Kỹ thuật LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)- hướng đi mới trong việc tạo kit phát hiện nhanh bệnh truyền nhiễm

Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 43 KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION)- HƢỚNG ĐI MỚI TRONG VIỆC TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH BỆNH TRUYỀN NHIỄM Hoàng Phú Hiệp1, Lê Quang Huấn2* 1 Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên; 2 Viện Công nghệ Sinh học, VAST TÓM TẮT Kỹ thuật tái bản đẳng nhiệt (LAMP) là một phƣơng pháp tái bản acid nucleic (DNA hoặc RNA) trong một nhiệt độ duy nhất sử dụng một bộ mồi đƣợc thiết kế đặc biệt và một DNA polymerase có khả năng vừa tách mạch đôi vừa tổng hợp. Sản phẩm DNA là cấu trúc gốc vòng do sự lặp lại nhiều lần của gen đích. LAMP là phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao, hiệu quả, nhanh chóng và sản phẩm có thể quan sát trực tiếp trong ống phản ứng, do vậy phƣơng pháp LAMP có thể là một phƣơng pháp đặc biệt hữu ích để chẩn đoán bệnh truyền nh iễm nhƣ nhƣ virus, vi khuẩn, ký sinh trùng ... Từ khoá: LAMP, PCR, mồi FIP, mồi BIP, DNA gốc vòng. MỞ ĐẦU* Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation ) đƣợc nghiên cứu và phát triển bởi công ty Eiken Chemical Co. Ltd. Đây một phƣơng pháp nhân bản gen mới , có thể tổng hợp một đoạn DNA lớn mà không cần các chu trình biến nhiệt [1]. Đặc điểm phƣơng pháp là sử dụng 4 mồi khác nhau đƣợc thiết kế đặc biệt để nhận ra 6 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất. Quá trình tái bản và phát hiện gen đích chỉ diễn ra trong một bƣớc duy nhất. Thành phần phản ứng gồm có mẫu, mồi, enzyme DNA polymerase, hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 65oC. Phƣơng pháp này có hiệu quả khuyếch đại cao khoảng 109-1010 lần trong 15-60 phút. So với các phƣơng pháp nhƣ PCR, Realtime PCR,... LAMP có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ: chính xác, đơn giản, giá thành thấp và đặc biệt là thời gian thực hiện ngắn và có thể phát hiện kết quả bằng mắt thƣờng. Do vậy, LAMP thƣờng đƣợc sử dụng để tạo các bộ kit chẩn đoán nhanh đƣợc phổ biến rộng rãi trên thế giới. Phƣơng pháp LAMP rất đơn giản để thực hiện [2, 3], phƣơng pháp này là phƣơng pháp tổng hợp thay thế DNA tƣ̀ sợi đôi và tƣ̣ quay * Email: huanlequang@gmail.com vòng nhờ enzyme Bst DNA polymerase và bốn mồi đƣợc thiết kế đặc biệt : hai mồi trong (FIP và BIP) và hai mồi ngoài (F3 và B3). Hơn nữa Nagamine và cộng sự (2002) đƣa ra phƣơng pháp mới bằng cách đặt mồi vòng xuôi và ngƣợc (LF và LB) làm phản ứng LAMP đƣợc tiến hành nhanh hơn. LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám đƣợc vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm DNA-vòng mới đƣợc tạo ra và mới phát hiện đƣợc. Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm DNA-vòng sẽ không đƣợc tạo ra. Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thƣờng do sự kết tủa của phản ứng tạo muối pyrophotphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm [2, 4]. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA PHƢƠNG PHÁP LAMP CHỌN GEN ĐÍCH VÀ THIẾT KẾ MỒI Gen đích của phản ứng LAMP dài khoảng từ 200- 2000 nucleotide, do vậy vùng cần tái bản thích hợp đối với mọi gen hay một đoạn nucleotide của mọi sinh vật. Trên gen đích có 6 vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 44 F1/F1c ở đầu 3’ và vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c ở đầu 5’. Những trình tự này là cơ sở cho việc thiết kế 4 cặp mồi đặc biệt: FIP, BIP, F3, B3. Trong đó mồi FIP (Forward Inner Primer) gồm 2 phần: vùng F2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho F2c và đƣợc nối với vùng F1c ở đầu 5’; mồi BIP (Backward Outer Primer) gồm 2 phần: vùng B2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho B2c đƣợc nối với vùng B1c ở đầu 5’; mồi F3 (Forward Outer Primer) chứa vùng F3, là trình tự bổ sung cho vùng F3c; mồi B3 (Backward Outer Primer) chứa vùng B3, là trình tự bổ sung cho vùng B3c. NGUYÊN TẮC CƠ BẢN CỦA PHẢN ỨNG Kỹ thuật LAMP dựa vào sự tổng hợp DNA thay thế sợi đôi diễn ra ở 60- 65oC trong khoảng 45-60 phút với sự có mặt của enzyme Bst DNA polymerase, dNTPs, cặp mồi đặc biệt và DNA khuôn. Cơ chế phản ứng LAMP gồm ba bƣớc: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản và kéo dài chuỗi, cuối cùng là lặp lại chu kỳ [1]. Bƣớc 1- Tạo vật liệu khởi đầu: Một trong những mồi LAMP sẽ bám vào trình tự DNA đích, sau đó dƣới tác dụng của enzyme Bst polymerase có hoạt tính tách sợi và kéo dài sợi mới theo chiều 3’-5’. Ở đây chúng tôi lấy ví dụ từ mồi FIP. Các mồi khác sẽ tƣơng tự, kết quả thu đƣợc một sản phẩm là đoạn DNA sợi đơn đƣợc giới hạn bởi 2 trình tự là F1 và B1c. Mồi FIP bám vào vị trí F2c sau đó kéo dài mạch DNA (Hình 2B). Tiếp theo mồi F3 sẽ bám vào vị trí F3c trên 2 mạch mới để kéo dài mạch (hình 2D). Ở bƣớc này sẽ tách mạch vừa tổng hợp bởi mồi F1c ra (hình 2F), sau đó ở đầu 5’ của mạch này, do trình tự F1c bổ sung với với F1 nên sẽ hình thành cấu trúc vòng ở đầu 5’ này (hình 2G). Tƣơng tự mồi BIP và B3 sẽ bám vào và tổng hợp sợi mới. Kết quả thu đƣợc sản phẩm DNA đơn có giới hạn bởi 2 mồi là FIP và BIP (hình 2I). Sợi DNA này có 2 đầu cuộn lại hình thành cấu trúc gốc vòng (stem-loop) (do trình tự F1 bắt cặp bổ sung với F1c và B1c bắt cặp bổ sung với B1). Cấu trúc này sẽ là cấu trúc khởi đầu cho quá trình tái bản của phƣơng pháp LAMP (chu kỳ lặp lại LAMP). Bƣớc 2- Chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi: Trong chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi, mồi FIP liên kết với vòng trong cấu trúc DNA gốc vòng (stem- loop DNA) ở vùng F2/F2c và tổng hợp sợi DNA thay thế, đồng thời do cấu trúc vòng ở đầu 3’ (do trình tự FIP tạo thành) sẽ đƣợc kéo dài và hình thành cấu trúc vòng ở vị trí kết thúc của trình tự BIP. Cấu trúc vòng của trình tự BIP lại đƣợc kéo dài hình thành nên cấu trúc sợi kép đƣợc gấp khúc ở giữa và một sợi đơn có cấu trúc vòng ở hai đầu. Cả hai sản phẩm này đều là DNA mẫu cho mồi BIP trong các chu kỳ tái bản tiếp theo. Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp DNA gốc vòng với cấu trúc gấp khúc và độ dài khác nhau của cùng một trình tự (hình 3) [1]. Bƣớc 3- Lặp lại chu kỳ: Cứ nhƣ vậy, các mồi FIP và BIP của cả hai sợi khuôn thay phiên nhau tổng hợp DNA bổ sung và tạo gốc vòng ở cuối mỗi sợi. Phản ứng cứ vậy tiếp tục và có thể tạo nên 109 - 1010 bản sao DNA mạch trong vòng khoảng 15 phút đến 1 giờ. Khi mẫu có bản chất là RNA, thì có 2 cách: thứ nhất có thể tạo cDNA trƣớc sau đó tiến hành phản ứng LAMP bình thƣờng [5]; hoặc có thể thực hiện phản ứng RT-LAMP (phản ứng LAMP ngƣợc), phƣơng pháp này cần bổ sung enzyme sao chép ngƣợc (reverse transcriptase). Hình 1. Bộ mồi phản ứng LAMP Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 45 Hình 2. Tạo vật liệu khởi đầu Hình 3. Tái bản và kéo dài chuỗi DNA PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PHẢN ỨNG LAMP Điều đặc biệt là, khi