. boydii, (C) S. flexneri, (B) S. dysenteriae (A) Nơi cư trú: Người - S.flexneri là nguyên nhân chính ở các nước đang phát triển( 60%) - S.sonnei (15%), thường gặp ở các nước công nghiệp phát triển - S.dysentariae thường gặp ở Nam Á, Phi 6%) - Các type khác nhau phân bố khác nhau: S.dysenteriae typ 1 thường gặp ở Ấn độ, Malaysia, Guatemala, typ 4,5,6,7,9,10 thường gặp ở các nước đang phát triển Kiểu lây truyền Người – Người – Phân- Miệng, Miệng – Sinh dục Nguồn lây nhiễm: nước/thực phẩm ô nhiễm Thời gian ủ bệnh Trung bình: 1-3 (tới 4) ngày Triệu chứng có thể kéo dài từ 12 đến 96 giờ hoặc đến hàng tuần Tính chất lây nhiễm Dễ dàng truyền từ người sang người Liều gây bệnh thấp: 10 đến 100 vi khuẩn Có khả năng lây nhiễm qua người lành mang vi khuẩn Kháng sinh Trường hợp nhẹ không cần sử dụng Hầu hết tự khỏi sau 48-72 h Vai trò của kháng sinh: Giảm thời gian đi tiêu chảy, ngăn ngừa thải vi khuẩn qua phân Ngăn chặn bệnh lây lan Các vấn đề liên quan đến sức khỏe cộng đồng Có thể xảy ra thành dịch Điều kiện sống, mật độ dân số Lý do: tính chất lây nhiễm Gia tăng mức độ kháng kháng sinh Không có Vacxin BIỂU HIỆN LÂM SÀNG Bệnh sinh, tỷ lệ mắc và chết phụ thuộc vào: Vật chủ Type huyết thanh của vi khuẩn Lâm sàng Không biểu hiện triệu chứng Sốt,nôn, đau quặn bụng, nôn mửa, ỉa máu mũi Co giật, thủng ruột Hội chứng Reiter’s: khoảng 3% người mắc bệnh do S.flexneri bị đau mắt, viêm đường tiết niệu hàng tháng /hàng năm sau, và có thể dẫn tới viêm khớp cấp (người dễ nhiễm, có tính di truyền) SHIGELLA SPP * ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ Trực khuẩn Gram âm Không di động Không sinh bào tử Không lên men đường lactose Có quan hệ gần gũi với E.coli (E.coli (EHEC) đặc biệt là E.coli O157 :H7 sinh độc tố shiga giống S.dysenteriae Phân bố rộng rãi trong tự nhiên * KHẢ NĂNG GÂY BỆNH Gây hội chứng lỵ: đau bụng, ỉa máu, sốt, nôn Gây bệnh ở người và loài linh trưởng Nguồn lây nhiễm: các loại rau củ bón phân tươi, nước ô nhiễm phân PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP * Nguyên lý phương pháp - Phát hiện Shigella spp. trong mẫu thử bằng cách xác định khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc, có các phản ứng sinh hóa và huyết thanh đặc trưng trong phép thử khẳng định * Phạm vi áp dụng - Thực phẩm và thức ăn gia súc * Thiết bị, dụng cụ - Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử : Tủ sấy 180 – 2000C Nồi hấp áp lực Tủ ấm 25 – 30 ±1oC Đĩa petri đường kính 90 – 100ml Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1,5,10 ml Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 42 70 ±1oC Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm pH met, chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25oC * Môi trường, thuốc thử Canh thang Shigella Thạch Macconkey Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Thạch Hektoen Enteric Thạch dinh dưỡng Thạch Triple Ion Sugar (TSI) Môi trường LDC, ODC Môi trường Bromocresol tía Thuốc thử Kovacs, β-galactosidase, ONPG Kháng huyết thanh Shigella * CÁCH TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch huyền phù ban đầu: 25g mu thử đã đồng nhất trong 225 ml canh thang Shigella hoặc trypton soya có bổ sung 0,5 μg/ml novobiocin để được dung dịch huyền phù ban đầu Lưu ý: mẫu thử cần được phân tích ngay vì Shigella spp. dễ chết trong điều kiện không thuận lợi 2. Tăng sinh Ủ canh thang Shigella ở 41,5 ± 1oC từ 16 – 24 giờ 3. Cấy chuyển lên môi trường chọn lọc Macconkey XLD Hektoen Enteric Ủ ở 37 ± 1oC từ 20 – 24 giờ 4. Nhận dạng khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Trên Macconkey: KL nâu đỏ, trong mờ, không lên men đường lactose. Riêng Shigella sonnei có thể có màu hồng nhạt Trên XLD: trong mờ, tâm màu đỏ, không lên men đường lactose Trên HE: khuẩn lạc ướt, màu xanh lá cây. Riêng Shigella sonnei có khuẩn lạc lồi. Trên môi trường Deoxycholate Citrate Agar, khuẩn lạc Shigella có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục). 