Một số kết quả nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học trong lá cây sổ (Dillenia indica L.)

Đinh Thúy Vân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 121 - 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 121 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BAN ĐẦU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG LÁ CÂY SỔ (DILLENIA INDICA L.) Đinh Thúy Vân, Nguyễn Thị Mai, Phạm Văn Thỉnh* Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN TÓM TẮT Cây sổ có tên khoa học là Dillenia indica mọc phổ biến ở vùng núi nước ta. Quả sổ dùng làm thức ăn, làm mứt. Theo Đông y, lá và vỏ cây sổ dùng để làm thuốc nam chữa bệnh. Bằng các phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagel đã phân lập được từ cặn chiết n-hexan của lá cây sổ (Dillenia indica) hai steroit thuộc lớp phytosterol và một tritecpenoit , còn từ cặn chiết etyl axetat cũng phân lập được hai flavonoit. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ như ESI-MS, FT-IR, NMR là stigmatsterol; β-sitosterolglucozit, tritecpen là 3β- hidroxy-lup-20(30)-en-28-oic còn hai flavonoit là 3,5-đihiđroy-4’-metoxy-flavon-7-O-L-glucozyt và 5,7,4 ’ -trihyđroxy-6-O-L-glucuzyl-6”-oic-flavon. Từ khóa: Dillenia indica, stigmatsterol, β-sitosterol, flavonoit, 3,5-đihiđroy-4’metoxy-flavon-7-O- L-glucosyllavon; betulinic, 5,7,4 ’ -trihyđroxy-6-O-L-glucusyl-6”-oic-flavon. MỞ ĐẦU Cây sổ còn gọi là cây sổ bà, cây thiên biên, người Thái gọi là cây co má sản, có tên khoa học Dillenia indica thuộc họ sổ (Dilleniaceae). Cây sổ là cây thân gỗ cao tới 20m, vỏ thân xù xì có những vết sẹo của cuống lá hình lưỡi liềm, lá to hình bầu dục hai đầu nhọn, mép lá có răng cưa rất đều, phiến lá dài 13-30cm, rộng 5-10cm, có từ 15-23 đôi gân nổi rất đều rõ ở mặt dưới. Hoa to, quả hình cầu đường kính 10cm, mang đài tồn tại, phát triển thành bản dày mọng nước, vị chua, ăn được như chanh. Mùa hoa tháng 3-5, mùa quả tháng 8-10. Cây sổ mọc hoang ở vùng rừng núi các tỉnh phía Bắc nước ta, đặc biệt ở các bờ suối. Phần các lá đài của quả là phần ăn được, được thu hoạch để ăn thay các quả chua, có thể dùng để làm mứt, pha nước uống. Theo Đông y, lá của cây sổ được thu hái phơi khô dùng làm thuốc giải độc chữa ho, sốt, phù thũng, đầy bụng. Vỏ cây sổ sấy khô, đun nước uống có tác dụng chữa sỏi thận [1]. Thành phần hóa học của cây sổ Việt Nam còn ít được nghiên cứu. Nghiên cứu bước đầu cho biết quả sổ có chứa các axit hữu cơ, vỏ cây sổ có chứa các phytosterol, các tritecpenoit [2]. Cây sổ có nhiều công dụng cả trong lĩnh vực thực phẩm và Đông y, nhưng cho đến nay ở nước ta có rất ít các công trình  Tel: 0912 132563, Email: phamvanthinhsptn@gmail.com nghiên cứu chúng. Bài báo này chúng tôi sẽ thông báo kết quả thành phần một số tritecpenoit có trong lá cây sổ. THỰC NGHIỆM Nguyên liệu 5kg lá sổ mọc bên bờ suối ở huyện Hàm Yên, Tuyên Quang được TS. Lê Ngọc Công Khoa sinh trường Đại học sư phạm thẩm định là loài Dillenia indica L. Mẫu tươi được diệt men bằng cách sấy nóng ở 1100C trong 10 phút sau đó sấy khô ở nhiệt độ 40-500C đến khối lượng không đổi thu được 1150 