sử dụng dẫn chất deoxy- nucleotide triphosphate (dNTP), theo qui luật tổng hợp DNA, các gốc phosphate đƣợc giải phóng ra sẽ kết hợp với i-on Mg++ có trong thành phần của phản ứng để tạo nên chất tủa vẩn đục Mg2P2O7 (Magnesium pyrophosphate) có màu trắng. Từ nguồn khuôn DNA/RNA khoảng vài picogram (pg), thậm chí vài femtogram (fg)) DNA là đủ (1 microgram = 10 3 nanogram = 10 6 picogram = 10 9 femtogram) đã có khoảng vài trăm ngàn chuỗi DNA vòm sinh ra đủ để tạo nên chất vẩn đục màu trắng của phản ứng dƣơng tính. Có bao nhiêu chuỗi nucleotide ban đầu làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 46 khuôn, kết quả sẽ có một hàm lƣợng chừng ấy sản phẩm tƣơng ứng đƣợc tạo ra theo tỷ lệ thuận và nếu chuẩn hóa thành phần MgSO4 để biết lƣợng ion Mg++, chúng ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng sản phẩm DNA vòm; và đó cũng là nguyên lý định lƣợng của phản ứng LAMP định lƣợng (real-time LAMP) [4]. Một vài phƣơng pháp khác có thể sử dụng để xác định chắc chắn phản ứng LAMP xảy ra hay không. Thông thƣờng nhất đó là điện di trên gen agarose, với thuốc nhuộm nhƣ ethidium bromide. Dƣới ánh sáng UV, bản gel có cấu trúc giống thang chuẩn DNA từ kích thƣớc nhỏ nhất của DNA đến tận các giếng, điều này là do sản phẩm có cấu trúc gốc vòng (stem loop) có độ dài khác nhau của phản ứng LAMP. Một cách khác, sản phẩm có thể quan sát trực tiếp trong ống phản ứng sau khi thêm thuốc nhuộm SYBR Green I (Karlsen et al. 1995). Thêm thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent detection reagent- FDR) vào hỗn hợp phản ứng LAMP cho phép quan sát sản phẩm trực tiếp dƣới tia UV và làm giảm sự nhiễm bẩn đối với sản phẩm. Calcein trong FDR kết hợp với ion Mg++ và loại bỏ những phần cặn. Nhƣ đã biết ion pyrophosphate đƣợc tạo ra nhƣ sản phẩm phụ của phản ứng LAMP, chúng sẽ kết hợp và loại manganese từ calcein, và kết quả là chỉ nhận dạng đƣợc các gen đích phát quang [6, 7]. Ngoài ra một trọng lƣợng phân tử nhỏ PEI có thể thêm vào sản phẩm phản ứng, sau khi ly tâm trong 10s ở 6000rpm để tạo thành phức PEI-sản phẩm không hoà tan có chứa mẫu dò huỳnh quang đƣợc gắn nhãn. Ống phản ứng có thể quan sát dƣới đèn UV thông thƣờng hoặc bằng kính hiển vi huỳnh quanh [8]. Tƣơng tự, cũng giống nhƣ phƣơng pháp PCR định lƣợng (real-time PCR) dựa vào hàm lƣợng phát quang (fluorescence) sinh ra tƣơng ứng với sản phẩm có từ khuôn; LAMP cũng đƣợc phát triển thành LAMP định lƣợng (real-time LAMP) trên cơ sở xác định hàm lƣợng chất tủa (turbidity), đo đƣợc bằng một dụng cụ gọi là vẩn kế (turbidimeter) có tỷ lệ thuận với sản phẩm DNA-vòm sản sinh ra trong phản ứng [5, 9]. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP LAMP Phát hiện mầm bệnh virus Một số virus sử dụng phƣơng pháp LAMP phát hiện nhƣ: Corona (SARS), Distemper, Herpes, Influenza, Japanese encephalitis, Measles, Mumps, Newcastle, Parvovirus, West Nile virus etcMột số xét nghiệm LAMP đã đƣợc phát triển nhằm phát hiện mầm bệnh do virus gây ra ở ngƣời [10-12], động vật [6, 11] và cá [13].