5. Phép thử khẳng định Mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ Cấy các khuẩn lạc riêng rẽ lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC từ 18 – 24 giờ để thử khẳng định sinh hóa và huyết thanh * Thử khẳng định sinh hóa: Lên men đường và sinh H2S: cấy vào thạch ống TSI, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ Di động: cấy vào ống thạch mềm, ủ ở 37 ± 1oC/ 18 - 24 giờ Phân giải Ure: cấy vào thạch ống hoặc canh thang Ure, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ Phát hiện Lysinedecarboxylase: cấy vào MT LDC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ Phát hiện Ornithinedecarboxylase: cấy vào MT ODC, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ Sinh Indol: Cấy khuẩn lạc cần xác định vào MT trypton/tryptophan, ủ ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ, sau đó cho thêm 1 ml thuốc thử Kovacs Phát hiện β- galactosidase: cấy một ăng khuẩn lạc vào 0,25 ml NaCl 0,85%. Nhỏ 1 giọt Toluen và lắc đều, để ở 37oC/vài phút. Sau đó thêm 0,25 ml thuốc thử ONPG và lắc đều, để ở 37 ± 10C/24 ± 3 giờ Sử dụng Carbonhydrate: cấy vào canh thang Carbonhydrate, ở 37 ± 1oC/24 ± 3 giờ * Thử khẳng định với kháng huyết thanh đặc hiệu:KN O(A,B,C,D) Shigella spp. Không di động, không có kháng nguyên lông. Việc phân biệt các chủng dựa trên phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O đa giá và đơn giá đặc hiệu Cấy chuyển khuẩn lạc cần xác định lên thạch dinh dưỡng, ủ ở 37 ± 1oC/24 giờ * Loại trừ các chủng tự ngưng kết: Nhỏ 1 giọt NaCl 0,85% lên lam kính Dùng que cấy lấy một ít KL, nghiền đều Lắc nhẹ trong 30 – 60 giây Nếu thấy có hạt ngưng kết thì bỏ đi không thử tiếp * Ngưng kết với kháng nguyên O Làm tương tự, thay NaCl 0,85% bằng kháng nguyên O đa giá Nếu ngưng kết với kháng nguyên O đa giá thì thử tiếp với các loại kháng nguyên đơn giá để định typ nếu có điều kiện (A,B,C,D) Nếu có kháng nguyên bề mặt K: đun sôi dịch vi khuẩn 30 phút, sau đó thử lại với KN O đa giá và đơn giá Báo cáo kết quả - Nêu rõ phương pháp sử dụng và kết quả thu được, kể cả những thông tin chi tiết về phép thử SALMONELLA ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỐ Trực khuẩn Gram (+) Di động Không sinh nha bào Phân bố rộng rãi trong tự nhiên Nguồn lây nhiễm: động vật nuôi, đặc biệt gia cầm, đất nước Thực phẩm nguy cơ cao: thịt và sản phẩm từ thịt, sữa và sản phẩm từ sữa, rau, quả bị ô nhiễm trong quá tình sản xuất, chế biến KHẢ NĂNG GÂY BỆNH - Là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu, sốt thương hàn, viêm dạ dày ruột - Triệu chứng: đau quặn bụng, ỉa chảy, sốt đau đầu, đôi khi viêm khớp sau 3-4 tuần - Thời gian ủ bệnh: 6 - 48h PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Phát hiện Sal trong mẫu thử bằng cách xác định các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có các PƯSH và huyết thanh đặc trưng cho phép thử khẳng định. PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi TÀI LIỆU TRÍCH DẪN DỤNG CỤ - THIẾT BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY, THUỐC THỬ VÀ HUYẾT THANH Nước đệm pepton Môi trường Magie clorua – lục malachit Môi trường Selenit – cystin Thạch đỏ phenol – lục sáng Thạc Hektoen enteric ( Hektoen Enteric Agar) Thạch dinh dưỡng ( Nutrient agar) Thạc 3 đường sắt ( TSI agar) Thạch Ure (Ure christensen Agar) Thạc dinh dưỡng bán đặc Môi trường L – Lysin decacboxyl Thuốc thử - Galactosidase Thuốc thử Voges – Proskauer ( VP ) Thuốc thử Indol Thuốc thử Kovacs Tiền tăng sinh trong môi trường lỏng không chọn lọc: 25g mẫu thử đã đồng nhất cấy vào 225ml nước đệm pepton, ủ ở 35-37oC/ 16-20h. Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: - Cấy chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào ống nghiệm có sẵn 10ml môi trường Rappaport Vassiliadis (RV), ủ ở 42oC/ 24h. - Cấy chuyển 10ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào bình có sẵn 100ml môi trường Selenit Cystin, ủ ở 35-37oC/ 24-48h. Nhận dạng khuẩn lạc Sallmonella trên môi trường thạc chọn lọc: Trên thạch đỏ phenol lục sáng: khuẩn lạc đục, làm thay đổi màu môi trường từ hồng sang đỏ. Trên thạch Nektoen Enter: khuẩn lạc Salmonella điển hình thường màu xanh, có tâm đen hoặc không. Lưu ý: Nếu Salmonella mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc điển hình thì phải ủ tiếp ở 35-37oC/ 24h nữa và kiểm tra lại. Thử phản ứng sinh hóa: - Cấy chuyển từng khuẩn lạc đã chọn vào các môi trường TSI, thạch Ure , môi trường Lysin decacboxyl, môi trường VP, Trypton – Tryptonphan và NaCl 0,85%, ủ ở 37oC/ 24h để thử các tính chất sau: + Lên men đường glucose, saccarose, lactose + Khả năng sinh H2S + Khả năng phân giải Ure + Phát hiện – galactosidase + Phản ứng VP + Khả năng sinh Indol Thử khẳng định với kháng huyết thanh đặc hiệu: LISTERIOSIS MONOCYTOGENES LISTERIOSIS Triệu chứng: Giống triệu chứng ban đầu của cúm Nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm não, nhiễm trùng tử cung và cổ tử cung ở người có thai LISTERIA VÀ LISTERIOSIS - Là bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc;Có một vài hội chứng ở những người nhạy cảm - Thời gian ủ bệnh:7-60 ngày - Thời gian mắc bệnh có thể ngắn hoặc dài - Hầu hết là ca mắc lẻ tẻ , đôi khi trở thành vụ ngộ độc - Không xâm nhập dạ dày ruột:nhẹ, giống cúm, không có đặc điểm rõ ràng - Xâm nhập dạ dày ruột:nhiễm trùng huyết, viêm não -màng não, xảy thai,đẻ non, viêm màng trong tim, viêm khớp,viêm tủy xương, viêm màng phổi, viêm phúc mạc - Thực phẩm nguy cơ: xúc xích không xử lý nhiệt, thịt hộp, pho mat mềm, xà lách trộn sữa tươi, kem, rau, hải sản - Kiểm soát: vệ sinh chế biến, ngăn ngừa ô nhiễm chéo, chế biến TP đúng cách… NƠI CƯ TRÚ - Cư trú tự nhiên trong đất, nước, nước thải, thực vật thối rữa, thức ăn gia súc ủ - Tồn tại trong môi trường cao hơn các vi khuẩn không sinh bào tử khác - Có thể cư trú, tồn tại và nhân lên trong môi trường; gắn và hình thành màng sinh học NGUỒN LÂY NHIỄM Môi trường, dụng cụ, thiết bị, sản xuất, bao gói, thực hành vệ sinh người chế biến… Nguồn lây nhiễm chính:quá trình sản xuất bị ô nhiễm ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN Qua đường tiêu hóa Nhiều động vật mang vi khuẩn nhưng không có triệu chứng Nguy cơ cao: các loại thực phẩm chưa chế biến như sữa tươi, thịt, cá và các loại đã chế biến như cá hun khói, phomat, xúc xích PHÁT TRIỂN Có khả năng chịu đựng cao với tác động của nhiệt độ cao, lạnh, khô so với các vi sinh vật không sinh bào tử khác • Phát triển được ở nhiệt độ bảo quản lạnh • Có thể hình thành màng sinh học và tạo thành chỗ náu NUÔI CẤY Hiếu khí Nhiệt độ phát triển: -0.4 to 45°C pH 4.39 – 9.4 Nước hoạt tính ≥ 0.92 Nồng độ muối ≤ 10% PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENES Nguyên lý phương pháp Phát hiện những vi sinh vật tạo thành những khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chọn lọc, có những đặc tính về hình thái, sinh lý, sinh hoá đặc trưng phù hợp Phạm vi áp dụng: Phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm và thức ăn gia súc. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh, các thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử: - Tủ sấy 180 – 200°C - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 25 ±1°C, 30 ±1°C, 35 ±1°C hoặc 37 ±1°C - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết, dung tích 1,10 ml - Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 47 ± 2°C - Que cấy platinum/iridum hoặc nikel/chromium, đường kính 3 mm. - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm - pH met, chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25°C. - Xy lanh dung tích 50 ml tới 1000 ml - Bình nuôi cấy kỵ khí. - Túi tạo khí trường vi hiếu khí: 5% - 12% CO2 , 5 – 15% O2, 75 % N2 MÔI TRƯỜNG – THUỐC THỬ Môi trường thạch Oxford Môi trường thạch Palcam Canh thang Fraser Thạch Trypton soya yeast extract Canh thang Trypton soya yeast extract Môi trường thạch máu Thạch di động Canh thang Rhamnose và Xylose Dung dịch hydrogen peroxit Dung dịch đệm phosphat CÁCH TIẾN HÀNH Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu: - Thực phẩm lỏng: Hút 25 ml mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều. - Thực phẩm dạng khác: Cân 25 g mẫu thử cho vào bình có sẵn 225 ml canh thang Fraser (Đậm độ 10-1). Lắc đều. Nuôi cấy: Tăng sinh lần 1: Ủ ấm dung dịch huyền phù ban đầu (Đậm độ 10-1) ở 30°C trong 24 h ± 2 h Lưu ý: Dung dịch huyền phù có thể xuất hiện màu đen trong quá trình ủ ấm Tăng sinh lần 2: Dùng pipet chuyển 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu đã ủ ấm ở 30°C trong 24h ± 2h vào ống nghiệm sẵn có 10 ml môi trường tăng sinh Fraser, ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2h Nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc - Dùng que cấy lấy một ăng môi trường tăng sinh Fraser đã ủ ấm ở 35 - 37°C trong 48 h ± 2 h cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc sao cho các khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có thể dễ dàng quan sát hình thái: - Thạch đĩa Oxford: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37C từ 18 – 24h trong điều kiện hiếu khí. - Thạch đĩa PALCAM: ủ ấm ở 30°C, 35°C hoặc 37°C từ 18 – 24h trong điều kiện vi hiếu khí. - Lặp lại quá