gam. Phương pháp nghiên cứu. Mẫu thực vật khô được nghiền nhỏ thành bột, ngâm chiết bằng dung môi n-hexan ở nhiệt độ phòng (5 lần, mỗi lần 24 giờ). Thu hồi toàn bộ dung môi n-hexan, làm khô bằng natri sunfat khan, cất cô dưới áp suất giảm (để thu hồi dung môi) đến cặn khô (35g). Phần không tan trong n-hexan tiếp tục ngâm chiết bằng etyl axetat ở nhiệt độ phòng (5 lần, mỗi lần 24 giờ). Phần dung dịch etyl axetat cũng được thu gom và chế biến tương tự phần n-hexan, thu được cặn khô (42g). Phần nguyên liệu không tan trong etyl axetat tiếp tục được ngâm chiết trong metanol và cũng thu chất như cách thức trên được (48g). Đinh Thúy Vân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 121 - 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 122 Phân lập các chất có độ phân cực gần nhau trong các phần cặn để thu các chất tinh khiết được tiến hành theo phương pháp sắc kí cột và rửa nhanh lại bằng dung môi thích hợp. Từ cặn n-hexan thu được 2 chất tinh khiết kí hiệu là chất HD-1 (22mg) và chất HD-2 (28mg), còn từ cặn etyl axetat thu được ba chất tinh khiết khác kí hiệu là chất ED-1, ED-2 và ED-3. Thiết bị nghiên cứu Để phân lập các chất có trong lá sổ chúng tôi dùng sắc kí cột nhồi silicagel (Kieselgel 64- 200 mesh). Các quá trình chiết dùng hóa chất kĩ thuật, các quá trình phân lập và tinh chế dùng hóa chất tinh khiết của hãng Meck. Sản phẩm tinh khiết được xác định điểm chảy bằng máy Electrothermal IA-9200 (Anh), Phổ IR được ghi trên máy IMPACT 410 sử dụng đĩa nén tinh thể KBr. Phổ ESI-MS đo trên máy HP-1100 LS/MS Trap. Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR và TMS được sử dụng là chất nội chuẩn. Sắc kí cột (CC) sử dụng chất nhồi Silicagel (Kieselgel 60, 70 - 230 mesh và 230 - 400 mesh, Merck). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ các phân đoạn dịch chiết n-hexan và etylaxetat của bột khô lá cây sổ (1,0 kg), bằng các phương pháp ngâm chiết, phân lập các chất trên sắc ký cột với chất nhồi Silicagel rửa giải bằng các hệ dung môi thích hợp chúng tôi đã thu được 5 chất sạch. Hợp chất HD-1 thu được từ phần cặn n- hexan là chất rắn, sau khi kết tinh lại trong metanol thu được tinh thể hình kim không màu (29 mg), điểm chảy 138-140 0C. IR (νmax, cm -1): 3431,5 (dao động hóa trị OH), 2931,3 (dao động hóa trị CH); 1647,2 (C=C); EI-MS (m/z): 414[M] + . 1 H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,51 (1H, m, H-3); 5,31 (1H, dd, J=5 và 2 Hz, H-6); 1,01 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, d, J = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, d, J = 7,1Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 6,6Hz, H- 29); 0,81 (3H, d, J = 6,6Hz, H-28); 0,68 (3H, s, H-19). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C-10); 21,1 (C- 11); 39,8 (C-12); 42,3 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 11,9 (C-18); 19,4 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 33,9 (C-22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C-28); 11,9 (C-29). So sánh đối chiếu các dữ liệu về phổ và tính chất vật lí của chất HD-1 với các tạp chí đã công bố cho biết chất HD-1 chính là β-Sitosterol β-Sitosterol (HD-1) Hợp chất HD-2 là chất rắn màu trắng, sau khi kết tinh lại trong metanol thu được tinh thể hình kim, nóng chảy ở 316-3180C, dễ tan trong dung môi ít phân cực, khó tan trong nước. Phổ FT-IR cho vân hấp thụ mạnh, rộng, tù ở vùng 3400 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,37 (1H, q, J=6Hz, H- 3), 2,91 (1H, m, H-19) 4,69 (1H,d, J=2Hz, H- 29)và 4,56 (1H,m, H-29) 1,64 (3H, s, H-30) Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO, TMS, δ ppm) cho thấy 37,59 (t, C-1); 27,12 (t, C-2); 76,79 (d, C-3); 39,92 (t, C-4); 54,90 (d, C-5); 17,94 (t, C-6); 33,92 (t, C-7); 40,24 (d, C-8); 49,94 (d, C-9); 38,27 (s, C-10); 20,45 (t, C-11); 25,07 (t, C-12); 38,46 (d, C-13); 41,98 (s, C- 14); 31,70 (t, C-15); 36,32 (t, C-16); 55,39 (s, C-17); 48,55 (d, C-18); 46,58 (d, C-19); 150,26 (s, C-20); 30,10 (t, C-21); 39,00 (t, C-22); 27,78 (q, C-23); 15,70 (q, C-24); 15,90 (q, C-25); 15,74 (q, C-26); 13,36 (q, C-27); 177,17 (s, C- 28); 109,55 (, C-29) ; 18,92 (q, C-30). Các đặc trưng về phổ của chất HD-2 hoàn toàn phù hợp với các dữ liệu về phổ của axit betulinic đã được công bố trên tạp chí [2-5] CH2 H3C OH CH3 CH3 CH3 H3C CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 O Đinh Thúy Vân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 121 - 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 123 Axit betulinic (HD-2) Chất ED-1 Tinh thể hình kim không màu, điểm chảy 296-298 0C. 1H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,41 (1H, m, H3α); 5,32 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H-6); 5,11 (1H, dd, J=15Hz và 5Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J=15Hz và 5Hz, H-23); 1,00 (3H, s, H-18); 0,95 (3H, d, J21-20 = 6,4Hz, H-21); 0,85 (3H, d, J26-25 = 7,2Hz, H-26); 0,83 (3H, d, J29-27 = 6,5Hz, H-29);0,80 (3H, d, J28-27 = 6,5Hz, H- 28); 0,70 (3H, s, H-19); 4,3 (d, J1’-2’ = 7,8Hz, H-1’ phần đường); và các tín hiệu của các proton thuộc các C carbinol phần đường glucozơ có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 3,2 – 3,9 ppm. 13C-NMR (125MHz, DMSO, TMS, δ ppm): Phần đường gồm: 100,7 (d, C-1’); 73,3 (d, C-2’); 76,4 (d, C-3’); 70,1 (d, C-4’); 76,9 (d, C-5’); 61,9 (d, C-6’); Phần genin: 38,1 (t, C-1); 29,5 (t, C-2); 71,7 (d, C-3); 42,2 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 120,8 (d, C- 6); 38,2 (t, C-7); 31,5 (d, C-8); 50,3 (d, C-9); 36,0 (s, C-10); 24,4 (t, C-11); 38,2 (t, C-12); 31,5 (s, C-13); 56,1 (d, C-14); 25,6 (t, C-15); 31,1 (t, C-16); 55,4 (d, C-17); 15,0 (q, C-18); 18,6 (q, C-19); 45,1 (d, C-20); 20,8 (q, C-21); 137,5 (d, C-22); 128,7 (d, C-23); 49,5 (d, C-24); 33,2 (d, C-25); 20,5 (q, C-26); 19,3 (d, C-27); 18,8 (q, C-28); 11,7 (q, C-29). So sánh đối chiếu các dữ liệu phổ của chất ED-1 với các dữ liệu phổ của chất 3β-O- stigmasterol-glucopyranosid hoàn toàn phù hợp cho phép quy kết chất ED-1 là 3β-O-stigmasterol-glucopyranosid. O O OH HO OH HO 3β-O-stigmasterol-glucopyranosid (ED-1) Bảng 1.