Một số đặc điểm di truyền của nhông cát Leiolepis reevesii reevesii - Trần Quốc Dung

Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế ISSN 1859-1612, Số 04(20)/2011: tr. 27-33 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA NHÔNG CÁT Leiolepis reevesii reevesii TRẦN QUỐC DUNG - NGÔ ĐẮC CHỨNG Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế Tóm tắt: Nhông cát Leiolepis reevesii reevesii là loài Thằn lằn thuộc họ Nhông (Agamidae), lớp Bò sát (Reptile). Ở Việt Nam, nhông cát thường được bắt gặp ở những dải cát ven biển. L. reevesii được thu thập ở xã Thuận An, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế. Các đặc điểm hình thái và màu sắc của các mẫu L. reevesii nghiên cứu là phù hợp với sự mô tả của Ngô Đắc Chứng (1991). Các nhiễm sắc thể kỳ giữa được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy tế lympho bào và nhuộm băng G có cải tiến. L. reevesii có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=36, trong đó 6 cặp nhiễm sắc thể kích thước lớn (1, 2, 3, 4, 5 và 6) và 12 cặp nhiễm sắc thể còn lại (7-18) là các nhiễm sắc thể kích thước nhỏ. Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA của ty thể cho thấy L. reevesii (C5 và C7) có độ tương đồng cao nhất với L. reevesii (AF215262) 99,4% và L. belliana (AF378379) 96,5% trong GenBank. Những trình tự 16S rRNA của các cá thể L. reevesii C5 và C7 được đăng ký trong GenBank lần lượt là EU428188, EU428189. 1. MỞ ĐẦU Nhông cát Leiolepis reevesii reevesii là loài Thằn lằn thuộc họ Nhông (Agamidae), lớp Bò sát (Reptile). Ở Việt Nam, nhông cát thường được bắt gặp ở những dải cát ven biển. Từ rất lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng nhông để chữa bệnh như hen suyễn, ghẻ lở và gầy yếu ở trẻ em. Một số nơi đem ngâm rượu để uống như tắc kè và rắn. Do thịt nhông thơm ngon nên được sử dụng làm thực phẩm. Mặt khác, khi phân tích thành phần thức ăn tự nhiên của nhông cát thấy có nhiều loài động vật, thực vật khác nhau, trong đó có nhiều côn trùng có hại như cào cào, châu chấu, bọ xít, bướm, ruồi... Do đó có thể nói về mặt sinh thái, nhông cát có một vai trò nhất định trong việc cân bằng hệ sinh thái vùng cát ven biển. Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về nhông cát. Các công trình này tập trung vào các nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học (Ngô Đắc Chứng 1991). Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định kiểu nhân và phân tích trình tự 16S rRNA ty thể của quần thể nhông cát Leiolepis reevesii reevesii. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thu mẫu Leiolepis reevesii reevesii (Hình 1) được thu thập ở xã Thuận An, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế, nằm trong khoảng 16º30 vĩ độ Bắc và 107º40 kinh độ Đông, cách thành phố Huế 13km về phía Đông Bắc bằng cách đặt bẫy ống hoặc đào hang. TRẦN QUỐC DUNG – NGÔ ĐẮC CHỨNG 28 2.2. Hóa chất Các hóa chất như sodium dodecylsulfate được mua từ Merck (Đức), peptone và cao nấm men từ Difco (Mỹ); agar, DNA cloning kit, CIAP, DNA extraction kit, vector nhân dòng pJET1 (Fermentas). Các hóa chất và khác dùng cho thí nghiệm có độ tinh khiết cao. Các loại mồi, dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm được pha chế theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn. 2.3. Khuếch đại phân đoạn gene 16S rRNA Để đọc trình tự nucleotide của phân đoạn gene 16S rRNA và xác định mức độ tương đồng di truyền, phân đoạn 16S rRNA được khuếch đại PCR với cặp mồi đặc hiệu L16S- F (5'-AGG TAA CGC CTG CCC AGT GAG G-3') và L16S-R (5'-CCT ACG TGA TCT GAG TCA-3'). PCR với thể tích 25 µl: 2,5 µl đệm 10x PCR, 1,5 µl 25 mM MgCl2, 2,0 µl 2,5 mM dNTP; 1 µl 20 pM mồi xuôi L16S-F và 1 µl 20 pM mồi ngược L16S-R; 1 µl Taq polymerase (1 U/µl); 1 µl DNA khuôn (20 ng); 16 µl nước khử ion. Chạy PCR: 95°C/5ʹ′; 35 chu kỳ (94°C/1ʹ′, 50°C/1ʹ′, 72°C/1ʹ′); 72°C/7ʹ′. DNA được điện di trên gel 0,8% agarose. Hình 1. Nhông cát Leiolepis reevesii reevesii trưởng thành A. Con đực B. Con cái 2.4. Các phương pháp sinh học phân tử khác Các phương pháp sinh học phân tử khác như tách chiết và tinh sạch DNA tổng số và DNA plasmid, gắn dính, cắt hạn chế, biến nạp shock nhiệt hóa chất, nuôi cấy tế bào E. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA NHÔNG CÁT 29 coli khả biến, chọn lọc, điện di gel agarose được tiến hành như đã mô tả trước đây (Nguyễn Sỹ Lê Thanh, 2006). 2.5. Giải trình tự DNA Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn được giải trình tự theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1 được gắn 2 trình tự mồi xuôi ngược để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai 16S rRNA. 2.6. Phần mềm DNAstar Các trình tự nucleotide của phân đoạn 16S rRNA được so sánh với nhau và với dữ liệu trong GenBank sử dụng phần mềm DNAstar. 2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào máu và làm tiêu bản nhiễm sắc thể Nuôi cấy tế bào máu và làm tiêu bản nhiễm sắc thể được tiến hành theo Barch (1997) và Aranyavalai (2004) có cải tiến. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm di truyền tế bào của nhông cát L. reevesii reevesii 3.1.1. Số lượng nhiễm sắc thể của nhông cát L. reevesii reevesii Sau khi nhuộm tiêu bản, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi, chọn các tế bào có các cụm nhiễm sắc kỳ giữa trải rộng để đếm số lượng nhiễm sắc thể (Hình 2). Kết quả đếm số lượng nhiễm sắc thể kỳ giữa của L. reevesii reevesii được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Số lượng nhiễm sắc thể của L. reevesii reevesii Mẫu (Giới tính) Số tế bào được chọn để đếm nhiễm sắc thể Số lượng nhiễm sắc thể của tế bào 36 Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % 1 (đực) 37 5 13,51 31 83,77 1 2,77 2 (cái) 37 3 8,18 34 91,88 0 0,00 3 (đực) 30 4 13,37 25 83,37 1 3,37 4 (cái) 38 2 5,27 35 92,18 1 2,67 5 (đực) 40 3 7,50 37 92,50 0 0,00 Tổng cộng 182 17 9,34 162 89,01 3 1,65 Nhìn vào bảng 1 có thể nhận thấy số lượng nhiễm sắc thể của nhông cát L.reevesii reevesii 36 chiếm tỉ lệ 1,65% (3/182). Kết quả này chứng tỏ số lượng nhiễm sắc thể của L.reevesii reevesii là 36. Các trường hợp 36 có thể do những nhiễm sắc thể kích thước nhỏ chồng lên nhau hoặc có sự đứt gãy của nhiễm sắc thể do tác động cơ học trong quá trình làm tiêu bản, nên số lượng của chúng trong tế bào có thể giảm hoặc tăng lên. Mặt khác, khi quan sát tế bào ở kỳ giữa với tổng số 36 nhiễm