Một số kết quả ban đầu về thành phần hóa học trong rễ cây tào đông (Prunus zippeliana var. Crasistyla (CARD)

Phạm Văn Thỉnh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 83(07): 39 - 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 MỘT SỐ KẾT QUẢ BAN ĐẦU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY TÀO ĐÔNG (PRUNUS ZIPPELIANA VAR. CRASISTYLA (CARD) Phạm Văn Thỉnh*, Trịnh Thị Giang, Mai Thị Hường Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Cây Tào đông có tên khoa học Prunus zippeliana var. crasistyla (Card).thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae). rễ của cây này trong đông Y dùng làm thuốc chống viêm cơ, viêm khớp, chữa đau dây thần kinh. Từ cặn chiết của etyl axetat của rễ cây Tào đông , bằng các phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ silica gel đã phân lập được 3 chất tinh khiết. Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ LC-MS, FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC và HMBC cho biết có 2 steroids là stigmasterol, β-sitosterol và 1 tritecpen là axit 2-α-hiđroxyuronic. Từ khóa: Prunus zippeliana var. crasistyla (Card), rosaceae, prunus, stigmasterol, β-sitosterol tritecpenoit, hiđroxyurolic MỞ ĐẦU* Cây Tào đông ở vùng núi còn được đồng bào gọi với một số tên khác như cây đào rừng, cây vàng nương vòi mập, cây địa chạo, chạ đào v.v mọc khá phổ biến ở các tỉnh miền núi Bắc Kạn, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang, Lao Cai. Tên khoa học của cây này là Prunus zippeliana var. crasistyla (Card). Cây tào đông là cây thân gỗ cứng, cao từ 4-5m, nhiều cành, lá thuôn có mép răng cưa, mọc so le dài từ 5-7 cm, rộng từ 3-5cm. Rễ mọc chìm cắm sâu vào khe núi, những rễ nhô ra khỏi đất vỏ rất cứng, rễ chìm trong lòng đất vỏ mền hơn [1]. Rễ cây Tào đông được dùng để làm thuốc trong dân gian từ rất lâu, mới đây Hội Đông Y tỉnh Bắc Kạn tổ chức nghiên cứu các tác dụng của dịch chiết bằng rượu rễ cây tào đông cho thấy nó có tác dụng tốt đối với các bệnh viêm khớp cấp và mãn tính, chữa đau dây thần kinh ngoại biên, chữa các chứng đau cột sống, viêm đa khớp. Có thể đun nước uống (10-20 gam rễ cho 1ngày) có thể chiết cô đặc thành cao sau đó hòa tan vào rượu hoặc chiết bằng rượu rồi xoa lên vùng đau [1-2] Theo một số nghiên cứu [2] cho biết dịch chiết nước của rễ cây Tào đông có phản ứng dương tính với flavonoit, saponin glicozit, tanin, không phát hiện thấy các phản ứng của ancaloit. Nghiên cứu này cũng cho biết dịch chiết cồn của rễ cây Tào đông có tác dụng chống viêm cấp khi thử nghiệm trên bàn chân chuột. Bài báo này sẽ thông báo một số thành phần hóa học có trong rễ cây Tào đông thu tại huyện Chợ Rã tỉnh * Tel: 0912132563, Email: phamvanthinhsptn@gmail.com Bắc Kạn có trong dịch chiết bằng dung môi etyl axetat. THỰC NGHIỆM Nguyên liệu Rễ cây tào đông được thu hoạch tại huỵện Chợ Rã tỉnh Bắc Kạn (2,0 kg) được PGS.TS.Lê Ngọc Công, khoa Sinh trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên thẩm định là cây Prunus zippeliana var. crasistyla (Card). Thiết bị nghiên cứu Điểm chảy được đo trên máy Electrothermal IA-9200 (Anh). Phổ IR được ghi trên máy IMPACT 410 sử dụng đĩa nén tinh thể KBr. Phổ ESI-MS đo trên máy HP-1100 LS/MS Trap. Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR và TMS được sử dụng là chất nội chuẩn. Sắc kí cột (CC) sử dụng chất nhồi Silica gel (Kieselgel 60, 70 - 230 mesh và 230 - 400 mesh, Merck). Phương pháp nghiên cứu Mẫu thực vật tươi (1,36kg) được khử men trong tủ sấy 10 phút ở nhiệt độ 110oC, sau đó được sấy khô đến khối lượng không đổi (độ ẩm < 10%) ở nhiệt độ 40-50 oC (còn lại 0,82kg). Mẫu khô được nghiền nhỏ và được tiến hành ngâm chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (trước tiên dùng etylaxetat, sau đó chiết bằng metanol và metanol- nước). Phần cặn tan trong etyl axetat thu được 20 gam. Phần cặn thu được trong dịch chiết bằng metanol và metanol nước là 40 gam Phân lập các chất sạch trong dịch chiết etyl axetat bằng phương pháp sắc kí cột với chât hấp phụ silica Phạm Văn Thỉnh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 83(07): 39 - 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 gel. Chúng tôi thu được 3 chất tinh khiết kí hiệu là ET-1 (42mg) , ET-2 (31mg) và ET-3 (27mg). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hợp chất ET-1 Chất ET-1 được phân lập khi rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi n-hexan-etyl axetat (95:5) thu được 42mg tinh thể hình kim không màu, nóng chảy ở 155-157 oC, tan tốt trong n-hexan, chlorofom, có Rf=0,65 trong hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (5:1), có [α]25D = -43 0 (c=0,05, CHCl3).Phổ hồng ngoại cho các tần số ở 3406,2cm-1 (dao động hóa trị OH), 2934,1cm -1 (dao động hóa trị CH); 1621,2cm-1 (C=C); phổ EI-MS (m/z) cho píc 412 [M]+. Phổ NMR cho các thông tin cụ thể sau 1H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,49 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, dd, J=5 và 2 Hz, H-6); 5,11 (1H, dd, J=15 và 5 Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J=15 và 5 Hz, H-23); 1,01 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,5Hz, H- 21); 0,85 (3H, d, J = 7,1Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 6,5Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J = 6,5Hz, H-28); 0,69 (3H, s, H-19). 13 C-NMR(125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 36,5 (C-1); 29,1 (C-2); 71,7 (C-3); 42,2 (C-4); 140,7 (C-5); 121,7 (C-6); 37,2 (C-7); 31,8 (C-8); 51,2 (C-9); 36,1 (C-10); 24,3 (C-11); 39,7 (C-12); 42,2 (C-13); 56,8 (C-14); 25,4 (C-15); 29,7 (C-16); 56,0 (C-17); 11,8 (C-18); 19,4 (C-9); 40,5 (C-20); 18,8 (C-21); 128,3 (C-22); 129,2 (C-23); 50,1 (C- 24); 31,6 (C-25); 21,2 (C-26); 21,0 (C-27); 18,9(C- 28); 12,0(C-29). So sánh các dữ liệu về tính chất hóa học, tính chất vật lí và các đặc trưng quang phổ của chất ET-1 hoàn toàn tương tự với các đặc trưng về phổ và tính chất vật lí của stigmasterol [3]. Vì vậy chúng tôi quy kết chất ET-1 là stigmasterol hay tên hệ thống của nó là stigmat-5,22-đien-24R-3β-ol Stigmasterol (ET-1) 2. Hợp chất ET-2 Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan- etylaxetat (90:10) thu được chất tinh khiết ET-2 đó là các tinh thể hình kim, không màu (31mg), nóng chảy ở 138-140oC. Phổ IR cho vân 3431,5 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của OH, vân 2931,3cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của CH, vân 1647,2cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng của liên kết đôi C=C. Phổ khối cho píc ion phân tử ở 414 [M]+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho các thông tin cụ thể sau: 1 H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,51 (1H, m, H-3); 5,31 (1H, dd, J=5 và 2 Hz, H-6); 1,01 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, d, J = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, d, J = 7,1Hz, H-26); 0,84 (3H, d, J = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J = 6,6Hz, H-28); 0,68 (3H, s, H-19). 