Độ chuyển dịch hóa học trong phổ NMR của các chất ED-2 và ED-3 Vị trí Chất ED-2 Chất ED-3 ACD (tính) δC (ppm) δH (ppm) ACD (tính) δC (ppm) δH (ppm) 2 149,54 146,94 163,65 163,27 3 136,30 136,387 102,65 101,97 6,68 s 4 173,50 176,18 182,20 181,13 5 160,50 160,37 152,90 14,34 6 99,20 98,77 6,43, d,J=2 127,90 126,06 7 162,90 162,75 157,40 157,22 8 94,80 94,41 6,82, d,J=2 94,40 100,19 6,69 s 9 156,00 156,72 152,20 152 10 108,33 104,71 104,60 100,90 1’ 123,10 123,93 121,20 121,27 2’ 129,30 129,42 8,17 dd 128,15 128,96 8,15 d 3 113,90 114,05 7,14 dd, 115,80 115,88 6,90 d 4’ 164,90 160,61 160,90 160,92 5’ 113,90 114,047 7,14; (dd, 115,80 115,88 6,90 d 6’ 129,30 129,42 8,17; dd, 128,50 128,96 8,15 d 1’’ 100,50 99,87 5,13(d,J=5) 103,50 106,46 4,67 d 2’’ 73,40 73,08 3,28 733,50 72,89 3,26 m 3’’ 76,70 76,39 3,33 75,90 76,42 3,16 m 4’’ 70,10 69,54 3,18 m 71,30 72,41 3,58 m 5’’ 77,30 77,13 3,45 m 75,50 76,01 3,60 d 6’’ 61,20 60,58 3,46 m 169,9 171,95 4’. OCH3 55,25 55,35 3,85 s Đinh Thúy Vân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 121 - 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 124 Chất ED-2 là chất rắn vô định hình (15mg) màu vàng sáng, nóng chảy và bị phân hủy ở 2820C, Phổ IR cho các vân đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O ở vùng 1665cm-1 và vân ở vùng 3405 cm -1 cho biết có dao động hóa trị của nhóm OH. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO, TMS, δ ppm): 12,77 (1H, s ) là tín hiệu đặc trưng của nhóm OH ở vị trí C-5 trong các hợp chât flavonoit vì nhóm OH tạo ra vòng với Oxi ở vị trí C-4 bằng liên kết hiđro. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho biết chất ED-2 có 22 nguyên tử cacbon bao gồm 1 nhóm CH3, 1 nhóm CH2, 11 nhóm CH và 9 cacbon bậc 4. Nguyên tử C-1 của phần đường cho δC ở 99,87ppm có thể quy kết chất ED-2 tồn tại ở dạng O-glucozit. Độ chuyển dịch hóa học của từng vị trí được trình bày ở bảng 1. Căn cứ vào kết quả ghi phổ của chất ED-2, so với phần mềm tính được do mô phỏng của chất 3,5-đihyđroxy-4’-metoxi-7-O-glucosylflavon cho thấy có sự tương thích rất tốt, với sự sai số cho phép để có thể khẳng định chât ED-2 là 3,5- đihyđroxy-4’-metoxi-7-O-glucosylflavon. O OCH3 OH O O OH O OH HO HO OH 3,5-đihyđroxy-4’-metoxi-7-O-glucosylflavon (ED-2) Chất ED-3 thu được sau phân đoạn ED-2, khi rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi etyl axetat- metanol (7:3) sau đó được kết tinh lại trong metanol thu được 16 mg chất rắn màu vàng. Phổ FT-IR cho biết có vân đặc trưng cho dao động hóa trị ở 3350cm-1 và các vân đặc trưng cho dao dộng hóa trị của liên kết C=O ở vùng 1690cm-1. Phân tích sơ bộ phổ NMR của chất ED-3 cho thấy cũng tương tự như phổ của chất ED-2 điều này cho biết chất ED-3 cũng là một flavonoit. Khi phân tích chi tiết cho thấy chất ED-3 chỉ có 21 nguyên tử cacbon gồm 11 nhóm CH và 10 cacbon bậc 4, trên phổ DEPT không thấy nhóm CH3 và nhóm CH2. Nguyên tử cacbon của nhóm CH có δC=101,98 và hiđro liên kết với nó có δH=6,68 s chính là cacbon C-3 đặc trưng cho vị trí C-3 của các flavon. Nguyên tử cacbon C-1’’ của đường cho δC=106,46 chứ ng tỏ đường liên kết với flavon bằng liên kết O-glucosyl. Phổ 13C-NMR còn có 2 cacbon cho độ chuyển