Khảo sát sự biểu hiện của gen mã hóa GmHK07 trong đáp ứng hormone ABA và stress hạn ở hai giống đậu tương chịu hạn khác biệt-DT51 và MTD720 - Nguyễn Bình Anh Thư

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 123-128 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA GmHK07 TRONG ĐÁP ỨNG HORMONE ABA VÀ STRESS HẠN Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN KHÁC BIỆT-DT51 VÀ MTD720 Nguyễn Bình Anh Thư, Đoàn Ngọc Hiếu, Nguyễn Phương Thảo* Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG HCM, *npthao@hcmiu.edu.vn TÓM TẮT: Abscisic acid (ABA) là một phytohormone quan trọng tham gia đáp ứng chống chịu stress phi sinh học ở thực vật. Nghiên cứu sự biểu hiện đáp ứng gen với ABA có thể giúp xác định các gen tiềm năng có ứng dụng quan trọng trong công nghệ gen nhằm cải tạo tính chống chịu với stress phi sinh học ở cây trồng. Trong nghiên cứu này, sự điều hòa biểu hiện của gen GmHK07 được xem xét ở hai giống đậu tương chịu hạn tốt DT51 và giống chịu hạn kém MTD720 dưới điều kiện xử lý ABA và điều kiện hạn. Kết quả qRT-PCR của các mẫu thu từ cây đậu tương 12 ngày tuổi được xử lý trong dung dịch ABA nồng độ 100 µM cho thấy GmHK07 có sự giảm biểu hiện đáng kể cả ở mô chồi và rễ của giống MTD720 được xử lý ABA. Hơn nữa, GmHK07 còn có sự tích lũy cao đáng kể, 158 và 85 lần, trong chồi của giống chịu hạn kém MTD720 ở điều kiện thường và xử lý ABA 10 giờ so với giống chịu hạn tốt DT51. Kết quả tương tự được quan sát ở rễ, GmHK07 tích lũy đáng kể tới 195 và 67 lần tương ứng ở giống MTD720 được xử lý ABA 0 và 10 giờ so với giống DT51. Dưới điều kiện hạn, GmHK07 cũng cho thấy sự tích lũy cao đáng kể trong cả hai mô của MTD720 so với các mô tương ứng của DT51. Như vậy, ở đậu tương, GmHK07 là nhân tố điều hòa âm tính tiềm năng không chỉ trong đáp ứng hạn mà còn trong đáp ứng với hormone ABA và có thể ứng dụng để tăng tính chống chịu stress phi sinh học ở cây trồng nhờ công nghệ gen. Từ khóa: Abscisic acid, đậu tương, GmHK07, qRT-PCR, stress phi sinh học, stress hạn. MỞ ĐẦU Hạn hán là một trong số những stress phi sinh học chính tác động đến cây trồng, hơn nữa, sự biến đổi khí hậu và sự suy giảm chất lượng nước ngọt đang làm gia tăng mối lo ngại đáng kể cho sản xuất nông nghiệp toàn cầu [‎6]. Đậu tương (Glycine max) được biết là một trong những cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao và sản xuất đậu tương mang lại lợi ích kinh tế đáng kể ở nhiều quốc gia trên thế giới do nhu cầu tiêu dùng các sản phẩm từ đậu tương đang ngày một gia tăng. Tuy nhiên, đậu tương cũng là một trong những cây trồng bị tác động đáng kể bởi hạn hán, thiệt hại lên đến 40% năng suất [‎4]. Do đó, nghiên cứu và phát triển các giống đậu tương chịu hạn thông qua kỹ thuật di truyền là một trong những chiến lược quan trọng trong phát triển nông nghiệp và bảo đảm an ninh lương thực. Để chống chịu hạn, một trong những đáp ứng sinh lý của thực vật là sự đóng mở khí khổng. Hoạt động này của tế bào khí khổng giúp điều hòa sư trao đổi khí và mất nước giữa thực vật và môi trường thông qua mạng lưới dẫn truyền tín hiệu. Cơ chế này không chỉ được biết đến như đáp ứng của thực vật với hạn thông qua sự gia tăng tích lũy hormone ABA mà còn đáp ứng với các stress phi sinh học khác như ánh sáng, mặn cũng như các stress sinh học ‎5]. Trong mạng lưới dẫn truyền tín hiệu stress, mặc dù sự phosphoryl hóa được điều khiển bởi hệ thống hai thành phần (TCS) là cơ chế chính trong sự đóng khí khổng cảm ứng bởi ABA. Tuy nhiên, vẫn không có nhiều bằng chứng về chức năng của hệ thống này trong các tế bào khí khổng [‎5]. Các thành phần thuộc hệ thống này đã được xác định ở một số loài thực vật như Arabidopsis, lúa và đậu tương bao gồm protein tiếp nhận tín hiệu (HK-histidine kinase), protein chuyển đổi gốc phospho (HP-phosphotransfer protein) và nhân tố điều hòa đáp ứng (RR-response regulator) [‎1]. Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã xác định vai trò điều hòa tiềm năng của một số thành viên họ TCS dưới điều kiện stress hạn trong những giống đậu tương khác nhau [‎12]. Do đó, để xác định vai trò của gen này trong điều hòa đáp ứng ABA và đáp ứng hạn nhằm ứng dụng cho tăng cường tính chống chịu stress phi sinh học ở đậu tương, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR định lượng để xác định mức độ biểu hiện của GmHK07 ở giống chịu hạn tốt DT51 và giống chịu hạn kém MTD720 được xử lý ABA và xử lý hạn sinh lý. Sự giảm biểu hiện đáng kể và sự tích lũy biểu hiện thấp của GmHK07 ở rễ và chồi của giống đậu tương chịu hạn kém khi xử lý ABA và dưới điều kiện hạn là cơ sở cho việc xác định vai trò điều hòa của gen này trong việc ứng dụng tạo giống đậu tương chống chịu stress hạn cũng như chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học bằng công nghệ gen. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu là hai giống đậu tương DT51 (được cung cấp từ trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ) và MTD720 (được cung cấp từ Trung tâm Nghiên cứu đậu tương, trường Đại học Cần Thơ) đã được phân tích đặc điểm sinh lý tăng trưởng trong nghiên cứu của Thu et al. (2014) [‎10]. Xử lý hormone ABA Đậu tương được trồng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 28-30oC, quang kỳ 12 giờ tối/sáng. Sau giai đoạn 12 ngày tuổi, cây con được thu nhận, rửa sạch đất và nuôi trong dung dịch ABA nồng độ 100 µM trong 0 giờ và 10 giờ (28oC, độ ẩm 60%, ánh sáng 200 µMm-2s-1). Xử lý hạn Đậu tương được trồng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 28-30oC, quang kỳ 12 giờ tối/sáng. Sau giai đoạn 12 ngày tuổi, câycon được xử lý hạn bằng cách ngừng tưới nước trong thời gian 15 ngày như nghiên cứu trước đây ‎[8-‎9,‎ 11]. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA Các mẫu rễ và chồi của hai giống từ 3 cây được xử lý stress và 3 cây đối chứng (3 mẫu sinh học) được thu nhận tách biệt và nghiền trong nitơ lỏng. RNA tổng số được tách chiết và thu nhận bằng bộ kit GenJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific), đồng thời được tinh sạch loại bỏ DNA bằng DNaseI (RapidOut DNA removal, thermo scientific). Các mẫu RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ UV-Vis (Biotek, Hoa Kỳ) và được tổng hợp cDNA một mạch từ 1 µg RNA với bộ kit tổng hợp cDNA (thermo scientific). Phân tích PCR định lượng Trình tự mồi đặc hiệu cho GmHK07 được sử dụng theo nghiên cứu của Le et al. (2011) ‎[3]. Nồng độ mồi là 0,4 µM trong thể tích phản ứng là 12,5 µl. Gen Fbox được sử dụng làm gen tham khảo để định lượng tương đối biểu hiện gen đích ‎[2]. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR định lượng là 10 phút ở 95°C, 40 chu kỳ của 95°C (15 giây) và 60°C (1 phút) (Realplex Eppendorf, Đức). Để kiểm tra số lượng sản phẩm được khuếch đại, thực hiện phân tích đường cong nóng chảy bằng cách giữ 15 giây ở 95°C trước khi gia tăng từ 60°C lên 95°C. Phương pháp delta Ct được sử dụng để so sánh tương đối mức độ biểu hiện gen các mô, và giữa các điều kiện xử lý. Trình tự và hiệu quả khuếch đại phản ứng Real-time (E) của hai cặp mồi Fbox và GmHK07 được phân tích bằng phần mềm LinRegPCR 2012.0 (bảng 1). Bảng 1. Trình tự mồi đặc trưng và hiệu quả khuếch đại của các gen được sử dụng trong phân tích qRT-PCR STT Gen Mồi xuôi (5'®3') Mồi ngược (5'®3') E 1 Fbox AGATAGGGAAATTGTGCAGGT CTAATGGCAATTGCAGCTCTC 1,9 2 GmHK07 TCTCATGCCTCATCACCAT GACCGTATTTGTTTCCCCA 1,9 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá sự biểu hiện gen GmHK07 trong mô rễ và chồi của hai giống đậu tương DT51 và MTD720 dưới điều kiện hạn và xử lý ABA Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, dựa trên sự đánh giá sinh lý rễ và chồi, chỉ số chịu hạn và hàm lượng nước tương đối, DT51 và MTD720 đã được xác định như những giống chịu hạn tốt và kém tương ứng trong số 14 giống đậu tương được khảo sát. Dựa trên hai giống đậu tương này, chúng tôi tiếp tục phân tích biểu hiện của gen GmHK07 dưới xử lý hormone ABA vốn là hormone đóng vai trò quan trọng trong điều hòa đáp ứng hạn để xác định vai trò của gen này trong sự dẫn truyền tín hiệu ABA. Kết quả cho thấy sự giảm biểu hiện của GmHK07 được quan sát trong cả mô rễ (6,4 lần) và chồi (2,5 lần) của giống đậu tương chịu hạn kém MTD720 dưới điều kiện xử lý ABA 10 giờ so với 0 giờ (hình 1A, 1B). Trong khi ở giống đậu tương chịu hạn tốt DT51, GmHK07 không có sự thay đổi biểu hiện đáng kể ở mô rễ và chồi được xử lý ABA ở 10 giờ so với 2 giờ. Kết quả cũng cho thấy rằng, có sự tương quan giảm biểu hiện của GmHK07 dưới điều kiện xử lý ABA và mức độ chống chịu hạn kém của giống đậu tương MTD720 được khảo sát. Dưới điều kiện hạn, ở mô rễ và chồi của hai giống không cho thấy sự thay đổi biểu hiện đáng kể (hình 2). Dữ liệu của Le et al. (2011) [3] cũng cho thấy sự biểu hiện của gen GmHK07 ở mô rễ của giống đậu tương Williams 82 được xử lý mất nước ở 2 giờ và 10 giờ không có sự khác biệt so với đối chứng 0 giờ, tuy nhiên ở mô chồi có sự khác biệt đáng kể 2,5 lần khi xử lý 10 giờ so với 0 giờ. Như vậy, cùng với nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận gen GmHK07 không có sự biểu hiện đáp ứng với stress ở mô rễ. Sự biểu hiện gia tăng của gen này ở mô chồi khi xử lý mất nước cho thấy sự biểu hiện của gen này là phụ thuộc mô, phụ thuộc vào giống đậu tương và phương pháp xử lý hạn. Trong cơ chế đáp ứng hạn, thực vật có hai con đường chính để dẫn truyền tín hiệu đến điều hòa biểu hiện gen đích, bao gồm con đường phụ thuộc ABA và con đường độc lập ABA [‎7]. Như vậy, dựa trên những kết quả trên, có thể xác định GmHK07 là yếu tố phụ thuộc ABA do sự biểu hiện thay đổi của nó dưới điều kiện xử lý ABA. Hình 1. Sự biểu hiện tương đối của gene GmHK07 so với Fbox ở mô rễ (a) và mô thân (b) của hai giống MTD720 và DT51 dưới điều kiện xử lý ABA 0 giờ và 10 giờ. Nồng độ ABA là 100 µM được xử lý khi cây tăng trưởng được 12 ngày tuổi. Sự biểu hiện có ý nghĩa thống kê được xác định với * (P < 0,05) và ** (P < 0,01). Hình 2. Sự biểu hiện tương đối của gene GmHK07 so với Fbox ở mô rễ (a) và mô thân (b) của hai giống MTD720 và DT51 dưới điều kiện xử lý hạn. Thời gian xử lý hạn được bắt đầu sau khi trồng 12 ngày tuổi. Sự biểu hiện có ý nghĩa thống kê được xác định với * (P < 0,05) và ** (P < 0,01). Sự tích lũy biểu hiện thấp đáng kể của gen GmHK07 trong mô rễ và chồi của giống DT51 so với mô tương ứng của giống MTD720 dưới điều kiện hạn và xử lý ABA Để xác định vai trò điều hòa tiềm năng của GmHK07, chúng tôi so sánh biểu hiện của gen này trong các mô của hai giống đậu tương có tính chịu hạn đối lập khi được xử lý ABA và xử lý hạn. Xu hướng tích lũy biểu hiện thấp trong giống đậu tương DT51 so với MTD720 đều được quan sát trong cả mô chồi và mô rễ ở hai điều kiện xử lý (bảng 2 và 3). Ở điều kiện xử lý 0 giờ, sự tích lũy của GmHK07 thấp đáng kể ở DT51 so với MTD720, tương ứng 195,3 và 157,7 lần trong mô rễ và mô chồi. Khi được xử lý ABA ở điều kiện 10 giờ, sự giảm biểu hiện của gen này ở MTD720 đã tác động đáng kể đến sự so sánh biểu hiện tích lũy khác biệt giữa hai giống. Ở mô rễ được xử lý ABA 10 giờ, DT51 có sự tích lũy thấp đáng kể 67,3 lần trong khi ở mô chồi là 85,3 lần. So sánh sự biểu hiện của GmHK07 giữa hai giống dưới điều kiện thường và hạn cũng cho thấy một xu hướng tương tự. Ở giống chịu hạn tốt DT51, dưới điều kiện thường, GmHK07 có sự tích lũy biểu hiện thấp hơn trong cả mô rễ và chồi tương ứng 97,5 và 190,9 lần so với các mô tương ứng của giống chịu hạn kém MTD720. Tương tự, dưới điều kiện hạn, mô rễ và chồi của DT51 có sự tích lũy thấp hơn MTD720 tương ứng 125,9 và 296,8 lần. Do đó, dựa trên các kết quả này, GmHK07 có thể được xem như là nhân tố điều hòa âm tính tiềm năng trong đáp ứng với stress hạn và ABA vì có sự giảm biểu hiện ở các mô của giống chịu hạn kém MTD720, đồng thời sự tích lũy của gen này cao đáng kể trong các mô của MTD720 so với DT51. Bảng 2. Sự biểu hiện khác nhau của gene GmHK07 ở mô rễ và mô chồi của giống MTD720 so với DT51 dưới điều kiện xử lý ABA 0 giờ và 10 giờ. Nồng độ ABA là 100 µM được xử lý sau khi cây được 12 ngày tuổi. Sự biểu hiện khác nhau giữa hai giống có ý nghĩa thống kê được xác định với P < 0,05 Mô xử lý Sự biểu hiện khác nhau (số lần) giữa MTD720 so với DT51 0h Giá trị P 10h Giá trị P Rễ 195,3 0,01043 67,3 0,00878 Chồi 157,7 0,00001 85,3 0,01680 Bảng 3. Sự biểu hiện khác nhau của gene GmHK07 ở mô rễ và mô thân của giống MTD720 so với DT51 dưới điều kiện xử lý hạn. Thời gian xử lý hạn được bắt đầu sau khi cây được 12 ngày tuổi. Sự biểu hiện khác nhau giữa hai giống có ý nghĩa thống kê được xác định với p < 0,05 Mô xử lý Sự biểu hiện khác nhau (số lần) giữa MTD720 so với DT51 Thường Giá trị P Hạn Giá trị P Rễ 97,5 0,00264 125,9 0,00002 Chồi 190,9 0,00039 296,8 0,00723 KẾT LUẬN Dưới điều kiện xử lý ABA và hạn, sự giảm biểu hiện GmHK07 ở các mô rễ và chồi của MTD720 cũng như sự tích lũy biểu hiện cao trong các mô của MTD720 so với DT51 cho thấy vai trò điều hòa âm tính của gen này trong cơ chế đáp ứng với hormone ABA cũng như stress hạn ở đậu tương và có thể được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền để tăng cường tính chống chịu stress thông qua nghiên cứu ức chế biểu hiện hoặc gây im lặng gen. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hwang I., Chen H. C., Sheen J., 2002. Two-component signal transduction pathways in Arabidopsis. Plant Physiol., 129(2): 500-515. Le D. T., Aldrich D. L., Valliyodan B., Watanabe Y., Ha V. C., Nishiyama R., Guttikonda S. K., Quach T. N., Gutierrez-Gonzalez J. J., Tran L-S. P., 2012. Evaluation of candidate reference genes for normalization of quantitative RT-PCR in soybean tissues under various abiotic stress conditions. PloS One, 7(9): e46487. Le D. T., Nishiyama R., Watanabe Y., Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L-S. P., 2011. Genome-wide expression profiling of soybean two-component system genes in soybean root and shoot tissues under dehydration stress. DNA Res., 18(1): 17-29. Manavalan L. P., Guttikonda S. K., Tran L-S. P., Nguyen H. T., 2009. Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in soybean. Plant Cell Physiol., 50(7): 1260-1276. Mira-Rodado V., Veerabagu M., Witthöft J., Teply J., Harter K., Desikan R., 2012. Identification of two-component system elements downstream of AHK5 in the stomatal closure response of Arabidopsis thaliana. Plant Signal. Behav., 7(11): 1467-1476. Nishiyama R., Le D. T., Watanabe Y., Matsui A., Tanaka M., Seki M., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Tran L-S. P., 2012. Transcriptome analyses of a salt-tolerant cytokinin-deficient mutant reveal differential regulation of salt stress response by cytokinin deficiency. PloS One, 7(2): e32124. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., 2007. Gene networks involved in drought stress response and tolerance. J. Exp. Bot., 58(2): 221-227. Thao N. P., Thu N. B. A., Hoang X. L. T., Ha V. C., Tran L-S. P., 2013. Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance. Int. J. Mol. Sci., 14(12): 23828-23841. Thu N. B. A., Hoang X. L. T., Doan H., Nguyen T-H., Bui D., Thao N. P., Tran L-S. P., 2014a. Differential expression analysis of a subset of GmNAC genes in shoots of two contrasting drought-responsive soybean cultivars DT51 and MTD720 under normal and drought conditions. Mol. Biol. Rep., 41(9): 5563-5569. Thu N. B. A., Nguyen Q. T., Hoang X. L. T., Thao N. P., Tran L-S. P., 2014b. Evaluation of drought tolerance of the Vietnamese soybean cultivars provides potential resources for soybean production and genetic engineering. Biomed Res. Int., 2014: 809736. Nguyễn Bình Anh Thư, Hoàng Thị Lan Xuân, Nguyễn Phương Thảo, 2014. Đánh giá sự biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã GmNAC092, GmNAC083 và GmNAC057 trong đáp ứng hạn ở hai giống đậu tu7ơng Williams 82 và MTD777-2. Tạp chí Sinh học, 36(1se): 244-249. Hoàng Thị Lan Xuân, Nguyễn Hồ Thủy Dung, Nguyễn Bình Anh Thư, Nguyễn Phương Thảo, 2014. Khảo sát sự biểu hiện của gen GmHK06 và GmRR34 dưới điều kiện thiếu nước ở hai giống đậu tương MTD777-2 và DT20. Tạp chí Sinh học, 36(1se): 232-236. EXPRESSION OF GmHK07 GENE IN RESPONSE TO ABA AND DROUGHT TREATMENTS OF DROUGHT TOLERANT (DT51) AND SUSCEPTIVE (MTD720) SOYBEAN VARIETIES Nguyen Binh Anh Thu, Doan Ngoc Hieu, Nguyen Phuong Thao International University, VNU, Hochiminh city SUMMARY Abscisic acid (ABA) is an important phytohormone involving in plant adaptation to abiotic stress. Gene expression study in response to ABA helps to identify the candidate genes for improvement of crop tolerance genetic engineering. In this study, the regulatory role of GmHK07 was investigated in two soybean varieties having contrasting phenotypes, including the drought-tolerant (DT51) and -sensitive (MTD720) phenotypes, under ABA and drought stress treatment. The qRT-PCR results of 12-day-old plants subjected to 100 µM ABA treatment showed that GmHK07 was repressed significantly in root and shoot tissues of MTD720. Besides, the expression of this gene in MTD720 shoots was 158-folds and 85-folds higher than those of DT51 at normal condition and 10 hours of ABA treatment, respectively, whereas, this expression in MTD720 roots was 195- and 67-folds higher than those of DT51. Under drought stress, high transcript of this gene was also observed in both tissues of MTD720 relative to that of DT51. Together, GmHK07 is considered as a potential negative regulator not only in drought tolerance but also in ABA response, and can be used in genetic engineering approach to enhance plant adaptation to abiotic stresses. Keywords: Abiotic stress, abscisic acid, drought, GmHK07, qRT-PCR, soybean. Ngày nhận bài: 22-10-2014