Mất đoạn 4977 BP trên ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú - Lưu Huyền Trang

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 111-116 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. MẤT ĐOẠN 4977 bp TRÊN ADN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Lưu Huyền Trang1, Nguyễn Thị Tú Linh1, Đỗ Minh Hà1, Tạ Văn Tờ2, Trịnh Hồng Thái1* 1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG HN, *thaith@vnu.edu.vn 2Bệnh viện K, Hà Nội TÓM TẮT: Sự mất đoạn lớn của ADN ty thể, phổ biến là mất đoạn 4977 bp đã được xác định thấy ở nhiều loại bệnh khác nhau, bao gồm cả bệnh ung thư. Tuy nhiên, những hiểu biết về mối liên quan giữa mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể và bệnh ung thư vú vẫn còn nhiều điểm chưa được làm sáng tỏ. Cho đến nay, đột biến này vẫn chưa được nghiên cứu ở bệnh nhân ung thư vú tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, để tiến hành xác định mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú. Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR lồng với 2 cặp mồi, kết quả đã phát hiện được mất đoạn 4977 bp ở bệnh nhân ung thư vú với tỷ lệ 89,42% và mất đoạn này đã được xác định có liên quan với bệnh ung thư vú ở Việt Nam. Tỷ lệ mất đoạn 4977 bp ở mô lân cận u (70,04%) cao hơn so với ở mô u (60,58%) (p<0,05). Sử dụng phương pháp nhân dòng kết hợp với giải trình tự ADN từ sản phẩm PCR, một số mất đoạn lớn trên ADN ty thể cũng đã được tìm thấy trên mô vú của bệnh nhân ung thư vú, gồm: mất đoạn 4753, 5012, 5065, 5156, 5248 và 5266 bp. Các mất đoạn này là những mất đoạn mới, cho đến nay chưa được tìm thấy trong các công bố trên thế giới. Mất đoạn 4977 bp không phụ thuộc vào các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú như nhóm tuổi, phân loại TNM, mức độ biệt hóa. Từ khóa: ADN ty thể, giải trình tự ADN, mất đoạn 4977 bp, PCR lồng, ung thư vú. MỞ ĐẦU Ty thể là trung tâm năng lượng và tham gia rất nhiều quá trình chuyển hóa của tế bào. Ty thể có hệ gen riêng, gồm 37 gen, trong đó có 13 gen mã hóa cho chuỗi polypeptide, 22 gen mã hóa cho ARN vận chuyển, 2 gen mã hóa ARN ribosome. Do ty thể đóng một vai trò quan trọng trong tế bào nên những biến đổi trong hệ gen ty thể ảnh hưởng đến rất nhiều quá trình sống, trong đó có mất đoạn 4977 bp. Mất đoạn 4977 bp là đột biến mất đoạn phổ biến nhất của hệ gen ty thể, độ dài đoạn bị mất lớn mang gen mã hóa cho nhiều protein trong chuỗi vận chuyển điện tử như ND3, ND4, ND4L, ND5, ATP6, ATP8, COXI và các phân tử ARN vận chuyển. Do đó đột biến này ảnh hưởng nhiều tới chức năng, hoạt động của ty thể. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện đột biến này có liên quan đến một số bệnh như: Pearson, Kearn-Sayre, bệnh cơ [4], cơ thần kinh và một số loại ung thư, trong đó có ung thư đại trực tràng [1], ung thư phổi [2], ung thư vú [7], dạ dày, ung thư vùng đầu cổ [3]. Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào về mất đoạn 4.977 bp ADN ty thể được thực hiện trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú tại Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mất đoạn 4977 bp ở bệnh nhân ung thư vú, đánh giá mối liên quan giữa mất đoạn ADN ty thể với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu là 104 cặp mẫu mô u và lân cận u (cách mô u 2-3 cm) của 104 bệnh nhân ung thư vú được lấy từ Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K, Hà Nội. Mẫu