Khóa luận Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease cao trong thủy phân đậu tương

ng nghiệp [10, 17] Protease được sử dụng để xử lý nhằm tận dụng các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa và hệ số tiêu hóa thức ăn. Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể bổ sung vào khẩu phần ăn trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm tăng nhanh quá trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độtăng trọng của động vật, nhất là động vật non. Ngoài ra, protease còn được sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch acid amin làm thức ăn cho ấu trùng tôm [18]. Y học [11] Chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp giàu protein và acid amin dùng trong nuôi cấy VK và các VSV khác. Người ta còn dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch). Một số protease như trypsin, α–chymotrypsin dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, bệnh nghẽn mạch, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp, bệnh thiếu enzyme bẩm sinh,...GS. TSKH. Phan Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với viện Quân Y 108 nghiên cứu sử dụng protease có tên gọi prozimabo để điều trị phỏng [3]. Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực như xử lý phim X quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc (Fujiwara et al., 1991; Ishikawa et al., 1993), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang et al., 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994) [7]. 1.4. Phương pháp lên men chìm và lên men bề mặt 1.4.1. Lên men chìm Vi sinh vật phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn Cacbon và nguồn Nito. Để tạo điều kiện cho VSV sinh trưởng tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường một số chất thích hợp như: bột đậu tương, tinh bột, cám mì Các thiết bị lên men dễ cơ khí và tự động hóa. Song phương pháp nuôi cấy chìm cũng có một số nhược điểm sau [8]: Đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vô trùng tuyệt đối. Trong quá trình nuôi cấy phải khuấy liên tục Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ 1.4.2. Lên men bề mặt Là phương pháp nhằm tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Nguyên liệu chính là đậu tương, cám gạo môi trường được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 40-90%, tùy chủng giống. Khử trùng ở 1150C trong 15-20 phút, để nguội rồi cho bào tử VSV vào [4]. Ưu điểm của phương pháp [8]: Độ thoáng khí cao, dễ thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản không đòi hỏi quá cao về trang thiết bị. Môi trường không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm vi sinh vật lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khô, bảo quản và dễ vận chuyển Nhược điểm của phương pháp [8] Không thể kiểm soát hay điều chỉnh môi trường một cách chính xác theo ý muốn. Không thể áp dụng có hiệu quả các phương pháp tối ưu Khó tinh sạch 1.5. Tình hình nghiên cứu về enzyme protease trong thủy phân đậu tương Các nghiên cứu đều theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giũa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng của enzyme trong thực tế. 1.5.1. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Vũ Ngọc Bội (2004) nghiên cứu protease của chủng Bacillus sp. CPE thu nhận từ B. subtilis S5 có hoạt tính 33U/g, để chế biến nước mắm[7]. Âu Thị Bích Phượng (2006), protease từ Bacillus sp. đạt 1,7 U/g, Lê Văn Việt (2007) protease từ Bacillus sp. đạt 30,9 (U/g) [17]. Đỗ Trần Ngoan (2007) nghiên cứu protease kiềm tính từ B. subtilis [2]. Trần Ngọc Hùng (2010) nghiên cứu protease 14 (U/g) từ B.subtilis để sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm. Trần Thị Hồng Nghi và cs. (2009), nghiên cứu protease từ B. subtilis để thủy phân phụ phẩm cá tra[18]. Từ Acinetobacter sp. QN6 phân lập từ biển sinh tổng hợp protease cao Quyền Đình Thi, và cs. (2007)[12]. Lê Thị Bích Phượng và cs. (2012) đã nghiên cứu phân lập, tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp protease [7]. Trần Thanh Trúc và cs (2015) đã xác đinh được điều kiện nuôi cấy tối ưu Aspergillus niger sinh tổng hợp protease cao [16]. Lê Văn Việt Mẫn và cs (2006) đã khảo sát một số tính chất của chế phẩm protease từ A. oryzae để sản xuất nước mắm, rút ngắn thời gian thủy phân protein[14]. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%) và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%). Các tác giả Devi MK và cs. (2008) đã xác định đặc điểm protease của Aspergillus niger; Hajji M và cs. (2007) khảo sát protease của A. clavatus(2007); Agarwal D, và cs. (Năm 2008) nghiên cứu khả năng sinh protease của Penicillium sp.[19, 21, 26]. Nhiều công trình nghiên cứu về protease từ Bacillus như: B. cereus (Sirecka et al., 1998), B. sphaericus (Singh et al., 1999), B. stearothermophilus (Kim et al, 2002), B. subtilis (Yang.et al., 2000), B. mojavensis (Beg và Gypta et al., 2003), B. lichieniformis (Mancrzinger et al., 2003, Sareen et al., 2005)[2, 32]. Protease từ A.oryzae trong lên men rắn ứng Jarun Chutmanop [20]. Jin Fujita và cs.(2003), Morten Carlsen (1995, 2003), Ruohang Wang và cs.(2003) đã nghiên cứu sản xuất protease từ A. oryzae [31]. Guowan Su và cs. (2010) thủy phân protein đậu tương bởi protease từ A. oryzae, [33]. . MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn được chủng nấm sợi và vi khuẩn có hoạt tính protease cao từ đất trồng đậu tương.. Tối ưu điều kiện lên men xốp các chủng nấm sợi và vi khuẩn tuyển chọn sử dụng cơ chất là khô đậu tương (KĐT) để sản xuất enzyme protease. 2.2. Nội dung nghiên cứu Phân lập các chủng nấm sợi và vi khuẩn từ mẫu đất kí hiệu là DOM (QB) và mẫu đất kí hiệu EM (QO). Các mẫu đất được lấy tại vùng trồng đậu tương ngoại thành Hà Nội). Tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có hoạt tính protease và chọn ra chủng có hoạt tính protease cao nhất. Tối ưu các điều kiện lên men xốp cơ chất khô đậu tương với chủng nấm sợi và vi khuẩn được tuyển chọn nhằm thu được hoạt tính protease cao. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học chủng chủng nấm sợi và vi khuẩn tuyển chọn. 2.3. Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy 2.3.1. Vật liệu Các chủng giống được phân từ mẫu đất kí hiệu là DOM (QB) và EM (QO), sau đó được bảo quản tại phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Cơ chất: Khô đậu tương 2.3.2. Hóa chất Hóa chất được dùng để chuẩn bị môi trường như: cao nấm men, peptone, glucose, casein, khoai tây, các loại muối khoáng, thuốc thử Folin-Ciocalteu, các hóa chất dùng trong phản ứng sinh hóa có độ tinh khiết ở mức phân tích được cung cấp bởi các Công ty đại diện hóa chất của Đức, Mỹ, Anh, Trung Quốc tại Việt Nam. 2.3.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường Luria-Bertani (LB) Bảng 2.1. Công thức môi trường LB Thành phần Khối lượng (g) Cao nấm men 10 Peptone 5 NaCl 5 Agar 10 pH = 6.5±0.2 Môi trường (Potatose Dextrose Agar: PDA) Bảng 2.2. Công thức môi trường PDA Thành phần Khối lượng (g) Khoai tây 200 Glucose 20 Agar 20 pH = 7±0.2 Môi trường PDB: là môi trường PDA bỏ đi thành phần agar Môi trường định tính enzyme protease bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Bảng 2.3. Công thức môi trường định tính enzyme protease Thành phần Khối lượng (%) Đệm photphate pH =7 97,8 Casein 0,2 Agar 2 pH = 7±0.2 Môi trường lên men rắn: khô đậu tương và tinh bột 2.3.4. Trang thiết bị Dụng cụ: đĩa petri, ống falcon, ống eppendorf, đầu tip, pipet, đèn cồn Thiết bị: Các thiết bị sử dụng trong khóa luận này thuộc Phòng Các chất Chức năng sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. Dưới đây là bảng liệt kê chi tiết: Bảng 2.4. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Thiết bị Nước sản xuất 1 Tủ cấy vi sinh (Box Laminar-PII) Đức 2 Cân OHAUS PA 213 Mỹ 3 Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý 4 Tủ lắc ổn định Wis-10R Hàn Quốc 5 Nồi khử trùng HVE-50 Nhật Bản 6 Máy Vortex Trung Quốc 7 Tủ lạnh 40C, -200C (Pinimax), -800C (MDF-192) Nhật Bản 8 Kính hiển vi Trung Quốc 9 Lò vi sóng 20 lit, 30lit Liên doanh 10 Máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels Nhật Bản 11 Micropipet EMC-LAB Đức 12 Máy đo OD 752N Đức 13 Máy khuấy từ gia nhiệt AHYQ 85-2 Trung Quốc 14 Tủ sấy XMTA Trung Quốc 15 Máy li tâm lạnh KUBOTA 2010 Mỹ 16 Các máy móc chuyên dụng khác 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp phân lập và giữ chủng Cân 0,1 g đất đã xử lý cho vào 900 µl nước cất khử trùng, dùng máy vortex hòa tan. Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-3-10-7 là các nồng độ thích hợp để phân lập. Hút 50µl dịch pha loãng ở các nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường phân lập. Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch. Nuôi trong tủ ấm 370C khoảng 1 ngày sau đó cấy ria các khuẩn lạc để tạo các dòng thuần. Giữ chủng trong glycerol 40% [15]. 2.4.2. Phương pháp vi sinh 2.4.2.1. Hoạt hóa chủng Chủng nấm sợi được hoạt hóa lại trên môi trường PDA, sau đó nuôi ở điều kiện nhiệt độ 300C±20C trong 2-3 ngày. Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường LB, sau đó nuôi ở nhiệt độ 370C trong 24h. Sau đó bảo quản các chủng này trong tủ -40C. 2.4.2.2. Phương pháp lên men chìm Chủng nấm sợi sau khi được hoạt hóa, được nuôi lỏng trong môi trường PDB ở điều kiện nhiệt độ 300C±20C, lắc 200rpm/phút, thời gian 3 ngày sau đó thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease. Chủng vi khuẩn sau khi đã hoạt hóa, được nuôi lỏng trong môi trường LB ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200rpm/phút, thời gian 2 ngày sau đó thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease. 2.4.3. Phương pháp quan sát hình thái Cấy chủng nấm mốc lên môi trường PDA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, chủng vi khuẩn trên môi trường LB để trong tủ ấm 370C trong 24h. Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm mốc trên đĩa như: màu sắc, hình dạng, kích thước, đặc điểm bề mặt khuẩn lạc, đặc điểm phát triển trên môi trường rắn (lồi, lõm, dẹt) [12]. 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính protease bằng đo đường kính vòng phân giải casein Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng giữa enzyme protease và cơ chất casein trên môi trường casein - agar khi cho protease tiếp xúc với casein ở nhiệt độ thích hợp xảy ra phản ứng thủy phân tạo thành vòng tròn thủy phân trong suốt. Khả năng sinh enzyme protease được đánh giá dựa trên sự thủy phân casein thông qua đường kính của vòng phân thủy phân casein với sự nhận biết dựa vào chất chỉ thị Coomassie Brillant Blue R - 250 [30] [25]. Cách tiến hành: Dùng pipet hút 50µl dịch chiết enzyme được nhỏ vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar vầ 0.2% casein (cơ chất) trong đệm phosphate 0.1M, pH7. Đĩa thạch được nhỏ dịch chiết được ủ ở 40C trong 4h để enzyme khuếch tán đều trên đĩa thạch. Sau đó chuyển ra ủ trong tủ ấm 370C trong 24h. Kiểm tra kết quả: Nhuộm bởi chất chỉ thị màu Coomassie Brilliant Blue R-250, pha với lugol (1:3) pha trong dung dịch methanol, acid acetic, nước cất theo tỷ lệ 3:1:6 trong 1 h. Cách đánh giá khả năng tạo enzyme: Dùng thước đo đường kính vòng phân giải: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính của khoan lỗ thạch, ∆D là đường kính vòng phân giải của chủng VSV sau khi trừ đi đường kính của khoan lỗ thạch. ∆D > 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh ∆D > 20mm: hoạt tính enzyme mạnh ∆D > 10mm: hoạt tính enzyme trung bình ∆D < 10mm: hoạt tính enzyme yếu 2.4.5. Phương pháp hóa sinh Phương pháp Anson cải tiến định tính enzyme protease [7] [31] [17]. 