dịch hóa học ở trường yếu với δC=181,13 và δC=171,95 chứng tỏ phân tử ED-3 có 2 nhóm C=O trong đó nhóm C=O có δC=181,13 là nhóm C=O tại C-4 còn nhóm C=O có δC=171,95 là nhóm C=O trong nhóm cacboxyl của axit glucuronic. Số liệu chi tiết về phổ NMR của chất ED-3 và số liệu tính toán từ phần mềm của công thức mô phỏng được trình bày ở bảng 3.1. Như vậy từ công thức giả định và phổ NMR chúng tôi ghi được của chất ED-3 có sự phù hợp cao, vì vậy chúnh tôi quy kết chất ED-3 là 5,7,4 ’ -trihidroxi-6-O-glucusyl-6 ’’ -oic- flavon. OHO OH O O OH O OHO OHHO HO 5,7,4’-trihidroxi-6-O-glucusyl-6’’-oic-flavon (ED-3) KẾT LUẬN Từ các dịch chiết bằng n-hexan và etyl axetat của lá cây sổ Dillenia indica đã phân lập được 5 chất tinh khiết, gồm 2 steroit, 1 tritecpen và 2 flavonoit, đã chứng minh được cấu trúc hóa học của chúng. Các chất flavonoit là các chất chưa có tài liệu nào công bố có trong thực vật Dillenia indica, đó cũng là các lớp chất có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng tiêu độc, kháng oxi hóa tốt.. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đỗ Tất Lợi, (1999). “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” Nxb Y học Hà Nội- 1999. [2].Phạm Văn Thỉnh, Lê Văn Kiên, (2010), Các tritecpenoit trong vỏ cây sổ Dillenia indica. Tạp chí Khoa học & Công nghệ. T.69(07), tr 125-129. [3]. Shashi B., Mahato and Asish P. Kundu (1985). 13 C- NMR spectra of pentacyclic triterpenoids –a compilation and some salient features. Phytochemistry, Vol-39 (6) p. 1417- 1574. [4]. Kamala.P, Trwari, Sariti. D, Srivastava and Santosh (1980). K. α-L-Ramnopyranozyl-3β-hidroxylup-20(29)-en-28-oic acid from the stem of Dillenia pentagina. Phytochemistry Vol-19, p 980-981. [5]. Andre Nick, Anthony D, Wright, (1995). Atinbacterial triterpenoids from Dillenia Papuana and their structure- activity relationships Phytochemistry, Vol-40 (6) p. 1691- 1695. Đinh Thúy Vân và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 121 - 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 125 SUMMARY PRIMARY STUDY ON THE CHEMICAL COMPOSITION FROM DILLENIA INDICA L. BARK Dinh Thuy Van  , Nguyen Thi Mai, Pham Van Thinh College of Education - TNU Dillenia indica grows common in our country’s moutains. According to oriental medicine, it’s leaves and bark used as Vietnamese traditional medicine treatment. By the method of column chromatography with silicagel absorbent was isolated from n-hexane extraction residue of the leaves Dillenia indica two steroid and a tritecpenoit. from ethyl acetate extracts were isolated three substances.The chemical structure of these compounds was determined by spectral methods such as ESI-MS, FT-IR, NMR is stigmatsterol; β-sitosterolglucosid, betulinic acid and two flavonoid: 3,5-dihydroy-4’-metoxy-flavones-7-O-L-glucozyt and 5,7,4 ’ -trihydroxy-6-O-L- glucusyl-6 ’’ -oic-flavon. Key words: Dillenia indica, stigmatsterol, β-sitosterol, flavonoit, 3,5-đihiđroy-4 ’ metoxy-flavon-7-O-L- glucosylflavon; betulinic, 5,7,4 ’ -trihyđroxy-6-O-L-glucusyl-6 ” -oic-flavon.  Tel: 0912 132563, Email phamvanthinhsptn@gmail.com