13 C- NMR (125MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C-10); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12); 42,3 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 11,9 (C-18); 19,4 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 33,9 (C-22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C-28); 11,9 (C-29). So sánh các thông tin về phổ NMR, phổ IR, các hằng số vật lí của chất ET-2 mà chúng tôi phân lập từ rễ cây Tào đông với chất β-sitosterol mà các tác giả khác đã làm rõ được cấu trúc hóa học của nó thấy hoàn toàn giống nhau [3], từ đó có thể quy kết chất ET-2 là β-sitosterol. β-Sitosterol (ET-2) 3. Hợp chất ET-3 Chất ET-3 thu được khi phân lập bằng hệ dung môi chlorofom-metanol (95:5) là chất kết tinh vô định hình (27mg), tan tốt trong hệ dung môi chlorofom- metanol, nóng chảy ở 244-245oC, có Rf= 0,28 trong hệ dung môi trên. Phổ IR cho vân rộng trong khoảng 3500-3200cm -1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH có liên kết hiđro; vân 1695cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm cacboxyl, và vân 1645cm -1 đăc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=C. Phổ 1H-NMR của ET-3 cho biết có 7 tín hiệu của nhóm CH3 ở các độ chuyển dịch hóa học δH Phạm Văn Thỉnh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 83(07): 39 - 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 0,735ppm (3H, s, 26-CH3), δH 0,778ppm (3H, s, 24- CH3), δH 0,812ppm (3H, d, J=6,2, 30-CH3), δH 0,840ppm (3H, s, 29-CH3), δH 0,884ppm (3H, s, 25- CH3), δH 0,91ppm (3H, s, 23-CH3) và δH 1,05ppm (3H, s, 27-CH3). Tín hiệu cộng hưởng của proton trong các nhóm CH liên kết với nhóm hiđroxyl ở δH = 3,34ppm tương ứng với proton ở C-2 và δH= 3,77ppm tương ứng với proton ở C-3. một tín hiệu ở 2,1ppm (1H,d, J=11Hz) chính là tín hiệu của proton ở vị trí C-18, đó là những tín hiệu đặc trưng cho tritecpen có khung ursan. Tín hiệu ở δH =5,14ppm là độ chuyển dịch hóa học của proton trong nhóm CH liên kết đôi chứng tỏ nguyên tử cacbon chứa nối đôi còn lại là cacbon bậc bốn. Tất cả các dữ liệu trên hoàn toàn phù hợp với một tritecpen có bộ khung ursan và có liên kết đôi ở vị trí C13 và C14.Phổ 13C- NMR, phổ DEPT và phổ HSQC cho biết phân tử ET-3 có 30 cacbon cho phép khẳng định ET-3 là tritecpen trong đó có 7 nhóm CH3, 8 nhóm CH2, 8 nhóm CH và 7 cacbon bậc bốn.trong đó có 1 cacbon đặc trưng cho nhóm COOH với δC=178,26 ppm, một tín hiệu của nhóm CH ở δC= 124,50ppm, 1 C bậc 4 chứa nối đôi ở δC= 138,21ppm hai nhóm CH-OH ở các độ chuyển dịch hóa học tương ứng của C và H là δC= 64,63 ppm δH=3,77ppm ứng với CH-OH ở vị trí số 2 và δC= 77,82 ppm δH= 3,34ppm ứng với CH-OH ở vị trí số 3 (các số liệu phổ NMR được trình bày ở bảng 3.1). Phổ khối của chất ET-3 cho píc ion phân tử [M]+ 473 m/z. Bảng 1. Các số liệu phổ NMR của chất ET-3 Vị trí C 13C-NMR (ppm) 1 H- NMR(ppm) Vị trí của C 13C-NMR(ppm) 1H-NMR(ppm) 1 41,71 - 16 23,76 - 2 64,63 3,34 17 46,78 - 3 77,82 3,77 18 52,23 2,10 4 37,95 - 19 38,40 - 5 47,57 1,98 20 3,48 - 6 17,56 - 21 30,16 - 7 32,61 - 22 36,29 - 8 39,01 - 23 21,06 0,91 9 46,56 - 24 28,87 0,73 10 37,81 - 25 16,22 0,90 11 22,86 - 26 16,91 0,90 12 124,51 5,13 27 23,21 1,03 13 138,22 - 28 178,26 - 14 40,00 - 29 16,99 0,89 15 27,42 - 30 21,85 0,81 Phạm Văn Thỉnh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 