2.4.5.1. Nguyên lý của phương pháp Casein bị phân giải bởi protease, sau đó kết tủa protease dư thừa bằng TCA. Sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay các acid amin, trong các acid amin thì tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ enzyme. 2.4.5.2. Hóa chất 0,1N phosphate buffer pH 6.0 gồm: 0.2M monobasic sodium phosphate (NaH2PO4) 28.8g/l. Dibasic sodium phosphate gồm: Na2HPO4.7H2O: 53.35g/l Na2HPO4.12H2O: 71.70g/l Dung dịch đệm phosphate buffer pH 6.0 (200ml): 87.7ml dung dịch A + 12.3 ml dung dịch B + 100ml nước cất vô trùng. Dung dịch casein 0.6%: pha 0.6g Casein trong 100 ml dung dịch NaOH 0.1N sau đó đun nóng ở nhiệt độ 80-900C (không sôi) đến khi tan hoàn toàn, chuẩn độ bằng 0.1N H3PO4 đến pH 6.0. Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml Dung dich Na2CO3 0,5M: hòa tan 5.3 g Na2CO3 trong nước cho đủ 100 ml. Thuốc thử Folin-Ciocalteu (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4). Dung dịch Tyrosin chuẩn: 10mg/100ml (55.2 micromol) 2.4.5.3. Chuẩn bị đường chuẩn Bảng 2.5. Xây dựng đường chuẩn tyrosine Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Blank 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 Dung dịch HCl 0.1M (ml) 0.1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 Lượng tyrosine tương ứng (µM) 0 55,2 110,4 165,6 220,8 276 Dung dịch Na2CO3 0.5M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thuốc thử Folin-Ciocalteu (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Lắc mạnh, ủ 370C trong 20 phút, đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 1 là ống blank, các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODBlank). 2.4.5.4. Phương pháp tiến hành Chiết mẫu Mẫu cân chính xác 1g (đối với mẫu rắn) hoặc 1 ml (đối với mẫu lỏng) cho vào becher, định mức vừa đủ 10ml bằng nước cất đem lắc trên máy lắc trong vòng 15 phút. Đem ly tâm lạnh với 10000 vòng/ phút trong 4 phút, thu dịch, bỏ bã (đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhất mẫu). Tiến hành Bảng 2.6. Phương pháp xác định hoạt độ protease Dung dịch, hóa chất Ống nghiệm Test Blank Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0,25 0,25 Ủ ở 370C trong 5 phút Dung dịch casein 0.6% (ml) 0,25 0 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 0,5 Dung dịch casein 0.6% (ml) 0 0,25 Lắc đều và giữ ở 37oC trong 30 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 0,5 0 Để yên 10 phút, lọc hoặc li tâm lấy thu dịch lọc Dịch lọc (ml) 0,1 0,1 Na2CO3 0.5M(ml) 0,5 0,5 Thuốc thử Folin-Ciocalteu (ml) 0,1 0,1 Giữ ở 37 oC trong 30 phút sau đó đo OD660nm Tính ΔOD = ODTest – ODBlank, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được µM tyrosine. 2.4.5.5. Tính kết quả Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (37oC, pH 6 ) thủy phân casein trong một phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn. Hoat tính protease=X.K.Vt.v Trong đó: V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống test hoặc ống blank (ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t: thời gian thủy phân (phút) K: độ pha loãng enzyme X: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn Hoạt tính enzym: (Unit/g, Unit/ ml) 2.4.6. Phương pháp tách chiết dịch enzyme thô từ môi trường lên men xốp và định tính enzyme. Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của enzyme, dùng nước cất vô trùng hòa tan tạo dịch enzyme thôi. Sau khi lên men trong môi trường lên men xốp sinh enzyme thô. Tiến hành thu dịch enzyme thô để đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Quá trình thu nhận enzyme thô: Hình 2.1. Sơ đồ quá trình thu nhận enzyme thô Chú thích: Dịch nổi là dịch enzyme thô được sử dụng để xác định hoạt tính protease 2.4.7. Phương pháp tối ưu điều kiện lên men xốp 2.4.7.1. Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu Thí nghiệm nhằm mục đích xác định tỷ lệ nguyên liệu của khô đậu tương và tinh bột để thu nhận được hoạt tính enzyme protease cao nhất với các điều kiện nuôi cấy như sau: khối lượng cơ chất lên men trong mỗi bình tam giác lên men là 15g, nhiệt độ 300C±20C lượng giống cho vào môi trường lên men là 4%, độ ẩm cơ chất sau khi lên men là 50%, độ dày môi trường 2,5cm. Thời gian lên men xốp là 3 ngày. Bảng 2.7. Tỷ lệ nguyên liệu môi trường lên men rắn Khô đậu tương (%) Tinh bột (%) 90 10 80 20 70 30 60 40 50 50 Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu tỉ lệ nguyên liệu KĐT/TB 2.4.7.2. Tối ưu độ ẩm cơ chất khô đậu tương Tiến hành tối ưu độ ẩm cơ chất KĐT trong môi trường lên men xốp. Khô đậu tương có độ ẩm cơ chất sau khi lên men từ 40-60%. Lên men xốp trong 3 ngày ở 300C với các điều kiện lên men như ở mục 2.4.7.1. Tiến hành xác định hoạt tính protease. Tìm ra độ ẩm cơ chất thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm: Xác định độ ẩm cơ chất thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu độ ẩm cơ chất khô đậu tương 2.4.7.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng VSV, tôi tiến hành cấy vào với lượng giống cấy khác nhau lần lượt là 2%, 4%, 6%, 8%, 10% hỗn dịch bào tử /15g cơ chất. Điều kiện lên men giống như ở mục 2.4.7.1. Tiến hành thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính enzyme. Tìm ra tỷ lệ giống thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu tỉ lệ giống cấy 2.2.7.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng VSV, tôi tiến hành lên men trong môi trường lên men xốp ở các điều kiện nhiệt độ lần lượt là 250C, 300C, 350C. Điều kiện lên men giống như ở mục 2.4.7.1. Tiến hành thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính enzyme.Tìm ra nhiệt độ nuôi cây thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 2.4.7.5. Tối ưu thời gian lên men Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng VSV, tôi tiến hành lên men ở các khoảng thời gian khác nhau lần lượt là 36h, 48h, 72h, 96h. Điều kiện lên men tương tự như ở mục 2.4.7.1. Tiến hành thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính enzyme. Tìm ra khoảng thời gian lên men thích hợp. Sơ đồ thí nghiệm: Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu thời gian lên men 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên lặp lại 3 lần. Thông số tương ứng với kết quả khảo sát đã lựa chọn từ thí nghiệm trước được sử dụng làm nhân tố cố định cho thí nghiệm kế tiếp. Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm thống kê ANOVA và phần mềm Excel. . KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi và vi khuẩn có khả năng sinh protease từ chế phẩm. 22 chủng được phân lập từ Dom (QB) và EM (QO), gồm: 11 chủng nấm sợi và 11 chủng vi khuẩn được ký hiệu là N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, N11, D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11. Các chủng nấm sợi phân lập được sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 280C±20C và các chủng vi khuẩn sau 24 h nuôi cấy trên môi trường LB ở 370C. Hình thái, đặc điểm cơ bản về mặt khuẩn lạc tóm tắt như sau: Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật phân lập STT Tên chủng Mô tả đặc điểm hình thái Hình ảnh 1 N1 Bào tử màu xanh rêu đậm, hệ sợi màu nâu trắng, nấm không sinh sắc tố. 2 N2 Bào từ màu xanh rêu,hệ sợi nấm khi mới phát triển mép có viền trắng, hệ sợi khi già có màu nâu đen, khi phát triển sinh sắc tố màu nâu đen. 3 N3 Bề mặt bông xốp, mịn, hệ sợi và bào tử màu đen, nấm sinh sắc tố màu đen. 4 N4 Hệ sợi màu xanh lá mạ, hệ sợi màu trắng bông xốp, bào tử màu xanh, nấm không sinh sắc tố 5 N5 Hệ sợi màu xanh đen, bề mặt nhung mịn, nấm sinh sắc tố vàng 6 N6 Hệ sợi màu trắng, bào tử màu nâu, nấm không sinh sắc tố. 7 N7 Bào tử màu xanh lá mạ, hệ sợi màu trắng, bào tử màu xanh nâu, nấm không sinh sắc tố. 8 N8 Hệ sợi bông xốp có màu nâu, bào tử màu nâu đen, nấm không sinh sắc tố. 9 N9 Hệ sợi màu xanh lá mạ bào tử màu trắng, nấm không sinh sắc tố. 10 N10 Bào tử màu nâu đen, hệ sợi màu trắng, nấm không sinh sắc tố. 11 N11 Hệ sợi màu vàng nâu, bào tử màu nâu, nấm không sinh sắc tố. 12 D1 Khuẩn lạc tròn, đường kính 6mm, bề mặt bóng và lồi có màu trắng trong 13 D2 Khuẩn lạc tròn, đường kính 6mm, có nhân màu trắng đục bề mặt nhăn lồi lên bề mặt môi trường, mép có răng cưa, màu trắng đục 14 D3 Khuẩn lạc tròn, đường kính 5mm, có nhân màu trắng đục, bề mặt nhăn lồi lên bề mặt môi trường. 15 D4 Khuẩn lạc tròn, màu trắng trong, đường kính 6mm bề mặt bóng, mép có răng cưa. 16 D5 Khuẩn lạc tròn màu trắng đục mép màu trắng trong, đường kính 4mm, bề mặt bóng, lồi lên bề mặt môi trường. 17 D6 Khuẩn lạc tròn nhân màu trắng đục mép màu trắng, đường kính 7mm, bề mặt bông xốp 18 D7 Khuẩn lạc tròn, đường kính 3mm, màu trắng đục mép có răng cưa, có nhân màu trắng lồi ở giữa. 19 D8 Khuẩn lạc tròn, đường kính 5mm, màu trắng đục, bề mặt bóng. 20 D9 Khuẩn lạc màu trắng trong, đường kính 4mm, bề mặt bóng trơn 21 D10 Khuẩn lạc tròn, đường kính 3mm, mép bông xốp màu trắng đục, có nhân ở giữa 22 D11 Khuẩn lạc hình hoa nhiều cánh, đường kính 6mm, bề mặt bóng, ở giữ nhân màu trắng đục, lồi lên bề mặt môi trường. 3.2. Tuyển chọn sơ bộ các chủng có hoạt tính protease Để đánh giá sơ bộ khả năng sinh protease của các chủng VSV phân lập được tôi tiến hành tuyển chọn các chủng có hoạt tính protease theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch mô tả ở mục 2.4.4. Sau khi làm thuần các chủng tiến hành nuôi lỏng các chủng trên với nấm sợi nuôi lỏng 3 ngày ở nhiệt độ 300C lắc 180rpm, và các chủng vi khuẩn nuôi lỏng 72 h ở nhiệt độ 370C lắc 180rpm. Sau đó li tâm 12000rpm trong 5 phút thu dịch enzyme thô và kiểm tra hoạt tính protease. Kết quả thu được như sau: Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính protease các chủng nấm sợi phân lập Thời gian Chủng 36 h 48 h 72 h ∆D (mm) ∆D (mm) ∆D (mm) N1 - - - N2 - - - N3 - - - N4 9 12 10 N5 10 1 11 N6 13 16 11 N7 10 14 13 N8 - - - N9 8 12 10 N10 12 15 13 N11 30 31 29 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính protease các chủng vi khuẩn phân lập Thời gian Chủng 24 h 48 h 72 h ∆D (mm) ∆D (mm) ∆D (mm) D1 - - - D2 20 19 14 D3 24 22 17 D4 15 14 13 D5 11 10 9 D6 21 18 16 D7 14 13 11 D8 18 14 12 D9 15 13 12 D10 18 15 14 D11 19 14 13 Hình 3.1. Vòng phân giải casein trên đĩa thạch của các chủng phân lập được Từ kết quả trên cho thấy, trong 22 chủng phân lập được từ hai mẫu đất EM và DOM, nhuộm màu với comassi blue/ pha với lugol trong dung dịch methanol sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch casein tôi thấy có 17 chủng xuất hiện vòng phân giải casein, tức là 17 chủng này có hoạt tính protease, chiếm tỉ lệ 77.27%, với hoạt động enzyme mạnh yếu khác nhau (hình 3.1). Số chủng VSV có khả năng sinh protease khá nhiều đặc biệt là các chủng vi khuẩn, đa số các chủng VSV có hoạt tính protease mạnh và trung bình, chỉ có một số ít chủng không có hoạt tính và một số chủng có hoạt tính rất mạnh (mục 2.4.4). Các chủng nấm sợi có khả năng sinh protease cao nhất sau 48 h nuôi cấy và các chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease cao nhất sau 24 h nuôi cấy. Vào thời điểm này VSV đang ở kỳ đầu của pha tích tụ sản phẩm trao đổi yếu tổng hợp protein và xây dựng tế bào nên tích tụ sản phẩm trao đổi chất rất ít. Sau 48 h trở đi đối với nấm sợi và 24 h trở đi đối với vi khuẩn thì lượng enzyme giảm đáng kể do tế bào số sản phẩm trao đổi chất trở thành nguồn dinh dưỡng cho VSV. Trong số 17 chủng có hoạt tính protease, tôi đã chọn ra được 9 chủng có hoạt tính protease có hoạt tính cao (đường kính lớn hơn 15 để tiếp tục nghiên cứu). Các chủng được chọn lọc gồm N6, N10, N11, D2, D3, D6, D8, D10, D11. Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của 9 chủng được tuyển chọn tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường LB, lắc 200rpm/ phút, nhiệt độ 370C, thời gian 24 h và các chủng nấm sợi trong môi trường PDA, lắc 200rpm/phút, nhiệt độ 300C, thời gian 72 h. Thu dịch enzyme thô và kiểm tra hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến (mục 2.4.4). Kết quả hoạt tính 9 chủng được tuyển chọn như sau: Bảng 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính của 9 chủng được chọn Chủng VSV Vòng phân giải trên đĩa thạch Hoạt tính protease TB (U/ml) Lần 1 Lần 2 ∆D (mm) ∆D (mm) N6 16 15 1053±117,03 N10 19 19 1443±100,03 N11 31 32 1700±89,93 D2 21 22 1304±87,06 D3 23 24 1212±112,03 D6 23 22 1345±77,09 D8 21 19 1173±102,72 D10 20 19 1072±85,71 D11 15 20 1189±76,38 Hình 3.2. Vòng phân giải casein trên đĩa thạch của 9 chủng được tuyển chọn Qua kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.2 ở trên cho thấy qua các lần thử hoạt tính so với các chủng VSV được tuyển chọn thì chủng nấm sợi N11 có đường kính vòng thủy phân lớn nhất: 31mm và hoạt tính protease cao nhất 1700±89,93( U/ml) qua các lần tuyển chọn. Vì vậy tôi chọn chủng nấm sợi N11 này để tối ưu điều kiện lên men xốp cơ chất khô đậu tương nhằm thu được hoạt tính protease cao nhất cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Tối ưu điều kiện sinh enzyme protease 3.3.1. Tối ưu tỉ lệ nguyên liệu Để tìm tỉ lệ nguyên liệu thích hợp cho chủng nấm sợi N11 tiến hành nuôi cấy chủng nấm sợi N11 trên môi trường nuôi cấy giống cấp 1 PDB ở nhiệt độ 300C ±20C, tốc 200rpm sau 2 ngày sau đó cấy vào môi trường lên men rắn khối lượng 15g với tỷ lệ tiếp giống 4%, độ ẩm 50%, nhiệt độ 300C ±20C đồng thời thay đổi tỉ lệ khô đậu tương và tinh bột. Kết quả được trình bày như sau: Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ khô đậu tương và tinh bột đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Tỷ lệ KĐT/TB (%) D (mm) d (mm) ∆D (mm) Hoạt tính protease TB (U/g) 90/10 36 5 31 504±73,95 80/20 36 5 31 586±104,76 70/30 37 5 32 678±111,20 60/40 35 5 30 856±80,89 50/50 38 5 33 1050±81 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ KĐT/TB đến hoạt độ protease của chủng N11 Dựa vào kết quả bảng 3.5 và hình 3.3 cho thấy: Tỷ lệ nguyên liệu khô đậu tương/ tinh bột là 50/50 (%) thu được hoạt tính enzyme protease cao nhất 1050 (U/g). Điều đó có thể giải thích vì khô đậu tương chứa các acid amin có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp enzyme protease. Tinh bột cũng chứa rất nhiều dinh dưỡng như chất xơ, khoáng chất và các loại acid amin. Trong quá trình phát triển, nấm sợi sử dụng các chất dinh dưỡng có trong khô đậu tương và tinh bột tạo độ thoáng khí vừa phải, giúp sinh trưởng tốt, sử dụng chất dinh dưỡng được tối đa, kích thích sản sinh nhiều enzyme. Hàm lượng khô đậu tương/ tinh bột ở các tỉ lệ 60/40 cũng cho hoạt tính enzyme cao tương ứng là 856 (U/g), tuy nhiên theo phân tích thống kê cho thấy nó thấp hơn so với tỉ lệ khô đậu tương/ tinh bột 50/50 là 1050 (U/g). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Saurabh S.et.al., (2007) cho rắng nguồn cacrbon tốt nhất là tinh bột và nguồn nitrogen tốt nhất là bột đậu nành với tỷ lệ 50/50. Vì vậy tôi chọn tỉ lệ khô đậu tương/ tinh bột 50/50 là môi trường thích hợp với khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm sợi cho các khảo sát nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.4. Vòng phân giải trên đĩa thạch của các công thưc thí nghiệm tối ưu tỉ lệ nguyên liệu Chú thích: CT1: 90/10, CT2: 80/20, CT3: 70/30, CT4: 60/40, CT5: 50/50 3.3.2. Tối ưu độ ẩm Trong thí nghiệm nhằm mục đích xác định độ ẩm thích hợp nhất cho quá trình lên men, tôi tiến hành khảo sát độ ẩm từ 40-65% với tỷ lệ khô đậu tương/ tinh bột: 50/50 và các điều kiện nuôi cấy như sau: nuôi lắc giống cấp 1 trong thời gian 2 ngày ở 300C±20C, lượng giống cho vào môi trường lên men xốp là 4% cơ chất. Thời gian lên men 3 ngày. Kết quả thu được ở bảng dưới đây Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 Độ ẩm (%) D (mm) D (mm) ∆D (mm) Hoạt tính protease TB (U/g) 40 35 5 30 793±87,82 45 36 5 31 878±66,89 50 39 5 34 1002±93,59 55 37 5 32 961±48,87 60 37 5 32 881±87,28 65 36 5 31 783±71,48 Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm (%) đến hoạt độ protease của chủng nấm sợi N11 Kết quả thí nghiệm cho thấy độ ẩm từ 45% đến 60% đều cho hoạt tính protease cao, nhưng hoạt tính cao nhất là ở độ ẩm 50% là 1002 (U/g), đường kính vòng thủy phân là 34mm. Điều này có thể giải thích khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn, độ ẩm môi trường có vai trò hết sức quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của VSV, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không đủ nước để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, còn khi độ ẩm quá lớn sẽ giảm độ xốp, ảnh hưởng tới quá trình trao đổi vật chất giữa thể rắn và thể khí. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Pushpa S. Murthi và M. Madhava Naidu (2010) độ ẩm thích hợp thu được hoạt tính protease cao của nấm sợi là 50%, và tài liệu của Ngạc Văn Dậu (1983), Lê Ngọc Tú (2002), Nguyễn Đức Lượng (2004) là độ ẩm thích hợp để nấm mốc hình thành enzyme là 50-68%. Vậy nên tôi chọn độ ẩm 50% cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.6. Vòng phân giải trên đĩa thạch của các công thưc thí nghiệm tối ưu độ ẩm nguyên liệu Chú thích: CT1: 40%, CT2: 45%, CT3: 50%, CT4: 55%, CT5: 60%, CT6: 65% 3.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy Để nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy vào đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc, tôi tiến hành cấy nấm sợi N11 này với lượcng giống cấy vào khác nhau lần lượt là 2%, 4%, 6%, 8%, 10% hỗn dịch bào tử/15g cơ chất. Tỷ lệ khô đậu tương/ tinh bột: 50/50 (%), độ ẩm cơ chất sau khi tiếp giống là 50% và các điều kiện nuôi cấy như sau: nuôi lắc giống cấp 1 trong thời gian 2 ngày ở 300C. Thời gian lên men 3 ngày. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 Tỷ lệ giống (%) D (mm) d (mm) ∆D (mm) Hoạt tính protease TB (U/g) 2 33 5 28 780±119,07 4 34 5 29 1037±136,8 6 34 5 29 1072±128,83 8 35 5 30 1167±53,02 10 36 5 31 1199±76,38 Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt tính protease Kết quả cho thấy khả năng sinh enzyme protease cao nhất khi cấy lượng giống là 10% (1.5ml) hỗn dịch bào tử 1199 (U/g) và thấp nhất là khi cấy lượng giống là 2% hỗn dịch bào tử 780 (U/g). Tỉ lệ giống cấy vào tăng thì hoạt tính protease cũng tăng. Điều này có thể được giải thích rằng nếu lượng giống cho vào càng nhiều thì số lượng bào tử sống càng lớn, hệ sợi nấm càng nhiều, lượng enzyme tổng hợp được càng nhiều. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của các tác giả Lê Minh Nguyệt, Phan Thị Phương Thảo (2012) khi nghiên cứu với nấm mốc tỷ lệ giống cấy vào càng nhiều thì hoạt tính protease càng tăng. Vì vậy, tôi chọn tỉ lệ giống cấy vào 10% cho các khảo nghiệm tiếp theo. Hình 3.8. Vòng phân giải trên đĩa thạch của các công thưc thí nghiệm tối ưu tỉ lệ giống Chú thích: CT1:2%; CT2: 4%; CT3:6%; CT4: 8%; CT5:10% 3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Thí nghiệm nhằm mục đích xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng nấm N11. Tôi tiến hành nuôi cấy chủng này ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau tương ứng là 250C, 300C, 350C với các điều kiện nuôi cấy tỷ lệ khô đậu tương/ tinh bột: 50/50, độ ẩm sau khi tiếp giống là 50%, lượng giống cho vào môi trường lên men xốp là 10% cơ chất. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 Công thức thí nghiệm D (mm) d (mm) ∆D (mm) Hoạt tính protese TB (U/g) 250C 34 5 29 1193±91,51 300C 38 5 33 1256±76,38 350C 37 5 32 1107±114,41 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt tính protease của chủng nấm sợi N11 Dựa vào kết quả ở bảng 3.8 và hình 3.9 trên cho thấy: nhiệt độ nuôi cấy thích hợp của chủng nấm N11 là 300C với đường kính vòng thủy phân là 33 mm và hoạt tính protease là 1256 (U/g) cao hơn nhiều so với hai công thức ở 250C là 1193 (U/g) và ở 37 0C là 1107 (U/g).Ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau hoạt tính protease khác nhau rõ rệt, nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Theo Nguyễn Đức Lượng, nhiệt độ môi trường thích hợp trong nuôi cấy nấm sợi thu protease là khoảng từ 290C - 310C [10]. Hình 3.10. Vòng phân giải trên đĩa thạch của các công thức thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lên men 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm mốc N11 tôi tiến hành nuôi cấy chủng này trong những khoảng thời gian khác nhau tương ứng là 36 h, 48 h, 72 h, 96 h. Tỷ lệ khô đậu tương/ tinh bột: 50/50, độ ẩm cơ chất sau khi tiếp giống 50% và các điều kiện nuôi cấy như sau: nuôi lắc giống cấp 1 trong thời gian 2 ngày ở 300C, lượng giống cho vào môi trường lên men xốp là 10% cơ chất. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp protease của chủng nấm sợi N11 Thời gian lên men D (mm) d (mm) D-d (mm) Hoạt tính enzyme TB (U/g) 36 h 33 5 28 1128±95,39 48 h 36 5 31 1405±133,44 72 h 35 5 30 1252±100,03 96 h 34 5 29 1109±104,9 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời nuôi cấy đến hoạt độ protease của chủng nấm sợi N11 Dựa vào kết quả trên ta thấy: Khả năng sinh enzyme cao nhất khi nuôi cấy trong thời gian là 48 h với đường kính vòng thủy phân casein là 31mm và hoạt tính enzyme protease 1405 (U/g). Thời gian nuôi cấy khác nhau thì khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc N11 cũng khác nhau. Khi thời gian nuôi cấy tăng từ 36 h đến 48 h hoạt lực enzyme tăng nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy 72 h, 96 h thì hoạt lực protease lại giảm. Điều này có thể giải thích quá trình phát triển của nấm sợi trong môi trường bán rắn trải qua các giai đoạn, từ 36 h đến 48 h nấm sợi phát triển sinh khối là chủ yếu, sinh bào tử ít, enzyme được tổng hợp mạnh nên hoạt tính enzyme cao, từ 48 h đến 96 h quá trình trao đổi chất yếu dần và sinh nhiều bào tử nên làm giảm hoạt tính enzyme. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo (2012) khả năng sinh enzyme cao nhất của chủng nấm mốc Mucor elegans khi nuôi cấy trong thời gian 48 h [5] và tài liệu của Nguyễn Thị Hiền (2006), Nguyễn Đức Lượng (2004) thời gian sinh enzyme cao nhất của nấ sợi là 30-48 h. Vậy nên tôi chọn thời gian 48 h là thời gian tối ưu sinh enzyme protease. Hình 3.12. Vòng phân giải trên đĩa thạch của các thí nghiệm tối ưu thời gian lên men 3.4. Một số đặc điểm sinh học và khả năng kháng sinh của nấm sợi N11 Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc nấm sợi N11 (A. Mặt trước, B. Mặt sau) Nuôi cấy nấm sợi N11 trên môi trường PDA cho thấy đặc điểm hình thái như sau: Khuẩn lạc màu xanh hơi nâu, bào tử màu xanh hơi vàng, nhung mịn, hệ sợi bông xốp có màu trắng, chiều dài hệ sợi khoảng 6mm, các sợi nấm phân nhánh, các nhánh lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm xù xì như bông, nấm không sinh sắc tố trên bề mặt môi trường. Hình 3.9. Bào tử và hệ sợi nấm quan sát dưới kính hiển vi Quan sát nấm sợi dưới kính vi (x400) cho thấy: Nấm mốc có hình sợi, khuẩn ty có vách ngăn, sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành các tế bào hình chai và các chuỗi đính bào tử. Trên đầu tế bào hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc. Tế bào có hình trứng và hình ovan. Bọng tế bào chủ yếu là hình cầu, hình chùy. . KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đã phân lập được 22 chủng vi sinh vật từ đất DOM (QB) và EM (QO) và tiến hành tuyển chọn được 17 chủng VSV có khả năng sinh protease. Đã chọn được 9 chủng VSV có hoạt tính protease cao từ đó đã chọn ra được chủng nấm sợi N11 có hoạt tính protease cao nhất (1700±89,93 U/ml) . Tối ưu điều kiện lên men xốp cơ chất khô đậu tương chủng nấm sợi N11. Theo kết quả nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu là tỉ lệ khô đậu tương/tinh bột: 50/50( 1050±81 U/g) độ ẩm cơ chất sau khi tiếp giống là 50%( 1002±93,59 U/g) tỉ lệ tiếp giống 10%( 1199±76,38 U/g); thời gian lên men 48 h( 1405±133,44 U/g) sẽ thu được hoạt tính protease cao nhất. Đã nghiên cứu được một số đặc điểm hình thái của chủng nấm sợi N11 khuẩn lạc màu xanh hơi nâu, bào tử màu vàng, nhung mịn, hệ sợi phân nhánh, bống xốp. 4.2. Kiến nghị Định danh chủng nấm sợi N11 bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen. Tiếp tục khảo sát các điều kiện lên men xốp nấm sợi như pH, độ dày môi trường, các chất khoáng để thu được hoạt tính protease cao. Tiếp tục nghiên cứu thêm khả năng sinh/ sản xuất các enzyme ngoại bào khác từ chủng nấm sợi N11 như cellulase, amylase.. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đỗ, Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học. 2. Đỗ, Thị Bích Thủy (2012), "Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1", Tạp chí Khoa học Đại học Huế. 71(2). 3. Đỗ, Trần Ngoan Nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng phương pháp lên men bởi tế bào vi khuẩn Bac .subtilis cố định, Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh. 4. Đồng, Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 5. Lê, Minh Nguyệt and Phan, Thị Phương Thảo (2012), "Xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động cho sản xuất chao từ nấm mốc Mucor elegans ", Tạp chí Khoa học và Phát triển. 10(5), pp. 771- 778. 6. Lê, Thị Bích Phượng, et al. (2012), "Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase", Tạp chí Sinh học. 34(3SE), pp. 99-104. 7. Lê, Thị Bích Phượng, et al. (2012), "Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase", TẠP CHÍ SINH HỌC, pp. 99-104. 8. Lương, Đức Phẩm (2010), Giáo trình công nghệ lên men, NXB Giáo dục Việt Nam 9. Ngô, Tự Thành, et al. (2009), "Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 25, pp. 101-106. 10. Nguyễn, Đức Lượng, et al. (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn, Đức Lượng and Nguyễn, Thị Thùy Dương (2003), Công nghệ sinh học tập 1 - Công nghệ sinh học xử lý nước thải, NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 12. Nguyễn, Lân Dũng (2005), Giáo trình vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội. 13. Nguyễn, Thị Hiếu (2013), Tổng quan về đậu nành, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. 14. Nguyễn, Văn Thành and Trần, Thị Yến Minh (2013), "Ứng dụng vi sinh vật và enzyme protease để cải tiến chất lượng nước tương lên men truyền thống", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 26, pp. 205-212. 15. Trần, Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành sinh hóa vi sinh vật, NXB Giáo dục, 45–56, 97–102. 16. Trần, Thanh Trúc and Nguyễn, Văn Mươi (2015), "Tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger sinh tổng hợp protease hoạt tính cao", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 41, pp. 12-20. 17. Võ, Thị Bích Vân (2010), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủng nấm sợi phân lập tại rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 18. Vũ, Thị Thanh Tâm and Võ, Hoài Bắc (2013), "Nghiên cứu ứng dụng protease ngoại bào của Bacillus subtilis B-26 cho quá trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nấm (Carcharhinus sorah)", Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản. 1(2013). 19. Akcan, Nurullah and Uyar, Fikret (2011), "Production of extracellular alkaline protease from Bacillus subtilis RSKK96 with solid state fermentation", Eurasia J Biosci. 5, pp. 64-72. 20. Chutmanop, Jarun, et al. (2008), "Protease production by Aspergillus oryzae in solid‐state fermentation using agroindustrial substrates", Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83(7), pp. 1012-1018. 21. Han, Bei-Zhong, Rombouts, Frans M, and Nout, MJ Robert (2001), "A Chinese fermented soybean food", International journal of food microbiology. 65(1), pp. 1-10. 22. Hong, K. J., Lee, C. H., & Kim, S. W, (2004), "Aspergillus oryzae GB-107 Fermentation Improves Nutritional Quality of Food Soybeans and Feed Soybean Meals", Journal of Medical Food. , pp. 430-435. 23. Hong, Kee-Jong, Lee, Chan-Ho, and Kim, Sung Woo (2004), "Aspergillus oryzae GB-107 fermentation improves nutritional quality of food soybeans and feed soybean meals", Journal of medicinal food. 7(4), pp. 430-435. 24. Illanes, Andrés (2008), "Enzyme production", Enzyme Biocatalysis, Springer, pp. 57-106. 25. Negi, S and Benerjee, R (2006), "Optimization of amylase and protease production from Aspergillus awamori in single bioreactor through EVOP factorial design technique", Food Technology and Biotechnology. 44(2), pp. 257-261. 26. Nehra, KS, et al. (2002), "Production of alkaline protease by Aspergillus sp. under submerged and solid substrate fermentation", Indian journal of microbiology. 42(1), pp. 43-47. 27. Ogawa, A, et al. (1995), "Production of neutral protease by membrane-surface liquid culture of Aspergillus oryzae IAM 2704", J Ferment Bioeng. 80(1), pp. 35-40. 28. Peter Golbitz (2009), ""Tradition Soyfoods: Processing and Products"", Soyatech, Inc., Bar Harbor, ME 04609. 29. Rao, Mala B, et al. (1998), "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases", Microbiology and molecular biology reviews. 62(3), pp. 597-635. 30. Shivakumar, Srividya (2012), "Production and characterization of an acid protease from a local Aspergillus sp. by solid substrate fermentation", Arch. Appl. Sci. Res. 4(1), pp. 188-199. 31. SUN, Chang-yan, et al. (2007), "The proteases formation and proteolysis during the incubation of naturally fermented soybean Koji [J]", Food Science and Technology. 8, p. 059. 