Khảo sát hoạt độ enzyme protease thu nhận từ bacillus subtilis cố định trong gel alginate

Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate 108 KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME PROTEASE THU NHẬN TỪ BACILLUS SUBTILIS CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE Trần Hồng Thắng*, Trần Thị Duân Hải*, Nguyễn Huỳnh Thanh Phong* Nguyễn Thị Tình*, Hồ Bảo Xuyên*, Nguyễn Văn Dũng* TÓM TẮT Thu nhận enzyme từ tế bào vi sinh vật cố định trong chất mang là một hướng mới trong công nghệ sản xuất enzyme. Đề tài được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng sản xuất enzyme protease từ tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis được cố định trong gel Alginate, đồng thời, khảo sát một số điều kiện tinh sạch và hoạt động của enzyme protease thu nhận được từ các tế bào được cố định. Kết quả của đề tài cho thấy nồng độ Alginate thích hợp với việc cố định tế bào B. subtilis là 2%, thời gian nuôi cấy tế bào vi khu n được cố đ ào vi sinh vật cố định sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ riêng enzyme protease giảm 50% hoạt tính. Enzyme protease thu nhận được có hoạt độ riêng cao nhất khi được tinh sạch bằng dung môi Acetone và điều kiện hoạt động t i ưu của enzyme protease là ở nhiệt độ 40oC và pH 7. Từ khóa: tế bào cố định; protease; Bacillus subtilis; Alginate. CHARACTERIZATION OF PROTEASE ACTIVITY FROM BACILLUS SUBTILIS CELLS IMMOBILIZED IN ALGINATE GEL ABSTRACT Enzyme from immobilized cells is the new approach for enzyme production technology. This paper aimed to evaluate the ability of enzyme production from Bacillus subtilis immobilized in alginate beads and determine optimum conditions for enzyme activity. The results showed that optimum concentration of alginate for immobilizing cells was 2% in 24h. Protease enzyme from immobilized cells reduce 50% specific activity after 4 batches. Enzyme protease, purified by acetone solvent show the highest activity. Optimum temperature and pH for enzyme activity is 40 o C and pH 7. Keywords: immobilized cell, protease, bacillus subtilis, alginate. I. GIỚI THIỆU Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng rộng rãi phục vụ cho đời sống, trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dệt may, dược phẩm. Protease có thể thu nhận từ các nguồn: thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong đó, vi sinh vật là nguồn cho protease phong phú nhất. Một số loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như B. subtilis, B. cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus và Aspergillus oryzae, Aspergillus niger(Lượng, 2004). định tế bà đang đ đi m trong vi c lên men sản xuất protease. Vì protease là một enzyme ngoại bào, nên có thể được áp dụng trong việc cố định tế bào. Bằng cách cố định các tế bào vi khuẩn trong các chất nền, protease được sinh tổng hợp trong môi trường nuôi cấy. Điều này làm cho quá trình sản xuất protease bằng các tế bào cố định ổn định hơn trong thời gian dài, dễ dàng tinh sạch * Trường Đại học Công nghiệp TPHCM Tạp chí Đại học Công nghiệp 109 được enzyme nằm chủ yếu trong môi trường lỏng còn tế bào được giữ lại trong các chất nền (Kumar và Takagi, 1999). Alginate thường được sản xuất dưới dạng các dẫn xuất của muối tan như sodium alginate, potassium alginate. Khi các muối này được cho tiếp xúc với các ion kim loại đa hóa trị như Ca2+, Zn2+, Pb 2+ các ion kim loại đa hóa trị sẽ thay thế các ion ban đầu trong phân tử alginate hình thành liên kết ngang giữa các lớp trong cấu trúc mạng phân tử alginate và tạo thành cấu trúc gel. Trong ngành công nghệ thực phẩm, ion Ca 2+ được sử dụng làm tác nhân tạo gel alginate vì hầu hết ion còn lại có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khoẻ của người sử dụng và có khả năng gây độc cho vi khuẩn, nấm men (Nghĩa, 1996). B. subtilis có khả năng tiết enzyme protease trên môi trường nuôi cấy để phân giải các chất dinh dưỡng có trong môi trường nhằm cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Để phát hiện và đánh giá khả năng hoạt hóa của enzyme protease được tiết bởi B. subtilis ta dùng môi trường gelatin nghèo chất dinh dưỡng để kích thích chúng sản sinh protease. Mục tiêu của bài báo này nhằm đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease của chủng B. subtillis tại phòng sinh hóa trên chất nền là gel alginate được cố dịnh bằng dung dịch CaCl2. II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Vi sinh vật Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường giữ giống có thành phần bao gồm (trên 1L môi trường): cao thịt (10), peptone (10), NaCl (5), dung dịch A (5ml), sacharose (10), agar (20), thêm nước cất cho đủ 1L. Thành phần dung dịch A bao gồm: MgSO4.7H2O (1.15g), MnSO4.4H2O (0.28g), được hòa tan trong 100mL nước cất. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh trong môi trường lỏng có thành phần cao thịt (10g), peptone (10g), NaCl (5g), dung dịch A (5ml), sacharose (10g), thêm nước cất đủ 1000ml. Chủng B. subtillis được nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) trong 24 giờ trong 100mL môi trường tăng sinh. Sau khi tăng sinh, chủng vi sinh vật được cấy điểm vào môi trường gelatin và ủ ở 37oC trong 48 giờ để đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme protease (Clarke, 1953). Mỗi chủng được cấy ra ba đĩa, và đo đường kính vòng phân giải trong từ đĩa để đánh giá khả năng sinh enzyme. Cố định vi sinh vật bằng gel Alginate 100mL dung dịch tăng sinh B. subtillis được nuôi cấy lắc trong 24 giờ, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi, thu sinh khối. Sinh khối tế bào B. subtillis được rửa lại bằng KCl vô trùng, nước cất vô trùng (lặp lại ba lần) và huyền phù toàn bộ sinh khối với 100mL nước muối sinh lý đã hấp khử trùng (Adinarayana, Jyothi, và Ellaiah, 2005). Pha loãng 1mL dung dịch huyền phù tế bào trong nước muối sinh lý vào 100mL môi trường thu nhận protease bổ sung Sodium Algiante ở nồng độ xác định. Toàn bộ hỗn hợp được tạo hạt bằng dung dịch CaCl2 0,25M. Hạt gel tạo thành được để ổn định trong dung dịch CaCl2 trong 1 giờ rồi rửa lại bằng nước muối sinh lý và nước cất vô trùng (ba lần). Các hạt gel tạo thành được nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) sử dụng môi trường thu nhận protease trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Dịch tăng sinh thu nhận được sử dụng cho các thí nghiệm sau. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B. subtillis cố định Môi trường thu nhận protease (100mL) được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate 110 các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và 5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm) trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng dung dịch CaCl2 0,25M. Hình 1. Chủng B. subtilis nuôi trên đĩa petri (trên) và được nhuộm gram (dưới). Các hạt tế bào B. subtillis cố định được nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Mẫu B. subtillis tự do cũng được nuôi cấy ở mốc thời gian trên. Enzyme protease thu nhận được từ các thí nghiệm trên được xác định hoạt độ dựa trên khả năng phân giải casein. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình. Khảo sát độ rò rỉ tế bào từ hạt gel Môi trường thu nhận protease (100mL) được bổ sung chất mang Sodium Alginate ở các nồng độ khác nhau (1%, 2%, 3%, 4% và 5%) được hấp khử trùng (121oC và 1atm) trong 30 phút. Môi trường tiệt trùng được bổ sung huyền phù vi sinh vật và tạo hạt gel bằng dung dịch CaCl2 0,25M. Các hạt tế bào B. subtillis cố định được nuôi cấy lỏng lắc (120 vòng/phút) trong 24h ở nhiệt độ phòng. Lọc bỏ hạt gel, thu lại dịch lọc, dịch lọc được lọc thêm một lần nữa bằng giấy lọc để loại bỏ thành phần gel Alginate bị vỡ trong quá trình nuôi cấy. Sinh khối trong dịch lọc được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi (Adinarayana et al., 2005). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng B. subtillis cố định qua các mẻ nuôi cấy B. subtillis được cố định trong gel alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình môi trường thu nhận protease 100ml (mẻ 1), sau 24 giờ tiến hành chuyển hạt gel từ mẻ 1 sang môi trường thu nhận mới (mẻ 2). Enzyme protease trong môi trường cũ được thu nhận và khảo sát hoạt tính protease và hàm lượng protein. Tiếp tục thực hiện cho các mẻ sau cho đến khi hoạt độ của mẻ cuối cùng bằng 50% hoạt độ của mẻ 1. Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme protease B. subtillis được cố định trong gel alginate 2%, các hạt gel được đưa vào bình môi trường thu nhận protease 100ml và nuôi cấy trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được loại bỏ hạt gel và ly tâm để thu dịch chiết enzyme. Dịch chiết enzyme được kết tủa bằng cồn 96o và Acetone ở 4oC theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 (Vdịch chiết:Vdung môi), lắc đều và để lạnh trong 60 phút; ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 Tạp chí Đại học Công nghiệp 111 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu nhận kết tủa, kết tủa được huyền phù bằng nước cất vô trùng. Dịch thu được là dịch enzyme thô được đánh giá hoạt độ protease và hàm lượng protein. Khảo sát điều kiện hoạt động của enzyme protease Enzyme thô thu nhận từ quá trình tăng sinh tế bào vi sinh vật cố định được khảo sát ở các nhiệt độ (30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC) và pH (6, 7, 8, 9) để tìm điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme này. Xác định hoạt độ enzyme protease theo Anson Hoạt độ protease được xác định dựa trên khả năng phân giải protein (casein) của protease. Dịch enzyme (1mL) được cho phản ứng với 5mL dung dịch casein 1% trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 35oC. Sau 30 phút, ngừng phản ứng enzyme bằng 10mL dung dịch TCA 5% và đem lọc thu dịch. Dịch lọc thu được (2mL) được bổ sung 0,5mL thuốc thử Folin và đem đo mật độ quang ở bước sóng 720nm. Dựa vào đường chuẩn tyrosine (dung dịch tyrosine chuẩn 20mM) để xác định lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm được thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt độ của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt độ enzyme protease. Một đơn vị hoạt độ enzyme protease là lượng enzyme trong một phút ở 300C có khả năng phân giải protein tạo thành sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic, có độ hấp thụ quang ở bước sóng 720nm tương đương với 1µmol tyrosine (Cupp-Enyard, 2008). Các thí nghiệm được thực hiện ba lần và tính giá trị trung bình. Xác định hàm lượng protein theo Bradford Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Comassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Dịch mẫu (1mL) được bổ sung thêm 5mL thuốc nhuộm Comassie Brilliant Blue và đem đo mật độ quang ở bước song 595nm. Dựa vào đường chuẩn protein (dung dịch Albumin chuẩn 0,1%) để xác định hàm lượng Albumin tương ứng với lượng protein có trong dịch mẫu (Kruger, 1994). Các thí nghiệm được thực hiện ba lần và lấy giá trị hoạt độ trung bình. Xử lý số liệu