máu người bình thường làm đối chứng gồm 32 mẫu, được lấy từ những người cho máu tình nguyện tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. Các kit được sử dụng trong nghiên cứu này gồm có: kit tách ADN tổng số từ mẫu mô và mẫu máu, kit thôi gel, kit tinh sạch plasmid đều của hãng QIAGEN, kit nhân dòng của hãng Thermo Scientific. PCR xác định mất đoạn 4977 bp ADN ty thể: Sử dụng 3 cặp mồi được thiết kế với trình tự mồi như sau: mtDNA-f: 5’ GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC 3’, mtDNA-r: 5’ GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG 3’có sản phẩm PCR kích thước 433 bp; 4977-1f : 5’ TCA ATG CTC TGA AAT CTG TGG 3’, 4977-1r: 5’ GTT GAC CTG GGG TGA GAA G 3’ có sản phẩm PCR kích thước 496 bp; 4977-2f: 5’ ACA GTT TCA TGC CCA TCG TC 3’, 4977-2r: 5’ GCG TTT GTG TAT GAT TTT GC 3’ có sản phẩm PCR kích thước 381 bp. Phản ứng PCR với cặp mồi mtDNA và 4977-1 trong tổng thể tích phản ứng 12,5 µl gồm có 6,25 µl OneTaq 2X Master Mix (New England Biolab), 0,2 µM mỗi mồi, 38 ng ADN khuôn cho phản ứng với mồi mtDNA, 72 ng ADN cho phản ứng với mồi 4977-1 với chu trình nhiệt: 94°C 30 giây; 94°C 30 giây, 54°C 30 giây, 68°C 45 giây trong 35 chu kỳ; 68°C trong 5 phút; sau đó giữ ở 4°C. Sau đó, 2 µl sản phẩm PCR của cặp mồi 4977-1 được sử dụng như ADN khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi 4977-2, mồi 4977-2 được cho vào là 0,4 µM. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 4977-2 tương tự như trên, chỉ khác ở nhiệt độ gắn mồi là 60°C. Thôi ADN từ gel agarose: Nhằm tinh sạch ADN từ sản phẩm PCR, QIAquick Gel Extraction Kit đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhân dòng và giải trình tự ADN: Để xác định chính xác kích thước mất đoạn ADN, sản phẩm PCR đã được chèn trong vector PJet1.2, biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α. Các khuẩn lạc được kiểm tra biến nạp bằng cặp mồi PJet1.2 và cặp mồi 4977-2. Khuẩn lạc mang đoạn chèn được chọn, nuôi, sau đó tách plasmid và giải trình tự ADN. Phân tích kết quả giải trình tự ADN bằng phần mềm Sequence Scanner v1.0 và Bioedit, so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank thuộc NCBI sử dụng chương trình BLASTn. Tính toán thống kê: Sử dụng tiêu chuẩn χ2 với mức ý nghĩa α=0,05 để phân tích mối liên quan giữa mất đoạn 4977 bp ADN ty thể với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú, so sánh giữa nhóm bệnh với nhóm đối chứng. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tỷ lệ mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú PCR bằng cặp mồi mtDNA đã giúp xác định được sự có mặt của ADN ty thể trong dịch chiết ADN tổng số. Với kết quả 100% các mẫu đều có băng mtDNA với kích thước tương đương 433 bp đã cho thấy tất cả các mẫu ADN tổng số được phân tích đều chứa ADN ty thể (giếng 1, 3 trong hình 1). Đồng thời, chúng tôi tiến hành PCR lồng, sử dụng 2 cặp mồi 4977-1 và 4977-2 nhằm xác định mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể. Giếng 2 và 4 (hình 1) minh họa sản phẩm PCR có kích thước 381bp, chứng tỏ có đột biến mất đoạn 4977 bp trong mẫu. Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR có các băng tương ứng kích thước 381 bp (gel agarose 1.7% và nhuộm ethidium bromide). Giếng M: Thang chuẩn ADN 100 bp, giếng (-): Đối chứng âm, giếng 1,3: Sản phẩm PCR cặp mồi mtDNA, giếng 2,4: Sản phẩm PCR cặp mồi 4977-2. Tiến hành sàng sàng lọc trên 104 bệnh nhân ung thư vú và 32 mẫu máu của người cho máu bình thường, chúng tôi đã thu được tỷ lệ mất đoạn 4977 bp ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú là 89,42%, cao hơn tỷ lệ này ở người bình thường (15,63%) với p < 0,05. Như vậy, mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể đã được phát hiện ở đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam có liên quan với bệnh ung thư vú. Thống kê kết quả phân tích mô u và mô lận cận u của cùng bệnh nhân ung thư vú đã cho thấy tỷ lệ mất đoạn 4977 bp ở mô u là 60,58%, ở mô lân cận u là 70,04%. Như vậy, mất đoạn này được tìm thấy có tỷ lệ xuất hiện ở mô lân cận u cao hơn so với ở mô u với p<0,05. Hiện tượng tương tự cũng đã gặp trong nghiên cứu của Dani et al. (2004) [3]. Phát hiện các đột biến mới trên ADN ty thể Bên cạnh băng ADN có kích thước 381 bp tương ứng với sản phẩm PCR nhằm phát hiện đột biến mất đoạn 4977 bp, kết quả điện di còn cho thấy sự xuất hiện của những băng có kích thước lớn hơn hoặc nhỏ hơn so với băng 381 bp trên bản gel điện di (các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 trong hình 2), hoặc xuất hiện đồng thời nhiều băng trong sản phẩm PCR (các giếng 2,3,4,5,7 trong hình 2). Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR có các băng với kích thước khác 381 bp (gel agarose 1.7% và nhuộm ethidium bromide). Giếng M: Thang chuẩn ADN 100 bp, giếng 1: B-32925, giếng 2: T-33285, giếng 3: B-17320, giếng 4: T-35713, giếng 5: B-36235, giếng 6: B-26301, giếng 7: T-35115. Hình 3. Các đoạn trình tự ADN ty thể của bệnh nhân ung thư vú mang mất đoạn 4977 bp (a), mất đoạn 5156 bp (b), mất đoạn 5266 bp (c), mất đoạn 5012 bp (d). Mũi tên chỉ vị trí nối sau khi mất đoạn, trình tự lặp màu xanh: 13 bp (a), 3 bp (b) Theo tính toán, dựa vào vị trí bắt cặp của mồi, sản phẩm PCR chỉ có 1 băng với kích thước tương đương 381 bp. Để khẳng định chính xác kết quả PCR và xác định các mất đoạn tương ứng với các băng ADN khác nhau, một số băng rõ nét được thôi gel, nhân dòng và giải trình tự ADN. So sánh kết quả giải trình tự thu được với trình tự chuẩn của ADN ty thể (NC_012920.1), chúng tôi khẳng định vị trí bắt cặp của mồi là đặc hiệu với tất cả các mẫu, đúng với vị trí đã được thiết kế, không có hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu. Sản phẩm PCR với kích thước 381 bp mang trình tự chứa mất đoạn 4977 bp. Trình tự này có một đoạn lặp 13 nucleotide (hình 3A) phù hợp với những nghiên cứu trước đó về mất đoạn 4977 bp [4]. Các sản phẩm PCR có kích thước khác 381 bp cũng đã được xác định là có chứa các mất đoạn khác nhau trên ADN ty thể, gồm: mất đoạn 4753, 5012, 5065, 5156, 5248 và 5266 bp (hình 3, bảng 1). Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là những mất đoạn mới, chưa từng được công bố trong các công trình nghiên cứu đã được tham khảo, nhất là các công bố trong 2 cơ sở dữ liệu chuyên biệt MitoBreak [5] và Mitomap [6]. Trong quá trình phân tích các trình tự mang mất đoạn, chúng tôi đã xác định thấy một mẫu VB011 có hiện tượng chèn thêm 1 nucleotide tại vị trí nối giữa 2 đầu trình tự mất đoạn. Chúng tôi đưa ra giả thiết về hiện tượng này như ở hình 4. Hình 4. Giả thiết về mất đoạn 5248 bp và chèn thêm 1 nucleotide vào trình tự ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú (mẫu 16897B) Bảng 1. Mất đoạn 4977 bp và các mất đoạn mới ở bệnh nhân ung thư vú STT Mẫu Vị trí nối (nt:nt) Kích thước mất đoạn (bp) Vị trí