83(07): 39 - 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 HO HO O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 28 30 29 27 2625 24 23 Axit 2α-hiđroxyursolic (ET-3) So sánh các số liệu về phổ của chất ET-3 với các số liệu mà các tác giả khác đã công bố khi nghiên cứu các đối tượng thực vật khác cho thấy chất ET-3 có phổ hoàn toàn giống với phổ của chât 2,3-đihiđroxi- urs-12-en-28-oic hay thường gọi là axit 2α- hiđroxyursolic [4]. Căn cứ vào các dữ liệu thực nghiệm và so sánh trên chúng tôi quy kết chất ET-3 là axit 2α-hiđroxyursolic. Chất có khung tritepen ursan được xác định là những chất có khả năng kháng khuẩn, chống viêm cao, là những chất có khả năng kháng gốc tự do, kháng tế bào ung thư gan dòng Hep- G2 và một số dòng tế bào bạch cầu (Leuk-M1) đặc biệt là hoạt tính anti-HIV với giá trị nồng độ thấp IC50 6,5mg/ml [5] KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc kí cột với chất hấp phụ silica gel, rửa giải cột bằng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau chúng tôi đãphân lập từ phần cặn chiết bằng etyl axetat của rễ cây tào đông Prunus zippeliana var. crasistyla (Card) được 3 chất tinh khiết. Bằng các phương pháp quang phổ hiện đại, so sánh đối chiếu với các tài liệu tham khảo đã quy kết được chất ET-1 là stingmasterol; ET-2 là β-sitosterol và chất ET-3 là axit 2α-hiđroxyursolic. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Tiến Bân và các cộng sự (2003) “Danh mục các loài thực vật Việt Nam” T.II Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [2]. Nguyễn Thị Minh, Hoàng Văn Lực, Nguyễn Xuân Dũng (2009) “Bước đầu nghiên cứu hóa học cây đào rừng” Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ 4. [3]. L.John Goad and Toshihiro Akihisa., ANALISIS OF STEROLS (1997) Blackie academic & professional London Weiheim –New Yord –Tokyo –Melbourne- Madras p.378 -380. [4]. Takashi Yamagiski, De-Cheng Zhang, Jer-Jang et al “The cytotoxic principles of Hyptis capitata and of the new tritecpenes hyptatic acid-A and B” Phytochemistry, 1988, 27 (10) p 3213-3216 [5]. Birgit U.Jaki, Scott G Franzblau, Lucas R., Chadwick, David C. Lankin, Fangqiu Zhang, Yuehong Wang an Guido F. Pauli. “Puriy- activity Relationships ò Natural Products: The Case of Anti-TB active Ursolc acid. J.Nat. Prod.2008, 71 p.1742-1748 SUMMARY PRIMARY STUDY ON THE CHEMICAL COMPOSITION OF PRUNUS ZIPPELIANA VAR. CRASISTYLA (CARD) Pham Van Thinh * , Trinh Thi Giang * , Mai Thi Huong * College of Education- TNU Prunus zippeliana var. crasistyla (Card) belonging to the families Rosaceae.Which can be found in almost all mountainous regions in Bac Kan, Cao Bang, Lang Son, Lao Caiprovinces. The locan people there often use the whole plant as a popular medicin. The ethyl acetate extracted of Prunus * Tel: 0912132563, Email: phamvanthinhsptn@gmail.com Phạm Văn Thỉnh và đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 83(07): 39 - 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 zippeliana var. crasistyla „ s leaves were separated by 2 steroids and 1 tritecpen. Chemical structure of these compounds determined through spestral methods such as LC-MS, FT-IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC and HMBC was stigmasterol, β-sitosterol and 2-α-hidroxyurolic acid. Key words: Prunus zippeliana var. crasistyla (Card), rosaceae, prunus, stigmasterol, β-sitosterol, tritecpenoit, 2α- hidroxyurolic