32. Wang, Jiunn-Min, et al. (2012), "Nattokinase Reduces Brain Infarction, Fibrinogen and Activated Partial Thromboplastin Time against Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury", Journal of Food & Drug Analysis. 20(3). 33. Ying, GUO Ji-Ping MA (2007), "Breeding Aspergillus oryzae Strain with High Protease Activity by Ultraviolet Induced Mutation [J]", Microbiology. 2, p. 011. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn tyrosine Ống nghiệm Blank 1 2 3 4 5 Nồng độ Tyrosin (µM) 0 55,2 110,4 165,6 220,8 276 OD 660nm 0,052 0,089 0,107 0,143 0,168 0,204 Dựa vào kết quả ở bảng xây dựng được đồ thị tương quan giữa nồng độ tyrosine chuẩn và giá trị OD660nm như sau: Đường chuẩn tyrosine Phụ lục 2: Hình ảnh các công thức tối ưu điều kiện lên men Chú thích: CT1: 90/10, CT2: 80/20, CT3: 70/30, CT4: 60/40, CT5: 50/50 Công thức thí nghiệm lên men tối ưu tỉ lệ nguyên liệu Công thức thí nghiệm lên men tối ưu độ ẩm Chú thích: CT1: 40%, CT2: 45%, CT3: 50%, CT4: 55%, CT5: 60%, CT6: 65% Chú thích: CT1: 2%, CT2: 4%, CT3: 6%, CT4: 8%, CT5: 10% Công thức lên men tối ưu tỷ lệ giống Chú thích: CT1: 250C, CT2: 300C, CT3: 350C Công thức lên men tối ưu nhiệt độ lên men Chú thích: CT1: 36h, CT2: 48h, CT3: 72h, CT4: 96h Công thức lên men tối ưu thời gian lên men Phụ lục 3: Hoạt tính 9 chủng VSV được tuyển chọn Chủng VSV ∆OD Hoạt tính protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Độ lệch chuẩn N6 0,117 0,121 0,098 1100 1139 920 1053,33 117,03 N10 0,197 0,156 0,187 1862 1472 1767 1700,95 203,59 N11 0,164 0,152 0,143 1548 1434 1348 1443,81 100,33 D2 0,144 0,121 0,15 1358 1139 1415 1304,12 145,79 D3 0,13 0,156 0,1 1224 1472 939 1212,06 266,89 D6 0,151 0,142 0,135 1424 1339 1272 1345,39 76,38 D8 0,137 0,117 0,12 1291 1100 1129 1173,96 102,72 D10 0,105 0,123 0,114 986 1158 1072 1072,38 85,71 D11 0,127 0,134 0,118 1196 1262 1110 1189,84 76,38 Phụ lục 4: Thí nghiệm tối ưu tỉ lệ nguyên liệu Ảnh hưởng của tỉ lệ KĐT/TB đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Tỷ lệ nguyên liệu (%) ∆OD Hoạt tính protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Độ lệch chuẩn 90/10 0,063 0,048 0,052 586 443 481 504 73,97 80/20 0,074 0,063 0,050 691 586 481 586 104,76 70/30 0,083 0,075 0,06 777 700 558 678 111,20 60/40 0,091 0,083 0,1 853 777 939 856 80,99 50/50 0,12 0,103 0,112 1129 967 1053 1050 80,99 Phân tích ANOVA SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 90/10 3 1512.381 504.127 5472.411 80/20 3 1760 586.6667 10975.06 70/30 3 2036.19 678.7302 12365.84 60/40 3 2598.095 866.0317 9191.232 50/50 3 3121.905 1040.635 9191.232 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 567159.5 4 141789.9 15.02146 0.000313 3.47805 Within Groups 94391.53 10 9439.153 Total 661551 14 Phụ lục 5: Thí nghiệm tối ưu độ ẩm Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Độ ẩm (%) ∆OD Hoạt tính protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB (U/g) Độ lệch chuẩn 40 0,087 0,072 0,095 815 672 891 793 111,20 45 0,085 0,093 0,101 815 872 948 878 66,89 50 0,1 0,102 0,118 939 958 1110 1002 93,95 55 0,101 0,098 0,108 948 920 1015 961 48,87 60 0,086 0,092 0,104 805 862 977 881 87,28 65 0,076 0,084 0,091 710 786 853 783 71,48 Phân tích anova SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 40 3 2379.048 793.0159 12365.84 45 3 2636.19 878.7302 4474.679 50 3 3007.619 1002.54 8828.42 55 3 2883.81 961.2698 2388.511 60 3 2645.714 881.9048 7619.048 65 3 2350.476 783.4921 5109.599 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 115298.6 5 23059.71 3.392291 0.038511 3.105875 Within Groups 81572.18 12 6797.682 Total 196870.7 17 Phụ lục 6: Thí nghiệm tối ưu tỉ lệ giống Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Tỷ lệ giống (%) ∆OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Độ lệch chuẩn 2 0,096 0,083 0,071 900 777 662 780 119,07 4 0,094 0,116 0,121 881 1091 1139 1037 136,80 6 0,115 0,1 0,127 1081 939 1196 1072 128,83 8 0,123 0,119 0,13 1158 1120 1224 1167 53,02 10 0,128 0,119 0,135 1205 1120 1272 1199 76,38 Phân tích ANOVA SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 0.02 3 2340.952 780.3175 14179.89 0.04 3 3112.381 1037.46 18715.04 0.06 3 3217.143 1072.381 16598.64 0.08 3 3502.857 1167.619 2811.791 0.1 3 3598.095 1199.365 5835.223 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 328562.4 4 82140.59 7.063963 0.005727 3.47805 Within Groups 116281.2 10 11628.12 Total 444843.5 14 Phụ lục 7: Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Nhiệt độ lên men (0C) ∆OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 TB(U/g Độ lệch chuẩn 25 0,118 0,125 0,137 1110 1177 1291 1193 91,51 30 0,141 0,134 0,125 1329 1262 1177 1256 76,38 35 0,106 0,117 0,13 996 1100 1224 1107 114,4 Phân tích ANOVA SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 25 3 3579.048 1193.016 8374.906 30 3 3769.524 1256.508 5835.223 35 3 3321.905 1107.302 13091.46 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 33640.72 2 16820.36 1.848283 0.236919 5.143253 Within Groups 54603.17 6 9100.529 Total 88243.89 8 Phụ lục 8: Thí nghiệm tối ưu thời gian lên men Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng tổng hợp protease của chủng N11 Thời gian lên men ∆OD Hoạt độ protease (U/g) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Độ lệch chuẩn 36 h 0,119 0,108 0,128 1135 1030 1220 1128 95,39 48 h 0,136 0,143 0,163 1297 1363 1554 1405 133,46 72 h 0,131 0,121 0,142 1249 1154 1354 1252 100,03 96 h 0,127 0,105 0,117 1211 1001 1116 1109 104,90 Phân tích ANOVA SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 36h 3 3386.667 1128.889 9100.529 48h 3 4215.238 1405.079 17808.01 72h 3 3758.095 1252.698 10007.56 96h 3 3329.524 1109.841 11005.29 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 167074.8 3 55691.61 4.64858 0.036544 4.066181 Within Groups 95842.78 8 11980.35 Total 262917.6 11