trình trên với hai đĩa thạch chọn lọc ( Oxford agar và PALCAM agar) bằng phương pháp cấy láng, sử dụng que cấy gạt. Nhận định khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc: Trên thạch đĩa Oxford: - Khuẩn lạc Listeria spp điển hình sau 24 h nuôi cấy thường nhỏ, đường kính khoảng 1 mm, màu xám có quầng đen bao quanh. Sau 48 h khuẩn lạc sẫm màu hơn, có thể hơi lục sáng, đường kính khoảng 2 mm, có quầng đen và lõm ở tâm. Trên thạch đĩa PALCAM: - Những đĩa nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí, sau thời gian ủ ấm bỏ ra ngoài 1 h để môi trường trở lại màu hồng hoặc tím đỏ. Sau 24 h, khuẩn lạc Listeria spp thường nhỏ hoặc rất nhỏ, màu hơi lục hoặc vàng lục, đường kính khoảng 1,5 - 2 mm, có quầng đen bao quanh, đôi khi có tâm đen. Sau 48 h, khuẩn lạc Listeria spp có màu xanh lá cây, đường kính khoảng 1,5 – 2 mm, tâm lõm, có quầng đen bao quanh. Thử khẳng định: Chọn khuẩn lạc Trên mỗi đĩa thạch chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ để xác định Listeria spp. Nếu trên một đĩa, số khuẩn lạc nghi ngờ ít hơn 5 thì chọn tất cả số khuẩn lạc để thử khẳng định. Xác định trên môi trường thạch Tryptone soya yeast extract Dùng que cấy cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ lên thạch đĩa Tryptone soya yeast extract sao cho các khuẩn lạc có thể mọc riêng rẽ. Ủ ấm ở 300C, 350C hoặc 370C từ 18 – 24 h. Khuẩn lạc Listeria spp trên môi trường Tryptone soya yeast extract có đường kính từ 1 – 2 mm, lồi, màu nhạt, đục, bờ đều. Thử tính chất SVHH: Catalase (+) Di động: hình ô hướng lên trên ở 25°C/48h Trực khuẩn Gr (+) Phân giải hồng cầu cừu dạng beta ở 35 – 37°C/ 24h Lên men đường Rhamnose và Xylose CAMP test (+) CAMP Test - Là tên viết tắt của ba tác giả: Christie, Atkins, and Munch-Petersen) phát hiện ra Streptococci nhóm B có một loại protein gọi là yếu tố CAMP hoặc “Protein B”, protein này có khả năng tương tác với beta – hemolysin được sinh ra bởi Staphylococcus aureus, kết quả là làm tăng kích thước vùng tan máu - Trong số các loài Listeria, có một vài loài có phản ứng CAMP dương tính nhưng chỉ có L. monocytogenes gây bệnh ở người - Trong số các loài Listeria, có một vài loài có phản ứng CAMP dương tính nhưng chỉ có L. monocytogenes gây bệnh ở người - Phản ứng CAMP được thực hiện trên thạch máu cừu với các chủng không tan máu và tan máu beta - Độ sâu của đĩa thạch máu dùng cho phản ứng CAMP vào khoảng 1.5mm - Các chủng vi khuẩn sử dụng cho phản ứng CAMP là L. ivanovii, Rhodococcus equi, S. aureus. - Kết quả dương tính khi quan sát thấy vùng tan máu hình mũi tên ở khu vực giáp giới giữa đường cấy Listeria monocytogenes và chủng vi khuẩn tan máu beta. Sơ đồ nuôi cấy trên thạch máu. Đường thẳng đứng R: nuôi cấy R. equi. Đườn thẳng đứng S: nuôi cấy S. aureus. Đường thẳng ngang là các nuôi cấy thử nghiệm. Vùng gạch bóng là vùng phân giải hồng cầu. Vùng có đường chấm chấm là ảnh hưởng do nuôi cấy S. aureus Narrow band of haemplysis: Dải mũi tên biểu thị phân giải hồng cầu kiểu ß No haemolysis:Không phân giải hồng cầu Wide band of haemolysis: Dải rộng do phân giải hồng cầu kiểu ß CAMPYLOBACTER PHÂN LOẠI - Thuộc họ Campylobacteriaceae - Có 5 loài Campylobacter thường gặp. C. sputorum, biovar sputorum – là một phần của hệ VSV miệng ở người C. fetus, ssp. fetus C. fetus, ssp. venerealis C. jejuni C. coli Kích thước quá nhỏ nên có thể đi qua lọc vi khuẩn Là nguyên nhân phổ biến gây viêm dạ dày ruột do vi khuẩn ở các nước phát triển Riêng ở Mỹ:~2.5 million cas mắc/năm Các vụ ngộ độc thực phẩm thường liên quan với tiêu thụ gia cầm, thịt và sữa không thanh trùng 1998–2002: 61 vụ với 1,440 người mắc Vụ lớn nhất do nguồn nước ô nhiễm ~3,000 cas Vụ lớn nhất do sữa ô nhiễm ~1,600 cas ở California 2006 ĐẶC ĐIỂM Hình dấu phảy, chữ S hoặc hình cánh chim, Gram âm. Di động bằng roi ở một đầu Không có vỏ và bào tử Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí NƠI CƯ TRÚ 3 loài Campylobacter C. jejuni, C. coli,và C. lari chiếm 99% nguyên nhân gây bênh ở người Campylobacter thường cư trú ở đường ruột, ống mật của động vật nuôi, đặc biệt là gà, trâu bò, và lợn (nhiễm trùng không triệu chứng) ĐƯỜNG LÂY TRUYỀN Phân Thực phẩm nguy cơ cao: thịt, sữa NUÔI CẤY Điều kiện vi hiếu khí (5% O2) và (10% CO2) Nhiệt độ 42℃ Trên các môi trường chọn lọc Hai dạng khuẩn lạc Ướt, lan Khô và lồi Sau 48 giờ nuôi cấy có thể xuất hiện khuẩn lạc