Khảo sát sự tăng trưởng của huyền phù tế bào dâu tây(Fragaria Ananassa L.) có khả năng sinh tổng hợp anthocyanin

TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 69 KHO SÁT S" TĂNG TRƯ NG CA HUY#N PHÙ T BÀO DÂU TÂY (FRAGARIA ANANASSA L.) CÓ KH NĂNG SINH T%NG HFP ANTHOCYANIN Phm Th3 M* Trâm (1), Lê Th3 Thu2 Tiên(2) (1) Trưng Đi hc Th D$u Mt, Bình Dương (2) Trưng Đi hc Bách Khoa, ĐHQG - HCM (Bài nh
n ngày 06 tháng 02 năm 2012, hoàn chnh sa cha ngày 27 tháng 03 năm 2012) TÓM T
T: Huyn phù t bào hình thành t# mô s&o có ngu$n g c t# lá dâu tây (Fragaria ananassa L.) in vitro, trên môi trư ng MS b sung ñư ng 30 g/l, 2,4-D 1,0 mg/l và kinetin 0,3 mg/l. Qua nhiu thí nghim kho sát các yu t nh hư*ng ñn s tăng trư*ng ca huyn phù t bào, chúng tôi ghi nh
n ñưc các yu t thích hp cho s tăng trư*ng ca huyn phù t bào như m
t ñ t bào kh*i ñu là 1 g t bào trong 20 ml môi trư ng l)ng, ñư ng 30 g/l * t c ñ l,c 100 vòng/phút. S hin din ca anthocyanin trong t bào huyn phù ñưc xác ñnh b ng phương pháp pH vi sai. T khoá: anthocyanin, dâu tây, Fragaria ananassa L., huyn phù t bào, mô s&o M Đ(U Dâu tây (Fragaria ananassa) ñưc gi là cây thuc t' th k2 13. Nó ñưc s dng rng rãi b"i các quc gia khác nhau trên th gii. Theo dân gian M, thuc dâu tây ñưc s dng ñ to s thèm ăn và &n ñnh tiêu hóa. 7 Đc, lá ñưc s dng ñ chng s*i mt, cha b nh v th$n kinh, hen ph qun, mt ng... Qu dâu tây giàu các hp cht chng oxy hoá quan trng và cũng là ngu%n cung cp chính ca acid ellagic và các flavonoid mà ñ c bi t là hai anthocyanin, peonidin – 3 – glucoside và cyanidin – 3 – glucoside có tác dng gim nguy cơ ung thư và tim mch [7]. Theo nghiên cu ca Kandil và ñ%ng tác gi (2000), hàm lưng ca flavonoid ca mt trái cây có th ch chim khong 1% t&ng hàm lưng các cht có trong qu ñó, trong khi vi c nuôi cy t bào có th gia tăng hàm lưng các cht flavonoid ti 20 – 30% t&ng th tích. Vì vy, vi c nghiên cu và tìm ra phương pháp thích hp ñ gia tăng hp cht th cp luôn ñưc các nhà khoa hc quan tâm [8]. Phương pháp nuôi cy huyn phù t bào thc vt là mt trong nhng phương pháp hi u qu ñ tăng kh năng thu nhn các hp cht th cp vi sn lưng cao mà không th ñưc sn xut b"i vi khu!n ho c t&ng hp bng con ñưng hóa hc [9]. Nhiu nghiên cu ñã thc hi n nhm thu nhn anthocyanin t' huyn phù t bào ca nhiu loài thc vt như Catharanthus roseus [2], Vitis sp [3], Fragaria [5] ... Nghiên cu này ñưc thc hi n nhm kho sát nh hư"ng ca mt s yu t lên s tăng trư"ng ca huyn phù t bào dâu tây Đà Lt Fragaria ananassa L. như mt ñ t bào, n%ng ñ ñưng, cht ñiu hoà sinh trư"ng thc vt, tc ñ lc và s sinh t&ng hp anthocyanin Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 70 nhm thu ñưc lưng ln sinh khi t bào có kh năng sinh t&ng hp anthocyanin. V!T LI
U VÀ PHƯƠNG PHÁP V9t liu Cây dâu tây Fragaria ananassa L. in vitro (cung cp b"i Trung tâm Nghiên cu Rau, Hoa và Khoai tây Đà Lt) ñưc vi nhân ging trên môi trưng MS b& sung BA 0,7 mg/l. Phương pháp S to so dâu tây Vt li u dùng ñ to mô so là các mnh lá non (5 x 5 mm) ca cây dâu tây Fragaria ananassa L. in vitro 6 tu$n tu&i. Môi trưng to so là môi trưng MS (Murashige và Skoog, 1962) [10] b& sung inositol 100 mg/l, ñưng (saccharose) 30 g/l, agar 7,5 g/l, 2,4-D 1,0 mg/l và kinetin (KIN) 0,3 mg/l. Quá trình to so ñưc tin hành trong ti " nhi t ñ 25 + 20C, ñ !m 70 + 2%. Sau 4 tu$n nuôi cy, mô so s+ ñưc cy chuyn sang môi trưng mi. Sau ñó, mô so ñưc cy chuyn sau m8i 2 tu$n. S to huyn phù t bào dâu tây 2 g mô so dâu tây qua 2 l$n cy chuyn (8 tu$n tu&i) ñưc cy vào 20 ml môi trưng MS l*ng có thành ph$n tương t như thành ph$n trong môi trưng to so. H thng t bào ñưc nuôi trên máy lc vòng vi tc ñ 100 vòng/phút trong ñiu ki n ti vi nhi t ñ 25 + 20C, ñ !m 70 + 2%. Huyn phù t bào ñưc nuôi trong 4 tu$n sau ñó s+ chuy n sang môi trưng mi. Huyn phù t bào ñưc cy chuyn sau m8i 2 tu$n. Hình thái t bào dâu tây ñưc quan sát dưi kính hi n vi quang hc. Kh o sát nh hưng c a mt ñ t bào lên s tăng trưng c a huyn phù t bào dâu tây 1 g t bào huyn phù dâu tây ñưc cy chuyn vào môi trưng MS l*ng vi th tích l$n lưt là 10, 20, 30, 40 và 50 ml. S tăng trư"ng ca huyn phù t bào ñưc ñánh giá qua s thay ñ&i th tích t bào lng (SCV) ca huyn phù t bào sau m8i 7 ngày. Kh o sát nh hưng c a ñiu kin chiu sáng lên s tăng trưng c a huyn phù t bào dâu tây Huyn phù t bào dâu tây cy chuyn vào môi trưng MS l*ng vi mt ñ t bào 1 : 20 (g/ml môi trưng l*ng) ñưc ñ t " ngoài sáng vi cưng ñ chiu sáng 2800 + 200 lux, thi gian chiu sáng 16 gi/ngày và " trong ti. S thay ñ&i SCV ca huyn phù t bào ñưc xác ñnh sau 3 tu$n nuôi cy. Kh o sát nh hưng c a nng ñ ñưng lên s tăng trưng c a huyn phù t bào dâu tây Huyn phù t bào vi mt ñ t bào 1 : 20 (g/ml môi trưng l*ng) ñưc nuôi trong môi trưng MS l*ng b& sung ñưng có n%ng ñ l$n lưt là 20, 30, 40 và 50 g/l. S thay ñ&i SCV ca huyn phù t bào ñưc xác ñnh sau 3 tu$n. Kh o sát nh hưng c a tc ñ lc lên s tăng trưng c a huyn phù t bào dâu tây Huyn phù t bào vi mt ñ 1 : 20 (g/ml môi trưng l*ng) ñưc nuôi trong môi trưng MS l*ng b& sung ñưng 30 g/l vi 3 ch ñ lc 100, 120 và 150 vòng/phút. S thay ñ&i SCV ca huyn phù t bào ñưc xác ñnh sau 3 tu$n. Kh o sát s sinh tng hp anthocyanin c a huyn phù t bào dâu tây TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 71 Huyn phù t bào có mt ñ 1 : 20 (g/ml) trong môi trưng MS l*ng b& sung ñưng 30 g/l vi tc ñ lc 100 vòng/phút và ñ t " ñiu ki n sáng vi cưng ñ ánh sáng 2800 lux. Sau m8i tu$n, t bào huyn phù ñưc ñem trích ly ñ xác ñnh hàm lưng anthocyanin thô bng phương pháp pH vi sai [13]. Phương pháp xác ñnh th tích t bào lng (SCV) c a huyn phù t bào Huyn phù t bào trong các bình tam giác ca các nghi m thc ñưc chuy n vào bình c$u có chia vch. Sau ñó, bình c$u ñưc ñy np kín, ñ t ngưc lên giá ñ4, ñ lng trong khong thi gian c ñnh (20 phút) và ghi nhn th tích ca t bào lng (Hình 1). Qua các tu$n ño, chúng tôi s+ ghi nhn ñưc s thay ñ&i th tích t bào lng trong dch huyn phù. Hình 1. Bình c$u ño th tích t bào lng Phương pháp x lí s liu Thí nghi m ñưc l p li 3 l$n, s li u ñưc x lí bng ph$n mm Microsoft Excel. KT QU VÀ THO LU!N SC to sGo dâu tây Mô so bt ñ$u hình thành " các v trí vt thương ca m0u lá sau ngày th 10 nuôi cy trong ñiu ki n ti (Hình 2A). Sau 4 tu$n, mô so phát tri n h$u ht b m t m0u lá và có dng b" (Hình 2B). Sau 2 l$n cy chuyn, mô so có màu vàng cánh gián, tách ri nhau, xp và rt thích hp cho vi c to huyn phù t bào (Hình 2C). Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 72 1 cm 1cm 1 cm Hình 2. Mô so t' lá dâu tây ñ t trong ñiu ki n ti; A. Mô so 2 tu$n tu&i; B. Mô so 4 tu$n tu&i; C. Mô so 8 tu$n tu&i SC to huy+n phù t bào dâu tây Mô so ñưc ñ t vào môi trưng l*ng trên máy lc vòng. Sau 14 ngày nuôi cy, huyn phù t bào hình thành bao g%m các t bào ñơn, cm t bào nh*, màu vàng ñm ñn nâu nht (Hình 3). 50µm 1cm Hình 3. T bào huyn phù dâu tây Fragaria ananassa L. sau 14 ngày A. Huyn phù t bào (quan sát bng mt thưng) B. Huyn phù t bào dưi kính hi n vi quang hc " vt kính 40 nh hư;ng ca m9t ñ t bào lên sC tăng trư;ng ca huy+n phù t bào dâu tây Vi nhng kt qu ñưc trình bày trong hình 4, tr' nghi m thc có mt ñ t bào 1 : 10 (g/ml môi trưng l*ng), các nghi m thc khác ñu có s gia tăng sinh khi ti ña " tu$n th 3. Trong ñó, s tăng trư"ng ca huyn phù t bào có mt ñ 1 : 20 (g/ml môi trưng l*ng) tt nht vi s gia tăng SCV là 0,38 ml. B A C A B TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 73 0.17 0.38 0.28 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 1 2 3 4 5 V10 V20 V30 V40 V50 Hình 4. 5nh hư"ng ca mt ñ t bào lên s tăng trư"ng ca huyn phù t bào dâu tây. V10, V20, V30, V40, V50 là s gia tăng SCV ca huyn phù t bào có mt ñ 1 : 10; 1 : 20; 1 : 30; 1 : 40; 1 : 50 (g/ml môi trưng l*ng). Mt ñ t bào ban ñ$u thích hp có vai trò như mt “lp nuôi” kích thích s tăng trư"ng ca huyn phù [9]. Các nghi m thc có mt ñ t bào 1 : 30, 1 : 40 và 1 : 50 (g/ml môi trưng l*ng) có s gia tăng SCV không cao, có l+ do mt ñ t bào thp, thiu s tác ñng tương h8 gia các t bào làm hn ch s phân chia t bào. Tuy nhiên, mt ñ kh"i ñ$u cao (1 : 10) li làm gim mc ñ sinh trư"ng ca huyn phù do s cnh tranh v cht dinh dư4ng cũng như hàm lưng oxy trong môi trưng. 7 mt ñ t bào 1 : 20 (g/ml môi trưng l*ng), huyn phù t bào tăng sinh tt nht. Kt qu ca chúng tôi phù hp vi nghiên cu ca Aly và cng s (2010) khi kho sát mt ñ t bào ca huyn phù t bào Hyoscyamus muticus. Các tác gi cho rng vi mt ñ 50 g mô so trong 1 lít môi trưng (tương ng mt ñ 1 : 20) giúp huyn phù t bào tăng sinh tt nht. Khi ñưc duy trì " mt ñ t bào cao, huyn phù t bào s+ sm chuy n sang pha &n ñnh và gim sinh khi, có l+ do s cn ki t ngu%n dinh dư4ng và oxy [1]. nh hư;ng ca ñi+u kin chiu sáng lên sC tăng trư;ng ca huy+n phù t bào dâu tây Kt qu kho sát s tăng trư"ng ca huyn phù t bào trong hai ñiu ki n sáng và ti ñưc trình bày trong Bng 1. Bng 1. S gia tăng SCV ca huyn phù t bào " ngoài sáng và trong ti Điu ki n chiu sáng S gia tăng SCV (ml) Ngoài sáng 0,18 ± 0,03 Trong ti 0,33 ± 0,03 Huyn phù t bào tăng sinh " trong ti mnh hơn ngoài sáng. Huyn phù t bào trong ñiu ki n ti phóng thích nhiu t bào nh*, môi trưng nuôi cy có màu vàng. Trong khi ñó, huyn phù t bào " ñiu ki n chiu sáng ít có s phóng thích t bào. S gia tăng SCV ca huyn phù trong ti " tu$n th 3 ñt 0,33 ml trong khi " ngoài sáng ch ñt 0,18 ml (Bng 1). Đi vi nhiu loài thc vt, ngoài tác ñng lên s hình thành và tăng sinh ca mô so trong quá trình nuôi cy, ánh sáng còn nh hư"ng S gi a tă n g SC V (m l) Tu$n Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 74 ñn s sinh t&ng hp các hp cht th cp trong t bào do liên quan ñn s hot ñng ca mt s enzyme ni bào [6]. Theo nghiên cu ca Lê Th Thy Tiên và cng s (2010), s tăng trư"ng ca mô so và huyn phù t bào t' thân non cây thông ñ* Lâm Đ%ng b cn mnh khi ñ t " ngoài sáng nhưng hot tính ca taxol li cao hơn so vi trong ti [11]. nh hư;ng ca n?ng ñ ñư0ng lên sC tăng trư;ng ca huy+n phù t bào dâu tây Huyn phù t bào ñưc nuôi trong môi trưng MS l*ng b& sung ñưng " các n%ng ñ khác nhau, ñ t trong ñiu ki n ti hoàn toàn ñ kho sát s tăng trư"ng. S gia tăng SCV ca huyn phù t bào " các nghi m thc kho sát ñưc trình bày trong Bng 2. Bng 2. S gia tăng SCV ca huyn phù t bào " các n%ng ñ ñưng khác nhau Mt ñ t bào (g/ml) N%ng ñ ñưng (g/l) S gia tăng SCV (ml) 1 : 20 20 0,18 + 0,08 30 0,38 + 0,03 40 0,22 + 0,08 50 0,2 + 0,05 Theo các s li u t' Bng 2, th tích t bào lng ca huyn phù t bào tăng khi hàm lưng ñưng tăng t' 20 g/l lên 30 g/l và gim xung khi tip tc tăng hàm lưng ñưng lên 40 và 50 g/l. 7 môi trưng có n%ng ñ ñưng 30 g/l, huyn phù t bào tăng trư"ng mnh nht vi s gia tăng SCV là 0,38 ml và tăng ít nht khi môi trưng có b& sung ñưng " n%ng ñ 20 g/l vi s gia tăng SCV là 0,18 ml. Đưng cung cp ngu%n carbon c$n thit cho các hot ñng trao ñ&i cht ca t bào, to nguyên li u cho quá trình phân chia t bào giúp huyn phù t bào tăng trư"ng. N%ng ñ ñưng 30 g/l có l+ là n%ng ñ thích hp nht cho s tăng trư"ng ca huyn phù t bào dâu tây. 7 n%ng ñ ñưng thp hơn (20 g/l), huyn phù t bào phát tri n chm, có th do s thiu ht ngu%n năng lưng và sưn carbon c$n thit cho các hot ñng bin dư4ng trong t bào. 7 các n%ng ñ ñưng cao hơn (40 và 50 g/l), sinh khi huyn phù tăng chm. Nguyên nhân có th do n%ng ñ ñưng cao làm gia tăng áp sut th!m thu nh hư"ng ñn hot ñng trao ñ&i cht ca t bào [4]. Vì vy, chúng tôi chn ñưng có n%ng ñ 30 g/l ñ b& sung vào môi trưng tăng sinh huyn phù t bào dâu tây. nh hư;ng ca tc ñ lDc lên sC tăng trư;ng ca huy+n