sắc thể đều có 12 nhiễm sắc TRẦN QUỐC DUNG – NGÔ ĐẮC CHỨNG 30 thể có kích thước lớn (macrochromosome) và 24 nhiễm sắc thể có kích thước nhỏ (microchromosome). Hình 2. Nhiễm sắc thể kỳ giữa của L. reevesii reevesii 3.1.2. Kiểu nhân của nhông cát L. reevesii reevesii Sau khi sắp xếp nhiễm sắc thể theo các qui ước quốc tế, kiểu nhân của L. reevesii reevesii được trình bày ở hình 3. Kết quả ở hình 3 cho thấy L. reevesii reevesii có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=36, trong đó 12 nhiễm sắc thể có kích thước lớn và 24 nhiễm sắc thể có kích thước nhỏ. Hình 3. Kiểu nhân của L.reevesii reevesii, 2n=36 với 12 nhiễm sắc thể lớn và 24 nhiễm sắc thể nhỏ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA NHÔNG CÁT 31 Ở Việt Nam cho đến nay chưa thấy có công bố nào về kết quả nghiên cứu kiểu nhân của các loài nhông cát. Theo Ngô Đắc Chứng (1991) thì ở Thừa Thiên Huế hiện có hai loài nhông cát là L. reevesii reevesii và L. guentherpetersi. Darevsky IS và Kupriyanova LA (1993) đã nghiên cứu xác định kiểu nhân của L. guentherpetersi ở xã Thuỷ phù, huyện Hương Thuỷ, tỉnh Thừa Thiên Huế có bộ nhiễm sắc thể tam bội 3n=54, bao gồm 18 nhiễm sắc thể kích thước lớn và 36 nhiễm sắc thể kích thước nhỏ. Kết quả so sánh cho thấy số lượng nhiễm sắc thể của L. reevesii reevesii ở Thừa Thiên Huế giống với số lượng nhiễm sắc thể của L. belliana ở Bangkok, Thái Lan, 2n=36 với 12 nhiễm sắc thể kích thước lớn và 24 nhiễm sắc thể kích thước nhỏ (Hall, 1970) trong khi L. boehmei Darevsky và Kupriyanova, 1993 ở phía Nam Thái Lan có số lượng bộ nhiễm sắc thể ít hơn, 2n=34, trong đó bao gồm 12 nhiễm sắc thể kích thước lớn và 22 nhiễm sắc thể kích thước nhỏ (Darevsky và Kupriyanova, 1993). 3.2. Trình tự 16S rRNA của nhông cát L. reevesii reevesii Phân đoạn gene 16S rRNA ty thể được nhân lên bằng PCR từ DNA tổng số với cặp mồi đặc hiệu L16S-F và L16S-R cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng 500 bp. Trình tự phân đoạn gene 16S rRNA ty thể của hai mẫu L. reevesii (C5 và C7) được so sánh với một số trình tự tương ứng ở GenBank bằng phần mềm DNAstar (Hình 4). Mức độ tương đồng phân đoạn gene 16S rRNA giữa hai mẫu L. reevesii C5 và L. reevesii C7 là 100%. Các mẫu L. reevesii (C5 và C7) tương đồng cao nhất với L. reevesii (AF215262) 99,4% và L. belliana (AF378379) 96,5% (Hình 4). Những trình tự 16S rRNA của L. reevesii C5 và C7 được đăng ký trong GenBank lần lượt là EU428188, EU428189. 4. KẾT LUẬN Nhông cát L.reevesii reevesii ở xã Thuận An, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n=36, trong đó 6 cặp nhiễm sắc thể kích thước lớn (1, 2, 3, 4, 5 và 6) và 12 cặp nhiễm sắc thể còn lại (7-18) là các nhiễm sắc thể kích thước nhỏ. L. reevesii (C5 và C7) có độ tương đồng cao nhất với L. reevesii (AF215262) 99,4% và L. belliana (AF378379) 96,5% trong GenBank. Những trình tự 16S rRNA của các cá thể L. reevesii C5, C7 được đăng ký trong GenBank lần lượt là EU428188, EU428189. TRẦN QUỐC DUNG – NGÔ ĐẮC CHỨNG 32 Hình 4. So sánh trình tự phân đoạn gene 16S rRNA ty thể của các loài thuộc giống Leiolepis: L. guentherpetersi AF378378 (Lgu78), L. guttata AF378377 (Lgu77), L. belliana AB031986 (Lbe86), L. belliana AB031979 (Lbe79), L. reevesii AF215262 (Lre62), L. reevesii AF215276 (Lre76), L. reevesii C5 (LreC5), L. reevesii C7 (LreC7), L. guentherpetersi S4 (LguS4), L. guentherpetersi (LguS6). MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA NHÔNG CÁT 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ngô Đắc Chứng (1991). Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh thái của nhông cát Leiolepis belliana (Gray, 1827) ở đồng bằng và vùng cát ven biển Thừa Thiên Huế. Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Việt Nam: 4-7, 20-23, 52-56. [2] T. Q. Dung, Q. D. Thi, N. D. Chung, T. V. Thien (2011). Polymorphic analysis of mitochondrial 16S rRNA gene of two lizard species in Vietnam. Genetika. 2011 May; 47(5): 703-6. [3] Aranyavalai V, Thirakhupt K, Pariyanonth P, Chulalaksananukul W (2004). Karyotype and unisexuality of Leiolepis boehmei Darevsky and Kupriyanova, 1993 (Sauria: Agamidae) from Sourthern Thailand. The Natural History Journal of Chulalongkorn Univresity 4 (1): 15-19. [4] Darevsky IS, Kupriyanova LA (1993). Two new all-female lizard species of the genus Leiolepis Cuvier, 1829 from Thailand and Vietnam. Hepertozoa 6 (1/2): 3-20. [5] Hall W. P (1970). Three probable cases of parthenogenesis in lizards (Agamidae, Chamaeleontidae, Gekkonidae). Experientia 26: 1271-1273. [6] Barch MJ (1997). The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. The Association of Genetic Technology, USA. [7] Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cường, Đặng Thị Thu (2006). Endo-β-1,4-mannanse từ B. subtilis G1: Chọn chủng, xác định động thái sinh trưởng, nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa. Tạp chí Công nghệ sinh học 4: 327-334. Title: SOME GENETIC CHARACTERISTICS OF Leiolepis reevesii reevesii Abstract: Leiolepis reevesii reevesii is the butterfly lizard species belonged to the family Agamidae of Reptile. In Vietnam, the family of Agamidae can be found in some sand areas near the coast. The study was carried out on the series L. reevesii reevesii specimens collected from Thuan An Precincts, Phu Vang District, Thua Thien Hue Province. Colour and morphological characters of captured specimens matched the description about L. reevesii reevesii by Ngo Dac Chung (1991). Mitotic chromosomes were prepared by lymphocyte culturing and stained by the modified G banding technique. The karyotype was determined for each specimen on the basis of photographs of over 30 metaphase cells which contain chromosomes enlarged. The chromosomes on those photographs were counted. A total of 36 diploid chromosomes were found, comprising 6 pairs of macrochromosomes and 12 pairs of microchromosomes. Analysis of 16S rRNA sequences of the lizard species L. reevesii show L. reevesii (C5, C7) had the highest homology of 96.5-99.4% with L. belliana and L. reevesii in GenBank. These 16S rRNA sequences of individuals L. reevesii C5, C7 were deposited in GenBank with accession number EU428188, EU428189, respectively. PGS. TS. TRẦN QUỐC DUNG Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Huế PGS. TS. NGÔ ĐẮC CHỨNG TRẦN QUỐC DUNG – NGÔ ĐẮC CHỨNG 34 Trường Đại học Sư phạm - Đại học Huế