nhỏ, trong mờ ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG Hai loại độc tố: - Enterotoxin - Endotoxin Triệu chứng: - Viêm dạ dày ruột: C.jejuni, C.coli - Nhiễm trùng: C.fetus KHẢ NĂNG GÂY BỆNH Ở NGƯỜI Thường gây tiêu chảy ở trẻ em 90% do C.jejuni và C.coli Liều gây bệnh thấp Thời gian ủ bệnh: 2 – 5 ngày, đôi khi có thể tới 10 ngày KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN Dễ chết ở điều kiện khô, lạnh và trên 48oC Phát triển được ở pH 4,9 Phát triển tốt ở pH 5,5 – 8,0 Phát triển tối ưu ở pH 6,5 – 7,5 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Nguyên lý phương pháp Phân lập và xác định Campylobacter nuôi cấy trên môi trường chọn lọc trong khí trường vi hiếu khí ở 420C bằng các thử nghiệm sinh hoá học đặc trưng. Phạm vi áp dụng Thực phẩm và các sản phẩm thực phẩm. Tài liệu viện dẫn 52 TCN – TQTP 0014 : 2005 THIẾT BỊ-DỤNG CỤ - Máy đồng nhất mẫu, 10.000 – 20.000 vòng/phút - Tủ sấy 180 – 200oC - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 42 ±1oC - Đĩa petri đường kính 90 – 100ml - Bình nuôi cấy kị khí và túi tạo khí trường vi hiếu khí - Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml - Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm pH met hoặc giấy đo pH - Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc - Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin. Que cấy thuỷ tinh HÓA CHẤT-MÔI TRƯỜNG - Canh thang Preston - Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholate - Thạch 5%máu thỏ (hoặc bò) - Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở - Thạch dinh dưỡng - Dung dịch Oxy già (H2O2 3%) - Dung dịch Natri hippurat 1% - Dung dịch Ninhydrin 3,5% - Dung dịch thử Oxydase - Bộ thuốc nhuộm Gram CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH * Tăng sinh trong canh thang Preston Cân 25 g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc dập bằng máy dập mẫu ở điều kiện vô trùng trong canh thang tăng sinh Preston cho tới khi đươc thể đồng nhất. Sau đó cho vào bình kỵ khí và tạo khí trường vi hiếu khí bằng túi tạo khí (chuẩn bị theo hướng dẫn trên túi tạo khí), đậy chặt nắp bình và ủ ấm ở 42oC từ 24 – 48 * Cấy chuyển lên môi trường thạch chọn lọc CCD Cấy lên hai đĩa thạch chọn lọc CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng sinh chọn lọc, ủ trong điều kiện vi hiếu khí như bước trên, ủ ấm 42oC từ 24 – 48 giờ để nhận dạng khuẩn lạc nghi ngờ. Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu từ xám kem nhạt đến xám xanh. * Cấy chuyển lên môi trường thạch máu Từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch CCD, dùng que cấy ria sang môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ. Ủ ấm trong điều kiện vi hiếu khí ở 42oC/24 giờ để thử khẳng định bằng các phản ứng sinh hoá. * T hử khẳng định: Bằng khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ cấy trên môi trường thạch máu Hình thể vi khuẩn - Nhuộm Gram và soi trên kính hiển vi xác định hình thể vi khuẩn. Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt màu đỏ), có hình lượn sóng hoặc hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để quá 48 h và có sự tiếp xúc với oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu. Phản ứng Catalase - Nhỏ một giọt H2O2 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc đặt vào giữa giọt H2O2. Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính. Phản ứng Oxydase - Đặt một tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính. Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vô trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu. - Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat (phân biệt Campylobacter jejuni với các loài Campylobacter khác) - Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào ống nhựa 2 ml đã có sẵn dung dịch Natri hippurat 1% và nghiền đều cho đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở 37oC/2 giờ. Sau đó lấy ra cho từ từ 200µl dung dịch Ninhydrin 3,5% bằng cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm lần nữa ở 37oC trong 10 phút và lấy ra đọc kết quả. - Phản ứng dương tính: xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh. - Phản ứng âm tính: không màu hoặc màu xám. TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH Gram âm, hình lượn sóng hoặc hình cánh chim Catalase dương Oxydase dương BÁO CÁO KẾT QUẢ Nêu rõ phương pháp đã dùng và có hay không có Campylobacter trong 25 gam sản phẩm kiểm nghiệm, các thông tin về mẫu thử cũng như các điều kiện khác với tiêu chuẩn này. TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ VKHK -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 37±10C - 48-72h Kết quả tính theo số KL Pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường 48 h đếm sơ bộ 72h đếm chính thức Có hay không các đĩa thỏa mãn yêu cầu Chọn đĩa 150 – 300 KL của hai đậm độ liên tiếp để tính KQ theo công thức: N = 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml Tất cả các khuẩn lạc mọc hiếu khí(kể cả men, mốc) Chọn đĩa 15 – 300 KL Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy đậm độ thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ Không có dạng khuẩn lạc điển hình nhất định Chọn hai đậm độ liên tiếp để tính kết quả Tổng KL ở đậm độ nguyên hoặc 10-1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Lật ngược đĩa Tất cả các đĩa không có KL mọc: < 1VSVHK/ml SP lỏng <1x1/d VSVHK/g SP dạng khác PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA TỔNG SỐ BT MEN MỐC -KT đổ đĩa -Ủ hiếu khí 28±10C 5 – 7 ngày Kết quả tính theo số khóm nấm -Nấm men; pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường -TSBT NM-NM hoặc tổng số nấm mốc: sử dụng nước pha loãng có thạch Phát triển hiếu khí 3 ngày đọc kết quả sơ bộ (72h) 5 ngày đọc chính thức (120h) Có hay không các đĩa thỏa mãn yêu cầu Giá trị cao/giá trị thấp ≤ 2 tính theo công thức: N = 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ Khóm nấm mốc có bông khí sinh, màu sắc và đường kính khác nhau, viền mép không đều, tâm thường có màu đậm Chọn đĩa có từ 15-150 KL nấm men Chọn đĩa có 5 – 50 KL nấm mốc Giá trị cao/giá trị thấp >2 lấy đậm độ thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng Không lât ngược đĩa Khuẩn lạc nấm men thường bóng, lối, viền mép đều. Dạng bơ Màu săc đồng đều, không phân biệt tâm, có thể kem, hồng hoặc đỏ Chọn hai đậm độ liên tiếp để tính kết quả Tổng KL ở đậm độ nguyên hoặc 10-1 <15: lấy KQ trung bình cộng các đĩa ở hai đậm độ được chọn Tất cả các đĩa không có KL mọc: < 1 BTNM NM/ml SP lỏng <1x1/d BTNM NM/g SP dạng khác PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất(MPN) Định lượng VSV lên men Lactose sinh khí trong MT tăng sinh chọn lọc ở 300 C và phú hợp trong phép thử khẳng định Pha loãng: Đệm pep ton, pepton muối LST: các ống đục có sinh khí Độ pha loãng cuối cùng phải cho kết quả âm tính Chọn tổ hợp 3 ống theo các trường hợp để tính kêt quả Từ tổ hợp được chọn, tra bảng để ra chỉ số MPN Đậm độ kép: chia chỉ số MPN cho 10 Đậm độ đơn: nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng 10g(10ml) + 90 ml dung dịch pha loãng BGBL: các ống đục có sinh khí Trường hợp 1: có ít nhất một đậm độ cho KQ 3 ống dương tính Chọn độ pha loãng cao nhất cho kết quả 3 ống (+) và hai đậm độ cao hơn liền kề 3 3 2 1 0 LST kép: 3 ống : 10 ml MT; 10 ml mẫu Trường hợp 2: không đậm độ nào cho KQ 3 ống dương tính Chọn 3 đậm độ cao nhất trong dãy pha loãng trong đó ít nhất có 1 kết quả (+) 2 2 1 1 0 LST đơn: 3 đậm độ 3 ống 1 đậmđộ 1ml/ống Trường hợp đặc biệt : Trong dãy được chọn theo (1) có hai đậm độ không cho kết quả (+) Chọn độ pha loãng thấp nhất cho KQ (+) và hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp 3 3 0 0 0 Ủ 300C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt : Trong dãy được chọn theo (2) có hai đậm độ không cho kết quả (+) Chọn độ pha loãng thấp nhất cho KQ (+) và hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp 2 2 0 1 0 Từ các ống (+) cấy sang BGBL, 1 ăng/ống Ủ 300C/24 - 48± 2h Trường hợp đặc biệt : các ống (+) chỉ thấy ở đậm độ pha loãng đầu Chọn ba độ pha loãng đầu tiên để tính kết quả 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS Phương pháp hộp trải Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT chọn lọc và có phản ứng đông huyết tương (+) ở 35-370C Pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường Phát triển hiếu khí Sau 24h xem sơ bộ 48h đọc kết quả Tính kết quả theo các KL điển hình/không điển hình có phản ứng đông HT(+) Tính số S.aureus đông huyết tương đã nhận dạng trên mỗi đĩa Bc Bnc a= Cc + Cnc Ac Anc 25g(25ml) + 225 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 0,1 ml KL điển hình: đen, bóng, lồi, đường kính 1 – 1,5 mm, có vòng đục sát KL và vòng trong phía ngoài -Có thể có 3 trường hợp: tất cả