Đối với các tác nhân là virus, đa phần kỹ thuật RT-LAMP đƣợc ứng dụng để phát hiện [14, 15]. Những nghiên cứu này cho thấy sử dụng phƣơng pháp LAMP cho độ nhạy tốt hơn so với phƣơng pháp PCR hay nested PCR. Phát hiện mầm bệnh vi khuẩn Một vài vi khuẩn gây bệnh đã đƣợc phát hiện thành công bằng kỹ thuật LAMP. Báo cáo đầu tiên vào năm 2004 bởi Savan [16] đối với bệnh edwardsiellosis, một bệnh ở cá gây ra bởi Edwardsiella tarda ở Nhật Bản. Sử dụng gen haemolysin cho thấy, phản ứng LAMP có độ nhạy cao hơn so với PCR, không có phản ứng dƣơng tính nào đối với 12 chủng vi khuẩn liên quan. Sử dụng 4 mồi của gen eip18 Yeh và cs đã phát hiện nhanh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá trê và không có phản ứng đặc hiệu xảy ra khi kiểm tra với 12 dòng vi khuẩn khác [17]. Đối với vi khuẩn chủng E. coli, phƣơng pháp LAMP cũng đƣợc sử dụng, trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa trên các gen malB [18], gen stx2 [19],... Phát hiện mầm bệnh ký sinh Năm 2004, Ikadai và cs đã sử dụng mồi đƣợc thiết kế từ gen 18S rRNA cho phƣơng pháp PCR và LAMP để phân tích và phát hiện nhanh ký sinh trùng Babesia gibsoni ở chó. [20]. Phƣơng pháp LAMP cũng đƣợc sử dụng để phát hiện nhanh các ký sinh trùng khác nhƣ: African trypanosomes, Plasmodium falciparum... So với phƣơng pháp PCR, LAMP có độ nhạy hơn thậm chí tới 100 lần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 47 KẾT LUẬN Có rất nhiều phƣơng pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh, trong đó đa phần là các kỹ thuật nuôi cấy, xác định hình thái học vẫn sử dụng nhiều. Tuy nhiên, những kỹ thuật này thƣờng mất thời gian, phức tạp, độ chính xác không cao. Kỹ thuật LAMP khắc phục đƣợc hầu hết những nhƣợc điểm của các phƣơng pháp trƣớc đây. Trên thế giới có hàng trăm bộ kit đƣợc xây dựng dựa trên kỹ thuật này. Đối với Việt Nam, đây là một hƣớng đi mới nhằm xây dựng các bộ kít chuẩn đoán nhanh và chính xác các tác nhân gây bệnh góp phần làm giảm thiểu bệnh, nâng cao sức khoẻ cộng đồng. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. 1. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N. and Hase T., 2000,"Loop-mediated isothermal amplification of DNA".Nucleic Acids. Res., 28(12), 7. [2]. 2. Mori Y., Nagamine K., Tomita N. and Notomi T., 2001,"Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation".Biochem. Biophys. Res., 289(1), 150- 154. [3]. 3. Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase T. and Notomi T., 2001,"Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template".Clin. Chem., 47(9), 1742- 1743. [4]. 4. Goto M., Honda E., Ogura A., Nomoto A. and Hanaki K.-I., 2009,"Colorimetric detection of loop- mediated isothermal amplifcation reaction by using hydroxy naphthol blue".BioTechniques, 46, 167-172. [5]. 5. Parida M., Sannarangaiah S., Dash P. K., Rao P. V. L. and Morita K., 2008,"Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases".Reviews in Medical Virology, 18(6), 407-421. [6]. 6. Imai M., Ninomiya A., Minekawa H. and T. N., 2007,"Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop- mediated isothermal amplification method".J. Virol. Methods, 141, 173–180. [7]. 7. Yoda T., Suzuki Y., Yamazaki K., Sakon N., Kanki M., Aoyama I. and Tsukamoto T., 2007,"Evaluation and application of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of noroviruses.".J. Med. Virol., 79(3), 326-334. [8]. 8. Mori Y., Hirano T. and Notomi T., 2006,"Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers".BMC Biotechnol., 10(6), 3. [9]. 9. Mori Y., Kitao M., Tomita N. and Notomi T., 2004,"Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA.".J. Biochem. Biophys. Methods., 59(2), 145-157. [10]. 10. Bista B. R., Ishwad C., Wadowsky R. M., Manna P., Randhawa P. S., Gupta G., Adhikari M., Tyagi R., Gasper G. and Vats A., 2007,"Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of BK Virus".J. Clin. Microbiol., 45(5), 1581–1587. [11]. 