thống kê Các số liệu được xử lý theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA. III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Khả năng phân giải protein của chủng B. subtillis Vòng phân giải gelatin nhằm định tính khả năng phân giải protein của chủng B.subtilis. Sau 48 giờ ủ và tiến hành thử bằng thuốc thử HgCl2 thu được đường kính trung bình của vòng phân giải là 3cm. Từ kết quả này cho thấy chủng B. subtilis của chúng tôi có khả năng phân giải protein gelatin trên môi trường bán rắn. Vòng phân giải có đường kính trung bình khoảng 3cm, trong khi khuẩn lạc chỉ nằm ngay giữa đĩa petri, điều này cho thấy chủng B. subtilis cần một cơ chế để có thể sử dụng gelatin ở môi trường ngoại bào, một trong các cơ chế đó chính là khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào đặc trưng của chủng B. subtilis trong đó có enzyme protease. Như vậy qua các vòng phân giải trên môi trường gelatine có thể xác nhận khả năng sinh tổng hợp protease của chủng B. subtillis. Hình 2. Vòng phân giải gelatin của chủng Bacillus subtilis. Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate 112 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào B. subtillis cố định Để đánh giá độ ổn định của hạt gel alginate, tế bào vi khuẩn B. subtillis được cố định ở các nồng độ alginate khác nhau (1, 2, 3, 4 và 5%) và nuôi cấy trong môi trường cảm ứng sinh enzyme protease trong 24 giờ. Khối lượng sinh khối khô và hoạt độ riêng của enzyme protease ở các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả ở Hình 3 cho thấy nồng độ alginate sử dụng cho việc cố định tế bào vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và mức độ rò rỉ của tế bào ra môi trường. Từ các dữ liệu cho thấy protease thu nhận từ chủng B. subtillis cố định có hoạt độ cao nhất ở nồng độ Alginate 2% sau 24 giờ nuôi trong môi trường sinh tổng hợp protease đạt (27.458 UI/mg) và giảm dần ở các nồng độ alginate khác (3%, 4% và 5%). Điều này cho thấy khi tăng dần nồng độ alginate sẽ làm giảm cấu trúc xốp của hạt gel, từ đó giới hạn khả năng cung cấp dinh dưỡng và khả năng khuếch tán của oxy từ môi trường tới tế bào vi sinh vật. Như vậy nồng độ 2% của Alginate là tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp protease của chủng B. subtillis cố định. Mức độ rò rỉ tế bào từ hạt gel Alginate được thể hiện trong Hình 3, độ rò rỉ tế bào sẽ giảm dần khi ta tăng dần nồng độ alginate từ 1% lên 5%. B. subtillis được cố định trong gel Alginate không hoàn toàn nằm sâu bên trong hạt mà sẽ có một lượng tế bào nằm gần lớp vỏ alginate có cấu trúc lỗ xốp, vì vậy lượng B. subtilis nằm gần bên ngoài sẽ có khả năng thoát ra khỏi hạt gel. Vì vậy, khi nồng độ alginate càng thấp thì số lượng tế bào thoát ra ngoài sẽ càng nhiều do nồng độ alginate càng thấp thì sẽ làm cấu trúc của alginate càng lỏng lẻo và cấu trúc lỗ xốp càng lớn. Hình 3. Hoạt độ riêng protease (UI/mg) của enzyme protease theo nồng độ Alginate và mức độ rò rỉ tế bào ở 24h. Kết quả này là phù hợp so với một số nghiên cứu trước đây, (Zoe và cộng sự ,2006) đã sử dụng alginate nồng độ từ 2% đến 3,5% để cố định B. subtillis sinh tổng hợp amylase cao gấp 2,5 lần amylase thu nhận từ các chủng tự do (Konsoula và Liakopoulou-Kyriakides, 2006). Đồng thời, nghiên cứu của Adinarayana và cộng sự (2004) cũng thu nhận được kết quả tương từ nhưng ở nồng độ alginate tối ưu thu nhận được là 3% (Adinarayana, Bapi Raju và Ellaiah, 2004). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng B. subtillis cố định qua các mẻ nuôi cấy Chủng B. subtillis cố định được nuôi cấy thu nhận enzyme protease theo mẻ (24 giờ cho mỗi mẻ) ở nồng độ alginate tối ưu. Kết quả thu nhận được cho thấy hoạt độ riêng của enzyme protease thu nhận được giảm dần theo từng mẻ, và đến mẻ thứ 4, hoạt độ riêng (11,359 UI/mg) chỉ đạt 50% so với hoạt độ ở mẻ ban đầu (25,331 UI/g). Tuy nhiên khi so sánh hàm lượng protein qua từng mẻ nhận thấy hàm lượng protein giảm ít và ổn định qua từng mẻ Hình 4. Sở dĩ hoạt tính, hàm lượng và hoạt độ riêng đều giảm dần qua các mẻ có thể là do chủng B. subtilis qua mỗi mẻ sẽ yếu dần làm Tạp chí Đại học Công nghiệp 113 giảm khả năng phân giải các chất dinh dưỡng và sinh tổng hợp enzym protease nên kết quả giảm dần. Như vậy, khi sử dụng tế bào vi sinh vật đã được cố định bằng hạt gel Aginate qua 4 lần nuôi cấy mẻ thì hoạt độ riêng của enzyme giảm còn 50% so với lần đầu tiên, đây chính là hướng ứng dụng mang lại ưu điểm vượt trội so của enzyme do tế bào cố định tao thành so với enzyme tự do. Hình 4. Sự biến thiên hàm lượng, hoạt độ riêng của enzyme protease ở các mẻ khi nuôi tế bào cố định. Khảo sát điều kiện tinh sạch enzyme protease Enzyme protease thu nhận được tinh sạch thành enzyme bán tinh khiết bằng dung môi hữu cơ (cồn 96o và acetone) ở các tỷ lệ khác nhau. Kết quả thu nhận được thể hiện ở Hình 5 cho thấy hoạt độ riêng của các enzyme bán tinh khiết ở từng phương pháp tinh sạch đều cao hơn so với hoạt độ riêng của enzyme protease thô ban đầu. Kết quả cho thấy acetone có khả năng tinh sạch enzyme protease tốt hơn so với cồn tuyệt đối ở các tỷ lệ thay đổi từ 1:1 đến 1:4, khi tinh sạch bằng acetone ở tỷ lệ 1:2 thì thu được enzyme bán tinh khiết có hoạt độ cao nhất (196.042 UI/mg) tăng 52% so với enzyme thô. Trong khi đó, khi tinh sạch bằng cồn tuyệt đối, hoạt độ enzyme bán tinh khiết cao nhất thu nhận được ở tỷ lệ 1:3 (136.498 UI/mg tăng 30% so với enzyme thô). Nguyên nhân của kết quả trên có thể là do acetone có khả năng tương tác với nước bằng phản ứng dehydrat hóa, làm giảm lượng nước liên kết với các phân tử protein. Trong khi đó ethanol là dung môi có khả năng dehydrat hóa protein mạnh hơn acetone. Điều này làm cho nó dễ dàng gây biến tính protein, kể cả những protein không phải là protease. Việc làm biến tính protease và những protein tạp khác không phải là protease dẫn đến hàm lượng protein cao nhưng hoạt tính lại thấp, kết quả là hoạt độ riêng và hiệu suất thu hồi hoạt tính cũng thấp (Hình 5). Hình 5. Hoạt độ riêng của enzyme protease ở các điều kiện tinh sạch khác nhau. Khảo sát điều kiện hoạt động của enzyme protease Từ kết quả và đồ thị cho thấy protease của B.subtilis hoạt động mạnh nhất ở 40oC. Vượt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme sẽ giảm dần từ 50oC đến 70oC, đặc biệt là ở khoảng từ nhiệt độ 60oC đến 70oC, hoạt tính giảm mạnh. Nguyên nhân có thể là do ở nhiệt độ 40oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích của enzyme protease, nó giúp thúc đẩy enzyme hoạt động, làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme - cơ chất, vì vậy tại nhiệt độ này protease cho hoạt tính cao nhất. Từ nhiệt độ 40 oC trở lên, hoạt tính protease giảm dần là do khi vượt quá khoảng nhiệt độ tối thích (40oC), enzyme sẽ dần bị biến tính và mất hoạt tính phân giải. Đồng thời, khi nhiệt độ càng tăng Khảo sát hoạt độ Enzyme Protease thu nhận từ Bacillus Subtilis cố định trong gel Alginate 114 cao thì sự biến tính enzyme sẽ càng tăng làm cho hoạt tính enzyme protease càng giảm thấp và không có khả năng phục hồi hoạt tính. Do đó, hoạt tính protease giảm dần từ 40oC xuống 70 oC. Ở nhiệt độ 30oC, protease cho hoạt tính thấp là do nhiệt độ này chưa đạt đến khoảng nhiệt độ tối thích để thúc đẩy sự hoạt động của enzyme, enzyme còn bị ức chế một phần nên hoạt tính của protease tại nhiệt độ này còn thấp. Từ kết