KL được chọn là KĐH, có cả ĐH và KĐH, chỉ có KĐH trên cùng một đĩa Hoặc: Tính số giá trị % số Kl ĐH hoặc KĐH có đông HT(+) trên tổng số KL được chọn, sau đó nhân với số đếm được trên đĩa Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ. Để yên 15 phút, sau đó lật ngược đĩa KL không điển hình: không có vòng trong hoặc khó phân biệt vòng đục Chỉ tính những đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc Nếu số KL cho KQ đông HT(+) ≥ 80% tổng số KL đã đếm thì toàn bộ số KL trên đĩa được coi là S.aureus Ủ 35 – 370C/24-48h Đông HT(+) Tính sô S.aureus Coaguase(+) trong mẫu thử Σa N = V(n1+ 0,1 n2)d Chọn 5 KL điển hình/không điển hình/đĩa. Mỗi KL cấy sang một ống BHI Ủ 35 – 370C/20-24h V: thể tích cấy/đĩa(ml) d: độ pha loãng của dung dịch được chọn thứ nhất 0,1ml BHI + 0,3ml HT thỏ. Ủ 35 – 370C/4-6h Nếu không đông để qua đêm Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa, biểu diễn dưới dạng thập phân PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS Phương pháp hộp trải Định lượng VSV có khả năng phân giải Lecithin lòng đỏ trứng gà trên MT thạch MYP chọn lọc khi ủ ở 300C /24h và có phản ứng VSHH phù hợp trong phép thử khẳng định Pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường Phát triển hiếu khí Sau 24h đọc kết quả Tính kết quả theo các KL điển hình có các tính chất SVHH điển hình trong phép thử khẳng định Tính kết quả tương tự như tính kết quả S.aureus 25g(25ml) + 225 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 0,1 ml KL điển hình: dẹt, xù xì (dạng R) đường kính 2-3mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục. Nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ. Để yên 15 phút, sau đó lật ngược đĩa Ủ 300C/24h Gr(+), có bào tử Lên men Glucose kỵ khí Lên men manit VP(+) Di động (+) Tan máu ß (+) Nitrit (+) Chỉ tính những đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc Chọn 5 KL điển hình/không điển hình/đĩa. Mỗi KL cấy sang một ống thạch dinh dưỡng Ủ 300C/24h Thử các tính chất SVHH ở 350C PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA ĐỊNH LƯỢNG Cl.PERFRINGENS Phương pháp hộp đổ Định lượng VSV tạo khuẩn lạc đen khi nuôi cấy kỵ khí trên môi trường TSC ở 370C/20h và có tính chất SVHH phù hợp trong phép thử khẳng định Pha loãng bằng các dung dịch pha loãng thông thường Phát triển kỵ khí Khuẩn lạc điển hình: tròn đều, màu đen trên TSC, đường kính ≥ 3 mm Chọn các đĩa có ≤ 150 KL và tính số KLĐH theo các trường hợp bên dưới CHÚ Ý: số đếm này ghi lại trước khi thử khẳng định 25g (25ml) + 225 ml dung dịch pha loãng Mỗi đậm độ cấy 2 đĩa Mỗi đĩa 1 ml-KT đổ đĩa Sau khi thạch đông đổ tiếp 4 ml thạch màng TSC Lật ngược đĩa Ủ kỵ khí ở 35 – 370C /20h ±2h Tính trung bình cộng khi: - 2 đĩa cùng một đậm độ ≤150 KLĐH -4 đĩa của hai đậm độ liên tiếp có từ 15-150KLĐH -Nếu giá trị cao/thấp của cùng một đậm độ >2, lấy giá trị trung bình thấp hơn - Nếu không đếm được, chuyển đậm độ cao hơn kế tiếp Sau khi thử khẳng định, tính kết quả như với S.aureus để ra số Cl.perfringens trong mẫu thử CHÚ Ý: KQ chỉ để hai chữ số có nghĩa: -Nếu số đó<100, làm tròn bằng bội số của 5 gần nhất -Nếu số đó >100 và tận cùng bằng 5: làm tròn bằng bội số của 20 gần nhất - Nếu số đó <100 nhưng không tận cùng bằng 5: làm tròn bằng bội số của 10 gần nhất Thử khẳng định SH: 5 KL/đĩa Khử nitrat-nitrit Lên men đường lactose Hóa lỏng Gelatin Di động Gr(+), sinh bào tử Nitrit(+) Lactose(+) Gelatin(+) Di động(-) PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SHIGELLA Phương pháp định tính Xác định các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có các phản ứng sinh hoá và huyết thanh đặc trưng trong phép thử khẳng định Sử dụng canh thang Shigella hoặc Trypton soya có bổ sung 0,5 μg/ml novobiocin Phát triển hiếu khí Có hay không có Shigella Trả lời KQ Có mặt hay không có mặt Shigella /25g (25ml) mẫu thử 25g(25ml) + 225 ml CT Shigella hoặc Trypton soya có bổ sung 0,5 μg/ml novobiocin Ủ ở 41,50C/ 16-24h Cấy chuyển lên thạch chọn lọc: Macconkey, XLD hoặc Hektoen enteric Ủ ở 370C ± 10C/20 - 24h KLĐH: -Macconkey: KL nâu đỏ, trong mờ, không lên men lactose -XLD: KL trong mờ, tâm đỏ, không lên men Lactose -HE: KL ướt, xanh lá cây, có thể lồi (Sh.sonnei) Chọn 5 KLĐH/đĩa cấy chuyển lên thạch dinh dưỡng, ủ 370C ± 10C/18 - 24h để thử SVHH và ngưng kết KHTĐH O và K -Lên men dường: Glucose(+); H2S (-) -LDC(-) -ADH(-) -Ure (-) -Indol (-) -Di động (-) -Oxydase (-) PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SALMONELLA Phương pháp định tính Xác định các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc, có các phản ứng sinh hoá và huyết thanh đặc trưng trong phép thử khẳng định Dùng nước đệm pepton để tiền tăng sinh Dùng RV và selenit cystin cho bước tăng sinh chọn lọc Phát triển hiếu khí Có hay không có Salmonella Trả lời KQ Có mặt hay không có mặt Salmonella /25g (25ml) mẫu thử Tiền tăng sinh: 25g (25ml) + 225 ml đệm pepton Ủ 35-370C/16-20h Tăng sinh chọn lọc: -0,1ml + 10ml RV. Ủ 420C/24h -10ml +100ml selenit cystin. Ủ 35-370C/24 và 48h Từ RV cấy lên thạch đĩa Hektoen enteric. Ủ ở 35-370C/18 – 24h KLĐH trên thạch Hektoen enteric: dạng S, trong, màu xanh, có tâm đen hoặc không Từ selenit cystin, cấy lên thạch đỏ phenol lục sáng, Chọn 5 KLĐH/đĩa. Cấy lên thạh dinh dưỡng. Ủ 35-370C/18 – 24h KLĐH trên thạch đỏ phenol lục sáng: dạng S, đục, thay đổi màu MT từ hồng sang đỏ Chọn 5 KLĐH/đĩa. Cấy lên thạh dinh dưỡng. Ủ 35-370C/18 – 24h để thử SVHH Làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu O và H Lên men đường glucose(+) ,lactose (-) - H2S (+) -Phân giải Ure (-) -Phản ứng VP (-) - Indol (-) -ONPG(-), LDC(+) Ngưng kết KHT O(+), KHT H(+) PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH L.MONOCYTOGENES Phương pháp định tính Phát hiện những VSV tạo thành khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chọn lọc, có những đặc tính về hình thái, TC sinh hoá phù hợp trong phép thử khẳng định Sử dụng canh thang Fraser cho bước tăng sinh -Tăng sinh lần 1: 25g(25ml) + 225ml CT Fraser, ủ 300C/ 24h Phát triển cả trong điều kiện hiếu khí và vi hiếu khí Có hay không có L.monocytogenes Trả lời KQ Có mặt hay không có mặt L.monocytogenes /25g (25ml) mẫu thử -Tăng sinh lần 2: Cấy 1ml CT tăng sinh lần 1 vào 10 ml CT FraserỦ 35-370C/48 ±2h Cấy chuyển lên hai MT thạch chọn lọc: -Oxford: 1 đĩa ria cấy, một đĩa cấy trải, ủ ấm ở 30 0C, 35 0C hoặc 37 0C từ 18 – 24 h trong điều kiện hiếu khí Trên thạch Oxford: sau 24h KLĐH nhỏ, ĐK 1mm, màu xám, có quầng đen bao quanh. Sau 48h, KL sẫm màu, hoặc lục sáng, ĐK 2mm, có quầng đen, tâm lõm -PALCAM: một đĩa ria cấy, một đĩa cấy trải, ủ ấm ở 300 C, 35 0C hoặc 37 0C từ 18 – 24 h trong điều kiện vi hiếu khí. Trên thạch PALCAM: sau 24h KLĐH nhỏ, ĐK 1,5-2 mm, màu lục hoặc vàng lục, có quầng đen bao quanh, đôi khi tâm đen. Sau 48h, KL xanh lá cây, ĐK 1,5 - 2mm, có quầng đen, tâm lõm Từ mỗi đĩa chọn 5 KLĐH cấy lên MT thạch TSYE, ủ 30 0C, 35 0C hoặc 37 0C từ 18 – 24 h để thử tính chất SVHH -TK Gram(+) -Catalase (+) -Di động hình ô ở 250C/48h -Tan máu cừu dạng ß Rhamnose(+),Xylose(+) - CAMP test(+) PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN LÝ TIẾN HÀNH CÁC TÍNHCHẤT ĐIỂN HÌNH TRÊN MTCL NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ TÍNH KẾT QỦA PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER Phương pháp định tính Sử dụng canh thang Preston để tăng sinh Phát triển trong điều kiện vi hiếu khí Có hay không có Campylobacter Trả lời KQ Có mặt hay không có mặt Campylobacter /25g (25ml) mẫu thử 25g +225ml Preston Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h KLĐH dẹt, bóng, xám kem nhạt đến xám xanh, thường lan Cấy chuyển lên thạch chọn lọc CCD Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h Cấy chuyến KLĐH lên thạch máu và thạch dinh dưỡng. Ủ vi hiếu khí/420C/24 – 48h để thử các tính chất SVHH -VK Gram(-) -Hình lượn sóng, cánh chim… -Catalase (+) -Oxydase(+) - Thủy phân Hippurate (+): C.jejuni BẢNG CHỈ SỐ MPN CHO DÃY 3 ỐNG Số ống dương tính MPN cho 1g hoặc 1ml Giới hạn tin cậy (95%) 1 : 10 1 : 100 1 : 1000 Thấp nhất Cao nhất 0 0 0 < 3 0 0 1 3 < 0.5 9 0 1 0 3 < 0.5 13 1 0 0 4 < 0.5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 40 150 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 3 3 3 > 2400 MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 1 TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC 6 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) 14 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18 ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS 26 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS (C.WELCHII) 29 SHIGELLA SPP 34 SALMONELLA 40 LISTERIOSIS MONOCYTOGENES 43 CAMPYLOBACTER 49 TỔNG KẾT VI SINH THỰC PHẨM II 54 BẢNG CHỈ SỐ MPN CHO DÃY 3 ỐNG 64