phù t bào dâu tây Qua quá trình theo dõi, chúng tôi nhn thy vi các tc ñ lc khác nhau, s tăng trư"ng ca huyn phù t bào cũng khác nhau. Bng 3. S gia tăng SCV ca huyn phù t bào " các tc ñ lc khác nhau Tc ñ lc (vòng/phút) S gia tăng SCV (ml) 100 0,35 + 0,10 120 0,2 + 0,09 150 0,18 + 0,03 Trong ñó, huyn phù t bào " ch ñ lc 100 vòng/phút tăng trư"ng tt nht vi s gia tăng SCV là 0,35 ml. T bào và các cm t bào có màu vàng, kích thưc tương ñi ñu nhau. Khi tăng tc ñ lc lên 120, 150 vòng/phút thì s TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 75 gia tăng SCV ca huyn phù t bào thp, tương ng là 0,2 và 0,18 ml). T bào huyn phù " các ch ñ lc 120 và 150 vòng/phút bám dính nhiu trên thành bình, do ñó kh năng tip xúc ca chúng vi môi trưng dinh dư4ng b hn ch, d0n ñn s tăng trư"ng ca huyn phù t bào chm (Bng 3). Khi ñưc nuôi cy trong môi trưng l*ng, các t bào luôn ñưc tip xúc vi môi trưng dinh dư4ng. Quá trình thông khí và ngăn cn s kt dính ca các t bào li vi nhau ñưc thc hi n nh mt máy lc vòng. Vì vy tc ñ lc phù hp cũng là mt yu t rt quan trng trong nuôi cy huyn phù t bào thc vt [12]. T' kt qu thc nghi m, chúng tôi chn tc ñ lc 100 vòng/phút ñ tăng sinh huyn phù t bào. SC sinh t,ng hp anthocyanin ca huy+n phù t bào dâu tây Hàm lưng anthocyanin trong t bào huyn phù tăng t' tu$n 1 ñn tu$n 3 và ñt giá tr cao nht " tu$n th 3 (6,01.10-3% FW) và gim " tu$n th 4 (Hình 5). Như vy, s sinh t&ng hp anthocyanin ca t bào dâu tây di#n ra ñ%ng thi vi s tăng trư"ng ca huyn phù t bào. Hàm lưng anthocyanin thu ñưc cao nht khi s tăng trư"ng ca huyn phù t bào ñt mc cao nht " tu$n th 3 ca quá trình nuôi cy. Hình 5. S bin thiên hàm lưng anthocyanin theo thi gian KT LU!N Trong nghiên cu này, chúng tôi ñã xác ñnh ñưc mt s yu t thích hp cho s tăng sinh huyn phù t bào dâu tây Đà Lt (Fragaria ananassa L.). Điu ki n thích hp nht cho s tăng trư"ng ca huyn phù t bào là môi trưng MS l*ng có b& sung ñưng 30 g/l " mt ñ t bào 1 g t bào tươi trong 20 ml môi trưng l*ng vi tc ñ lc 100 vòng/phút. Điu ki n ti thích hp cho s tăng sinh ca huyn phù t bào. Hàm lưng anthocyanin ñt giá tr ti ña (6,01.10-3% FW) là sau 3 tu$n nuôi cy huyn phù t bào. 0.55 1.91 3.55 6.01 3.01 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5H àm lư n ga nt ho cy ain (% FW x 10 - 3 ) Th0i gian (tu.n) Science & Technology Development, Vol 15, No.T1 2012 Trang 76 STUDYING ON GROWTH OF STRAWBERRY (FRAGARIA ANANASSA L.) CELL SUSPENSION CULTURES FOR ANTHOCYANIN PRODUCTION Pham Thi My Tram (1), Le Thi Thuy Tien (2) (1)University of Thu Dau Mot, Binh Duong (2) University of Technology, VNU-HCM ABSTRACT: Cell suspension cultures were initated from calli derived from in vitro strawberry leaves on MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 30 g/l sucrose, 1.0 mg/l 2,4-D and 0.3 mg/l kinetin. There were many factors affected on cell suspension cultures growth (it was found that ). Cell suspension cultures grew better on MS medium with 30 g/l sucrose. 