11. Jayawardena S., Cheung C.Y., Barr I., Chan K.H., Chen H., Guan Y, Peiris J.S.M and Poon L.L.M., 2007,"Loop-Mediated Isothermal Amplification for Influenza A (H5N1) Virus".Emerg Infect Dis., 13(6), 899–901. [12]. 12. Moslemi E., Shahhosseiny M. H., Javadi G., Praivar K., Sattari T. N. and Amini H. K., 2009,"Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran ".Afr. J. Microbiol. Res., 3(8), 439-445. [13]. 13. Gunimaladevi I., Kono T., Venugobal M.N. and Sakai M., 2004,"Detection of KOI herpes virus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification".J. fish. Dis., 27(10), 583- 589 [14]. 14. Soliman H. and El-Matbouli M., 2006,"Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS)".Vet. Microbiol., 114(3-4), 205-213. [15]. 15. Wang Y., Kang Z., Gao H., Gao Y., Qin L., Lin H., Yu F., Qi X. and Wang X., 2011,"A one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection and discrimination of infectious bursal disease virus.".Virol. J., 8(1), 108. [16]. 16. Savan R., Igarashi A., Matsuoka S. and Sakai M., 2004,"Sensitive and Rapid Detection of Edwardsiellosis in Fish by a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method".Appl. Environ. Microbiol., 70(1), 621–624. [17]. 17. Yeh H.-Y., Shoemaker C. A. and Klesius P. H., 2005,"Evaluation of a loop-mediated Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Phú Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 90(02): 43 - 48 48 isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri".J. Microbiol. Methods, 63, 36- 44. [18]. 18. Hill J., Beriwal S., Chandra I., Paul V. K., Kapil A., Singh T., Wadowsky R. M., Singh V., Goyal A., Jahnukainen T., Johnson J. R., Tarr P. I. and Vats A., 2008,"Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli".J. Clin.Microbiol., 46(8), 2800-2804. [19]. 19. Franz E., Klerks M. M., Vos O. J. D., Termorshuizen A. J. and Bruggen A. H. C. v., 2007,"Prevalence of Shiga Toxin - Producing Escherichia coli stx1, stx2, eaeA, and rfbE Genes and Survival of E. coli O157:H7 in Manure from Organic and Low-Input Conventional Dairy Farms".Appl.Eviron.Microbiol., 73(3), 2180– 2190. [20]. 20. Ikadai H., Tanaka H., Shibahara N., Matsuu A., Uechi M., Itoh N., Oshiro S., Kudo N., Igarashi I. and Oyamada T., 2004,"Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method".J. Clin. Microbiol., 42, 2465 - 2469. SUMMARY LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)- NEW METHOD TO CREATING RAPID DECTECTION KIT Hoang Phu Hiep 1 , Le Quang Huan 2* 1.College of Education - TNU; 2.Insitue of Biotechnology, VAST. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) was a novel nucleic acid amplification method that amplified DNA or RNA under isothermal conditions using a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement activity. The DNA produced in LAMP is stem-loop DNA structures with several inverted repeats of the target and considerably higher than PCR based amplification. LAMP is the amplification method with high specificity, efficiency, rapidity and products can be directly visualised in the reaction tube, therefore LAMP method may be a particularly useful method for infectious disease diagnosis in low and middle income countries such as such as virus, bacteria, parasite... Key words: LAMP, PCR, BIP primer, FIP primer, stem- loop DNA. * Email: huanlequang@gmail.com Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên