Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cỏ mực (eclipta alba) đối với vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (penaeus monodon) - Đái Thị Xuân Trang

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 261-266 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT CỎ MỰC (Eclipta alba) ĐỐI VỚI VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ RUỘT TÔM SÚ (Penaeus monodon) Đái Thị Xuân Trang*, Võ Thị Tú Anh Trường Đại học Cần Thơ, *dtxtrang@ctu.edu.vn TÓM TẮT: Dịch chiết methanol cây cỏ mực được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch ở 12 chủng vi khuẩn được phân lập từ 30 mẫu ruột tôm sú được thu thập từ 6 ao nuôi tôm tại ấp Tân Thành, xã Lợi An, huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn khi nuôi trên môi trường TCBS sau 24 giờ đều có màu vàng hoặc xanh, tế bào Gr (-). Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết được thực hiện ở các nồng độ dịch chiết là: 8, 16, 32 , 64 và 128 µg/mL. Dịch chiết cây cỏ mực thể hiện tính kháng đối với 10/12 chủng vi khuẩn đã phân lập, đạt hiệu quả ức chế cao nhất với chủng G5 ở nồng độ 8 µg/mL, đường kính vòng kháng khuẩn đạt 30,3 mm. Ba chủng vi khuẩn có kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao nhất (G5), trung bình (G2) và thấp nhất (Y1) được chọn để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa với bộ Kit API 20E và định danh bằng phương pháp Maldi toff mass và giải trình tự gen 16S rDNA. Từ các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và giải trình tự 16S rDNA cho thấy, chủng Y1 đồng hình với Enterobacter cloacae (97%), chủng G2 đồng hình với Vibrio brasiliensis (98%) và chủng G5 đồng hình với Vibrio parahaemolyticus (99%). Từ khóa: Eclipta alba, Penaeus monodon, định danh, hoạt tính kháng khuẩn, phân lập. MỞ ĐẦU Việc sử dụng các loại hoá chất và kháng sinh phòng trị bệnh cho tôm không đúng quy cách và liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới môi trường, tạo điều kiện phát sinh những dòng vi khuẩn kháng thuốc, không loại trừ khả năng các chủng vi khuẩn kháng thuốc có thể gây bệnh ở người [9]. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về các chiết xuất từ thảo dược được nghiên cứu sử dụng điều trị bệnh trên động vật thủy sản [12], hoạt tính kháng khuẩn của các loài thảo dược thường được sử dụng trong dân gian như lá tràm [5], cây cỏ mực và cây diệp hạ châu thân xanh [4], vỏ và lá trái tắc [6]. Cây cỏ mực là cây thuốc được sử dụng nhiều trong dân gian để chữa bệnh cho tôm cá, tuy nhiên, chỉ dừng ở mức kinh nghiệm, làm theo ý thích, chưa có phương pháp khoa học cụ thể cũng như chưa tìm ra liều lượng thích hợp. Vì vậy, việc nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn đường ruột tôm sú (Penaeus monodon) của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba) làm cơ sở khoa học cho những ứng dụng thảo dược trong nuôi trồng thủy sản nói chung và nghề nuôi tôm nói riêng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ba mươi mẫu tôm sú lớn có dấu hiệu nhiễm bệnh đường ruột được thu thập từ 6 ao nuôi tôm tại ấp Tân Thành, xã Lợi An, huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau. Hai mươi kilogram cây cỏ mực được thu cả rễ, thân và lá tại xã Thới Hưng, huyện Cờ Đỏ, thành phố Cần Thơ. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú Tôm được khử trùng bề mặt với cồn 75% trước khi giải phẫu lấy phần ruột. Ruột tôm được nghiền với dung dịch NaCl 0,9%, sau đó dịch nghiền được trải đều lên đĩa thạch TCBS, ủ mẫu ở nhiệt độ 32oC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc tiêu biểu được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực Quy trình chiết cao thô methanol cây cỏ mực được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) [10]. Cỏ mực sau khi thu hái được loại bỏ phần sâu bệnh, rửa sạch, phơi hoặc sấy khô ở 40°C, nghiền nhuyễn thành bột. Bột cây được chiết bằng phương pháp ngâm dầm với methanol 99,5% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết methanol được cô quay để loại bỏ dung môi dưới áp suất 200-300 mmHg thu được cao tổng. Cao tổng sau thu được trữ ở 4°C. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao methanol đối với vi khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [7, 8] với các nồng độ dịch chiết 8, 16, 32, 64 và 128 µg/mL. Dịch chiết được trích và pha loãng với methanol nên sử dụng methanol làm đối chứng âm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ dịch chiết. Kết quả kháng khuẩn của dịch chiết được xử lý thống kê bằng phương pháp ANOVA với phần mềm Minitab 16.1. Hình thái và các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm gram [1]. Ba chủng vi khuẩn được chọn khảo sát đặc điểm sinh hóa với bộ Kit API-20E (Biomerieux, Pháp) [3]. Kết quả được kiểm tra trên trang web https://apiweb.biomerieux.com/. Định danh vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn có kết quả ức chế bởi cao cây cỏ mực cao nhất, trung bình và thấp nhất được chọn định danh bằng phương pháp Maldi tof mass [11] và kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA với cặp mồi: 27F (5¢-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3¢) và 1492R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT3') [13]. Đoạn gen 16S rDNA được giải trình tự bằng phương pháp dideoxy, sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied biosystems, Hoa Kỳ). Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự trên Genbank bằng chương trình BLAST [3]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập vi khuẩn Mười hai chủng vi khuẩn phân lập được từ 30 mẫu ruột tôm sú bệnh trên môi trường TCBS có 53% có khuẩn lạc vàng (có khả năng lên men đường sucrose) và 47% có khuẩn lạc xanh (không có khả năng lên men đường sucrose) (hình 1). b a Hình 1. Vi khuẩn đường ruột tôm trên môi trường TCBS a: Chủng Y2; b: Chủng G2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ mực với các nồng độ khác nhau lên các chủng vi khuẩn phân lập được cho thấy, dịch chiết có khả năng kháng 10/12 chủng vi khuẩn đã phân lập (bảng 1). Đối với một số chủng vi khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn tăng khi tăng nồng độ dịch chiết. Đối với một số chủng, dịch chiết có khả năng ức chế ở nồng độ rất thấp (8 µg/ml) (bảng 1). Theo nghiên cứu đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ mực và cây diệp hạ châu thân xanh ở Đồng bằng sông Cửu Long, 11 loài cỏ mực khác nhau đều tác động rất mạnh trên Edwardsiella tarda (MIC=256-512 µg/ml), kế đến Edwardsiella ictaluri (MIC=512 µg/ml), Staphylococcus aureus và Aeromonas hydrophila (MIC=1024-2048 µg/ml) [4]. Như vậy, cây cỏ mực có hoạt tính kháng khuẩn với nhiều loài vi khuẩn và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng vi khuẩn đã phân lập được (MIC= 8-64 µg/ml). Hình thái và các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Tất cả 12 chủng vi khuẩn được nhận diện là G (-). Trong đó, 11 chủng vi khuẩn có tế bào dạng hình que ngắn và 1 chủng có dạng hình cầu. Kết quả định danh dựa trên đặc điểm hóasinh bằng kit API-20E được trình bày ở bảng 2. Dựa vào các đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn cho thấy, chủng Y1 có khả năng là Enterobacter cloaceae, G5 có khả năng là Vibrio cholerae, V. mimicus, V. parahaemolyticus hoặc V. vulnificus, G2 có khả năng là V. fluvialis (bảng 2). Do nhóm vi khuẩn Vibrio spp. có tính đa hình cao, hệ thống định danh khá phức tạp nên việc sử dụng đặc điểm sinh hóa khó có thể định danh chính xác đến mức loài [2]. Bảng 1. Kích thước vòng vô khuẩn ở các nồng độ khác nhau của dịch chiết cây cỏ mực STT Chủng vi khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các nồng độ dịch chiết khác nhau (µg/mL) MIC (µg/mL) 8 16 32 64 128 1 G1 0e 0e 8,3e 14,3e 24,7e 32 2 G2 21b,c 28b 30,7c 36,3c 40,3b,c £ 8 3 G3 14.3d 18,7c 33,7b,c 41b 59,7a £ 8 4 G4 23,7b 37,3a 45a 49,7a 57,3a £ 8 5 G5 30,3a 35,3a 37b 40b 41,3b £ 8 6 Y1 0e 0e 0f 0f 0g - 7 Y2 0e 11,3d 24,3d 30,7d 35d 16 8 Y3 19b,c,d 25,7b 30c 33c,d 37,3c,d £ 8 9 Y4 0e 0e 0f 0f 0g - 10 Y5 0e 0e 3,3f 12,7e 16,3f 32 11 Y6 23.7b 25,3b 29,3c 35,7c 41,3b £ 8 12 Y7 17,7c,d 28b 32c 36,3c 40,7b,c £ 8 Các giá trị trong từng cột có cùng chữ cái thì không khác biệt có ý nghĩa ở P<0,05. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp Maldi toff mass Thành phần protein của vi khuẩn được gây tủa với ethanol 96%, sau đó được tinh sạch lại với acid formic 70% và acetonitril. Dịch trích các protein được cho lên đĩa Mass và đặt vào hệ thống khối phổ kế, thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất thiết bị để đo khối lượng các đoạn peptide. Phương pháp Maldi tof mass có thể đạt mức độ tin cậy đến mức định danh loài khi chỉ số tin cậy (score value) lớn hơn 2, định danh đến mức độ giống khi chỉ số tin cậy nằm trong khoảng từ 1,8-2 và không tin cậy để định danh khi giá trị này thấp hơn 1,8. Quá trình thí nghiệm được thực hiện với hệ thống khối phổ kế tại Viện Kỹ thuật Công nghệ Kyoto, Nhật Bản. Kết quả phân loại theo thành phần proteinbằng phương pháp Maldi toff mass cho thấy 3 mẫu vi khuẩn Y1, G5 và G2 có thể lần lượt là các chủng vi khuẩn Enterobacter kobei DSM 13645T DSM (chỉ số tin cậy 2,332), V. parahaemolyticus DSM 15477 DSM (chỉ số tin cậy 2,042) và V. brasiliensis DSM 1718T HAM (chỉ số tin cậy 1,570). Giải trình tự gen 16S rDNA Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy, trình tự 16S rDNA của chủng Y1 có kích thước khoảng 1436 bp có thể là Enterobacter cloacae (97%), chủng G2 có kích thước khoảng 1448bp có thể là Vibrio brasiliensis (98%) và chủng G5 có kích thước khoảng 1448bp có thể là Vibrio parahaemolyticus (99%). Từ kết quả định danh bằng 2 phương pháp Maldi tof mass và giải trình tự 16S rDNA kết hợp với các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa có thể kết luận: chủng Y1 là E. cloacae, chủng G2 là V. brasiliensis và chủng G5 là V. parahaemolyticus. Bảng 2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn Y1, G2 và G5 Test Y1 G2 G5 Gram stain - - - b - Galactosidase (ONPG test) + - + Arginine dihydrolase + + - Lysine decarboxylase - - + Ornithine decarboxylase - - + Citrate + - - Production of H2S - - - Urease - - - Trytophan deaminase + + + Indol - + + VP test + - + Gelatin liquefaction - + + Glucose + + + Mannitol + + + Inositol + - - Sorbitol + - - Rhamnose - - - Sucrose + - - Melibiose + - - Amygdalin + + - Arabinose + + + Identification Enterobacter cloacae Vibrio fluvialis Vibrio cholerae/ V. mimicus/ V. parahaemolyticus/ V. vulnificus (+): có phản ứng; (-): không phản ứng. Các kết quả trình bày trên cho thấy, dịch chiết cỏ mực có khả năng ức chế sự phát triển của V. parahaemolycus và V. brasiliensis và không có khả năng ức chế đối với E. cloacae. Khả năng ức chế vi khuẩn của dịch chiết cỏ mực tạo tiền đề cho các nghiên cứu điều trị bệnh học thủy sản, đồng thời cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chiết xuất từ loài cây này trong bào chế dược phẩm, điều trị các trường hợp ngộ độc thực phẩm do ăn phải hải sản nhiễm khuẩn V. parahaemolycus và V. brasiliensis. KẾT LUẬN Từ 30 mẫu tôm sú thu được đã phân lậpđược 12 chủng vi khuẩn có trong đường ruột tôm trên môi trường TCBS. Dịch chiết cây cỏ mực có khả năng ức chế sự phát triển của 10/12 chủng vi khuẩn đã phân lập. Kết hợp kết quả của 3 phương pháp: kiểm tra đặc điểm sinh hóa với bộ kít API 20E, Maldi toff mass và giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy 3 chủng vi khuẩn Y1, G2 và G5 lần lượt có thể là các chủng vi khuẩn: Enterobacter cloacae, Vibrio brasiliensis và Vibrio parahaemolyticus. Lời cám ơn: Đề tài được hoàn thành với sự hỗ trợ của Bộ môn Sinh học và Bộ môn Hóa Học, Khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ. Cảm ơn GS Kaeko Kamei (Viện Kỹ thuật Công nghệ Kyoto, Nhật Bản) đã hỗ trợ thiết bị và hóa chất giúp chúng tôi hoàn thành các thí nghiệm định danh vi khuẩn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Barrow G. I., Feltham R. K. A., 1993. Covan and Steel's manual for the identification of medical bacteria, 3nd edn. Cambridge University Press, Cambridge. Chatterjee S., Haldar S., 2012. Vibrio related diseases in aquaculture and development of rapid and accurate identification methods. J. Marine Sci. Res. Dev. S1. Demucan D., Candan A., 2006. Identification of Vibrio anguillarum by PCR (rpoN Gene) associated with Vibriosis in Marine Fish in Turkey. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 30: 305-310. Huỳnh Kim Diệu, Lê Thị Loan Em, 2011. Đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ mực (Eclipta prostrate) và cây diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus niruru) ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 19a: 149-155. Huỳnh Kim Diệu, 2011. Đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của lá tràm (Melaleuca leucadendra). Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 19a: 143-148. Trịnh Hoàng Hiếu, Nguyễn Thị Thảo Trân, Lê Ngọc Thạch, 2009. Khảo sát tinh dầu vỏ trái và lá tắc, Fortunella japonica, Thumb. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệp, 12: 42-48. Huys G., Cnockaert M., Bartie K., Oanh D.T.H., Phuong N. T., Somsiri T., Chinabut S., Yusoff F., Shariff M., Giacomini M., Bertone S., Swings J., Teale A., 2005. Intra- and interlaboratory performance of antibiotic disk diffusion susceptibility testing of bacterial control strains of relevance for monitoring aquaculture environments. Diseases of Aquatic Organisms, 66: 179-204. Đỗ Thị Thúy Nga, 2011. Qui trình thao tác chuẩn về thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh - Tiêu chuẩn đọc kết quả kháng sinh đồ và MIC. GARP-Việt Nam. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Minh Hậu, Nguyễn Thanh Phương, 2004. Thiết lập bộ sưu tập vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Chloramphenicol tại khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. Tạp chí Nghiên cứu khoa học 2: 76-81. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Jackson, Lay O., 2001. Maldi Tof Mass spectrometry of bacteria. Division of chemistry, national centerfor toxicological research, foodand drug administration, 3900 NCTR road, Jefferson, Arkansas. Nguyễn Thế Vương, 2009. Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Trường Đại học Nông lâm Huế. Weisburg W. G., Barns S. M., Pelletier D. A., Lane D. J., 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol., 173: 697-703. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE METHANOLIC EXTRACTS OF Eclipta alba AGAINST BACTERIA IN INTESTINAL TRACT OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Dai Thi Xuan Trang, Vo Thi Tu Anh Can Tho University SUMMARY Antibacterial activity of the methanolic extracts of Eclipta alba were carried out by the disc diffusion method on 12 strains of bacteria isolated from 30 samples of tiger shrimp (intestines) collected from shrimp farms in Tan Thanh hamlet, An Loi commune, Tran Van Thoi district, Ca Mau province. All strains isolated were grown for 24h on TCBS agar plates at 30°C in yellow colony or green colony. Antibacterial activity assay of the extract was carried out in the concentration of 8 µg/mL, 16 µg/mL, 32 µg/mL, 64 µg/mL and 128 µg/mL. The extract of Eclipta alba were tested against 10 bacterial strains were isolated. The highest antibacterial potentiality was exhibited by the methanolic extract of E. alba with G5 strain, means of zones of bacterial growth inhibition are 30,3mm. Three of twelve isolates (Y1, G2, G5) were chosen to examine the biochemical characteristics with the API 20E Kit and identified by two method: Maldi toff mass and sequencing 16S rDNA using primers pair 27F (5¢-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3¢) and 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). The results showed that Y1 isolate was similarity of 97% with E. Cloacae; G2 isolate was similarity of 98% with V. brasiliensis and G5 isolate was similartty of 99% with V. Parahaemolyticus. Keywords: Eclipta alba, Penaeus monodon, antibacterial activity, methanolic extracts. Ngày nhận bài: 22-10-2014