1 g (fresh weight) of cells in 20 ml of medium was the best initial inoculum cell density for cell suspension cultures to grow. A shaking speed of 100 rpm on rotary shaker was suitable for the cells. The growth of cell suspension in dark was better than that under light condition. Anthocyanin in the cells was determined by pH differential method. Key words: anthocyanin, callus, cell suspension, Fragaria ananassa L., strawberry. TÀI LI
U THAM KHO [1]. U. I. Aly, H. M. E. Shabrawi, M. Hanafy, Impact of culture conditions on alkaloid production from undifferentiated cell suspension cultures of Egyptian Henbane, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 4, 4717- 4725 (2010). [2]. D. P. Carew, R. J. Krueger, Anthocyanidins of Catharanthus roseus callus cultures, Phytochemistry, 15, 442 (1976). [3]. C. B. Do, F. Cormier, Accumulation of anthocyanins enhanced by a high osmotic potential in grape (Vitis vinifera L.) cell suspensions, Plant Cell Rep, 9, 143-146 (1990). [4]. T. T. M. Dung, T. T. T Trà và L. T. T. Tiên, Kho sát kh năng thu nhn anthocyanin bng phương pháp nuôi cy t bào bp ci tím Brassica oleracea L. Hi ngh Khoa h c và Công ngh ln th 10, phân ban Công ngh Thc ph(m – Sinh h c, Đi h c Bách Khoa ĐHQG- HCM (2009). [5]. . Ei-Sawyand, H. S. Taha, Stimulation of anthocyanin production in strawberry callus cultrures, J. Agric. Sci. Mansoura Uni 25, 2247-2256(2000). [6]. A. G. Fett-Neto, J. J. Pennington, F. DiCosmo, Effect of white light on taxol and baccatin III accumulation in cell cultures of Taxus cuspidata Sieb and TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 15, SOÁ T1 2012 Trang 77 Zucc, J. Plant Physiol 146, 584-590 (1995). [7]. S. M. Hannum, Potential impact of strawberries on human health: a review of the science, Crit Rev Food Sci Nutr, 44, 1-17 (2004). [8]. F. Kandil, L. Song, J. Pezzuto, D. Seigler, M. A. Smith, Isolation of oligomeric proanthocyanidins from flavonoid - producing cell cultures. In Vitro Cell Dev Biol Plant Biol Plant 36, 492 - 500 (2000). [9]. N. Đ. Lưng, L. T. T. Tiên, Công ngh t bào, NXB Đi hc Quc gia Tp.HCM. (2006). [10]. T. Murashige, F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiologia. Plantarum, 15, 473- 497 (1962). [11]. L T. T. Tiên, B. T. Vi t, N. Đ. Lưng, Kho sát vài yu t nh hư"ng ñn s sinh t&ng hp taxol ca các h thng t bào Taxus wallichiana Zucc. In vitro, Tp chí Phát trin Khoa h c và Công ngh, T3, 67-77 (2010). [12]. V. V. V, N. M. Hùng, L. H. Đi p, Công ngh sinh h c, t
p 2 (Công ngh sinh h c t bào), NXB Giáo dc (2005). [13]. R. E. Wrolstad, Current Protocols in Food Analytical Chemistry (Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy), John Wiler & Sons Inc (2001).