quả và biểu đồ cho thấy pH 7 là pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme protease ở chủng B.subtilis cố định. Còn ở các mốc pH còn lại thì tại pH 6 cho hoạt tính enzyme thấp nhất, tại pH 8 và pH 9 thì hoạt tính enzyme giảm dần, nhưng vẫn cao hơn so với pH 6. Hình 6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt độ riêng của enzyme protease. Kết quả trên có thể giải thích như sau: pH 7 cho hoạt tính protease cao nhất là do đây là khoảng pH phù hợp, giúp tăng khả năng hoạt động của các nhóm chức ở trung tâm hoạt động của protease. Ở pH 6 protease có hoạt tính thấp có thể do đây là điểm pH gần điểm đẳng điện của protease vì phần lớn enzyme - protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid nên enzyme có xu hướng bị kết tủa và biến tính do pH đẳng điện làm giảm khả năng hòa tan của enzyme, điều này làm cho hoạt tính protease tại pH 6 rất thấp. Ở khoảng pH từ 8 – 9, protease cũng cho hoạt tính giảm dần. Điều này có giải thích là do tại pH kiềm độ phân ly của các nhóm chức hoạt động của protease bị hạn chế và phần nào ảnh hưởng đến hoạt tính phân giải cơ chất của protease. IV. KẾT LUẬN Đề tài đã cho thấy khả sử dụng tế bào vi khuẩn B. subtilis cố định để thu nhận enzyme protease ở nồng độ algiante thích hợp là 2%. Trong thời gian nuôi cấy 24 giờ, các tế bào B. subtilis cố định cho protease có hoạt độ riêng cao nhất là 24 giờ, còn ở B. subtilis tự do là 48 giờ. Sau 4 lần tái sử dụng, hoạt độ enzyme do tế bào B. subtilis cố định giảm 50% so với ban đầu, điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng tế bào vi sinh vật cố định trong thực tế. Đồng thời enzyme protease của chủng cố định có hoạt độ riêng cao hơn so với chủng tự do, từ đó có thể thấy enzyme protease từ chủng cố định tinh sạch hơn so với chủng tự do. Tác nhân kết tủa tốt nhất để thu protease là acetone ở tỉ lệ thể tích dịch chiết enzyme: thể tích acetone là 1:2. Nhiệt độ thích hợp để protease cho hoạt tính cao nhất là 40oC và pH thích hợp là pH 7. Tạp chí Đại học Công nghiệp 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adinarayana, K., Bapi Raju, K. V. V. S. N., & Ellaiah, P. (2004), "Investigations on alkaline protease production with B. subtilis PE-11 immobilized in calcium alginate gel beads", Process Biochemistry, 39(11), 1331-1339. doi: 10.1016/s0032-9592(03)00263-2 2. Adinarayana, K., Jyothi, B., & Ellaiah, P. (2005), "Production of alkaline protease with immobilized cells of Bacillus subtilis PE-11 in various matrices by entrapment technique", AAPS PharmSciTech, 6(3), E391-397. doi: 10.1208/pt060348 3. Clarke, S. K. (1953), "A simplified plate method for detecting gelatine-liquefying bacteria", J Clin Pathol, 6(3), 246 - 248. 4. Cupp-Enyard, C. (2008). Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate, J Vis Exp(19). doi: 10.3791/899 5. Konsoula, Z., & Liakopoulou-Kyriakides, M. (2006), "Thermostable α-amylase production by Bacillus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules", Enzyme and Microbial Technology, 39(4), 690-696. doi: 10.1016/j.enzmictec.2005.12.002 6. Kruger, N. (1994), "The Bradford Method for Protein Quantitation, In J. Walker (Ed.)", Basic Protein and Peptide Protocols (Vol. 32, pp. 9-15): Humana Press. 7. Kumar, C. G., & Takagi, H. (1999), "Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint", Biotechnol Adv, 17(7), 561-594. 8. Lượng, N. Đ. (2004), Công nghệ Enzyme Việt Nam, NXB Giáo dục. 9. Nghĩa, N. Đ. (1996), Nghiên cứu cấu trúc và tính chất tạo gel của acid alginic tách ciết từ một số loài rong mơ Việt Nam, Paper presented at the Hội nghị hóa học Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Bách khoa Hà Nội.