của đoạn lặp (nt) Loại trình tự lặp Kích thước sản phẩm PCR(bp) 1 VB011 8251-13500 -5248 NR - 110 2 VT021 8469-13447 (hoặc 8482-13460) -4977 8470-8482/ 13447-13459 D, 13/13 381 3 VT032 8263-13420 (hoặc 8266-13423) -5156 8264-8266/ 13420-13422 D, 3/3 202 4 VT046 8217-13484 -5266 NR - 92 5 VB051 8271-13284 -5012 NR - 346 6 VB1120 8556-13310 - 4753 NR - 605 7 VB1130 8245-13311 (hoặc 8247-13313) -5065 5246-5247/ 13311-13312 D, 2/2 293 NR. không có trình tự lặp; D. trình tự lặp trực tiếp. Khi xét chung tất cả các mất đoạn lớn quan sát được trong nghiên cứu này, tỷ lệ mất đoạn lớn ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú là 96,15%, trong đó mất đoạn 4977 bp là 89,42%. Ở mẫu máu người bình thường, tỷ lệ mất đoạn lớn là 31,25%, trong đó tỷ lệ mất đoạn 4977 là 15,63%. Mất đoạn 4977 bp đã được xác định thấy ở nhiều loại ung thư khác nhau, gồm ung thư vú [4], ung thư đại trực tràng [1], ung thư dạ dày, ung thư phổi [2]. Từ đây, có thể thấy, mất đoạn 4977 bp ADN ty thể không đặc hiệu cho một loại ung thư nào, nhưng đột biến này có thể gây ra những biến đổi liên quan đến ung thư. Mối liên quan giữa mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú Thống kê các đặc điểm của mẫu thu thập được, mẫu ung thư vú tập trung nhiều hơn ở nhóm tuổi trên 50 (62,75%), 97,44 % mẫu nghiên cứu là loại ung thư biểu mô ống xâm nhập, đây cũng là loại ung thư vú phổ biến nhất. Kích thước và số lượng hạch thay đổi theo từng bệnh nhân, tuy nhiên chủ yếu các hạch có kích thước ≤ 2cm (97,75%). Phân tích mối liên quan giữa mất đoạn 4977 bp ADN ty thể với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú, với nhóm tuổi lớn hơn và bằng 50, tỷ lệ mất đoạn 4977 bp là 90,63% (58/64), cao hơn tỷ lệ này ở nhóm tuổi dưới 50 (86,84%; 33/38). Ngoài ra, khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). So sánh giữa các nhóm TNM khác nhau, tỷ lệ mất đoạn 4977 bp cao nhất ở nhóm T2 với tỷ lệ đột biến là 90,91%. Tuy nhiên, giữa các nhóm TNM, các mức độ biệt hóa, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mất đoạn 4977-bp (p> 0,05). Vì vậy, mất đoạn 4977 bp không phụ thuộc vào tuổi, TNM, mức độ biệt hóa ở bệnh nhân ung thư vú. Tỷ lệ mất đoạn 4977 bp có khác biệt rõ rệt giữa mẫu mô u và mô lân cận u, giữa mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú và mẫu máu của người bình thường (p<0,05) đã cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa mất đoạn 4977 bp và bệnh ung thư vú. Tỷ lệ mất đoạn 4977 bp là 89,42% ở bệnh nhân ung thư vú, cao hơn đáng kể so với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố. Theo nghiên cứu của Chen et al. (2011) [1] trên đối tượng ung thư đại trực tràng, tỷ lệ mất đoạn chỉ chiếm 19,23%. Tỷ lệ này trên đối tượng ung thư phổi đã được tìm thấy là 54,1% [2]. Theo nghiên cứu của Tseng et al. (2006) [7], tỷ lệ mất đoạn 4977 bp ở bệnh nhân ung thư vú là 47% (ở mô lân cận u). Kết quả này chứng tỏ độ nhạy của phản ứng PCR lồng với 2 cặp mồi 4977-1 và 4977-2 được thiết kế như trong phần phương pháp là hơn hẳn so với những phương pháp chỉ sử dụng một cặp mồi hoặc sử dụng phương pháp long-PCR để phát hiện mất đoạn 4977 bp. KẾT LUẬN Nghiên cứu của chúng tôi trên bệnh nhân ung thư vú đã cho thấy tỷ lệ mất đoạn 4977 bp của ADN ty thể ở mô lân cận u (70,04%) cao hơn so với ở mô u (60,58%), tính chung trên mô vú là 89,42% và có liên quan với bệnh ung thư vú ở Việt Nam. Đã phát hiện thấy 6 mất đoạn mới của ADN ty thể trên các mẫu mô vú của bệnh nhân ung thư vú gồm: mất đoạn 4753, 5012, 5065, 5156, 5248 và 5266 bp. Tỷ lệ mất đoạn 4977 bp không phụ thuộc vào các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú như nhóm tuổi, phân loại TNM và mức độ biệt hóa khối u. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện nhờ kinh phí của đề tài cấp nhà nước KC.04.10/11-15 và sự giúp đỡ của bệnh viện K về việc cung cấp mẫu mô bệnh ung thư vú, giúp đỡ của viện Huyết học và Truyền máu Trung ương về mẫu máu của người bình thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen T., He J., Shen L., Fang H., Nie H., Jin T., Wei X., Xin Y., Jiang Y., Li H., Chen G., Lu J., Bai Y., 2011. The mitochondrial DNA 4,977-bp deletion and its implication in copy number alteration in colorectal cancer. BMC Med. Genet., 12(8): 3-6. Dai J. G., Xiao Y. B., Min J. X., Zhang G. Q., Yao K., Zhou R. J., 2006. Mitochondrial DNA 4977 bp deletion mutations in lung carcinoma. Indian J. Canc., 43: 20-25. Dani M. A., Dani S. U., Lima S. P., Martinez A., Rossi B. M., Soares F., Zago M. A., Simpson A. J., 2004. Less Delta mtDNA 4977 than normal in various types of tumors suggests that cancer cells are essentially free of this mutation. Genet. Mol. Res., 3(3): 395-409. Holt I. J., Harding A. E., Morgan-Hughes J. A., 1989. Deletions of muscle mitochondrial DNA in mitochondrial myopathies: Sequence analysis and possible mechanism. Nucleic Acids Res., 17(12): 4465-4469. Mitobreak, 2014. Tra cứu 28/9/2014. Mitomap, 2014. MITOMAP. Tra cứu 28/9/2014. Tseng L. M., Yin P. H., Chi C. W., Hsu C. Y., Wu C. W., Lee L. M., Wei Y. H., Lee H. C., 2006. Mitochondrial DNA mutations and mitochondrial DNA depletion in breast cancer. Gene. Chromosome. Canc., 45(7): 629-638. THE MITOCHONDRIAL DNA 4977 bp DELETION IN BREAST CANCER PATIENTS Luu Huyen Trang1, Nguyen Thi Tu Linh1, Do Minh Ha1, Ta Van To2, Trinh Hong Thai1 1Hanoi University of Science, VNU, Hanoi 2Vietnam National Cancer Hospital, Ha Noi SUMMARY The large scale deletions of mitochondrial DNA, the common 4977 bp deletion was identified in many different diseases, including cancer. However, understanding of the relationship between 4977 bp deletion of mitochondrial DNA and breast cancer have not been fully elucidated. The studies of this mutation have not been carried out in patients with breast cancer in Vietnam so far. In this study, we identified 4977 bp deletion of mitochondrial DNA in patients with breast cancer. Using nested PCR with two primer pairs, we detected 4977 bp deletion in patients with breast cancer at the rate of 89.42% and this deletion associated with breast cancer in Vietnam. The percentage of 4977 bp deletion in adjacent tissues (70.04%) is higher than in tumor tissue (60.58%) (p<0.05). Using cloning method and DNA sequencing of PCR products, some large scale deletions in mitochondrial DNA were also found in the breast tissue of breast cancer patients, including: 4753, 5012, 5065, 5156, 5248 and 5266 bp deletions. These deletions are new and have not been found in the published works in the world so far. The 4977 bp deletion did not depend on the pathological characteristics of patients with breast cancer as age of patient, TNM stage, grade of differentiation. Keywords: 4977 bp deletions, breast cancer, DNA sequencing, mitochondrial DNA, nested PCR. Ngày nhận bài: 22-10-2014