Khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp hPDGF-BB (Human platelet-derived growth factor BB) tái tổ hợp từ chủng pichia pastoris - Dương Long Duy

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 255-260 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP hPDGF-BB (HUMAN PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR BB) TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Pichia pastoris Dương Long Duy, Phạm Minh Vũ, Nguyễn Trí Nhân, Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: hPDGF-BB (human platelet-derived growth factor BB) là nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiều cầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình lành hóa vết thương đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) chỉ định điều trị biến chứng lở loét chi ở bệnh nhân đái tháo đường. Với mục tiêu sản xuất lượng lớn rhPDGF-BB nhằm mục đích điều trị bệnh và nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện lên men mẻ bổ sung (fed-batch) trong bồn lên men 1 lít để sản xuất hPDGF-BB tái tổ hợp (rhPDGF-BB) từ chủng Pichia pastoris X33::pdgf-b tái tổ hợp mang đa bản sao gen mã hóa cho hPDGF-BB. Quá trình lên men mẻ bổ sung được tiến hành qua ba giai đoạn: mẻ glycerol, bổ sung glycerol và bổ sung methanol (cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu). Giai đoạn mẻ và bổ sung glycerol tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 30oC và pH 5,0. Giai đoạn bổ sung methanol nhằm cảm ứng biểu hiện protein được khảo sát ở hai giá trị nhiệt độ 25oC và 30oC, và ba giá trị pH 3,5; 5,0 và 6,5. Kết quả cho thấy, cảm ứng biểu hiện ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau không ảnh hưởng nhiều đến sức sống của chủng tái tổ hợp. Cảm ứng biểu hiện rhPDGF-BB đạt sản lượng cao nhất, 686,69 mg/l, ở điều kiện nhiệt độ 30oC và pH 6,5 - cao gấp 7,63 lần so với nuôi cấy lắc. Từ khóa: Pichia pastoris, bồn lên men 1 lít, lên men mẻ bổ sung, rhPDGF-BB MỞ ĐẦU Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (Platelet-derived growth factor - PDGF) là một yếu tố phân bào được sản xuất chủ yếu từ tiểu cầu và giữ nhiều chức năng trong cơ thể như tham gia điều hòa quá trình phát sinh và phát triển của cơ quan, hệ thần kinh, đặc biệt là thúc đẩy làm lành vết thương [2]. Năm 1997, PDGF-BB được tổ chức FDA (Food and Drug Administration) cấp phép sử dụng điều trị chứng loét chân do đái tháo đường [9]. Tại Việt Nam, việc điều trị chứng bệnh này rất tốn kém do nguồn thuốc điều trị phải nhập khẩu với giá thành cao. Đồng thời, việc sản xuất và ứng dụng PDGF để điều trị chứng loét chân do đái tháo đường cũng như phát triển thành các dược phẩm và mỹ phẩm chưa được nghiên cứu rộng rãi trong nước. Vương Cát Khánh và nnk. (2014) [4] đã công bố thu nhận thành công dòng nấm men Pichia pastoris X33::pdgf-b mang 16 bản sao gen mã hóa cho PDGF-B có khả năng tiết nhân tố PDGF-BB ra môi trường nuôi cấy dưới sự cảm ứng của methanol. Tuy nhiên, việc khảo sát điều kiện lên men sinh tổng hợp hPDGF-BB bằng các hệ thống fermentor nhằm hướng đến sản xuất protein ở quy mô pilot vẫn chưa được tiến hành. Theo James (2007) [7], quá trình lên men P. pastoris biểu hiện protein tái tổ hợp ở quy mô pilot có thể được tiến hành theo phương pháp mẻ bổ sung (fed-batch) và cần được khảo sát thực nghiệm riêng cho từng loại protein. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện nhiệt độ và pH cho quá trình lên men sinh tổng hợp rhPDGF-BB của chủng P. pastoris X33::pdgf-b bằng hệ thống bồn lên men 1 lít. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng nấm men tái tổ hợp: chủng nấm men tái tổ hợp P. pastoris X33::pdgf-b được tạo dòng từ chủng hoang dại với kiểu hình Mut+ được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử & Môi trường, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh [4]. Lên men mẻ bổ sung (fed-batch): chủng P. pastoris X33::pdgf-blưu trữ ở -80oC được hoạt hóa trong 50 ml môi trường BMGY (cao nấm men 1%, peptone 2%, 100 mM đệm phosphate pH 6,0) ở 25oC trong 24 giờ, OD600 đạt khoảng 2,0-6,0. Cấy chuyền 50 ml dịch hoạt hóa vào bồn lên men 1 lít (LiFlus GX, Biotron, Hàn Quốc) có chứa 450 ml môi trường BSM (1 lít môi trường gồm: 26,7ml H3PO4 85%, 0,93g CaSO4, 18,2g K2SO4, 14,9g MgSO4.7H2O, 4,13g KOH và 40g glycerol) đã bổ sung khoáng vi lượng PTM1 (1 lít gồm: 6,0g CuSO4.5H2O, 0,08g NaI, 3,0g MnSO4.H2O, 0,2g Na2MoO4.2H2O, 0,02g H3BO3, 0,5g CoCl2, 20,0 g ZnCl2, 65,0 g FeSO4.7H2O, 0,2g biotin và 5,0 mL H2SO4). Tiến hành lên men mẻ ở điều kiện nhiệt độ 30oC, pH 5,0, DO ≥ 10%, pH được điều chỉnh bằng NH4OH 25% và H3PO4 85%. Khi chủng tiêu thụ hết glycerol, glycerol 50% được bổ sung thêm với tốc độ 18,15 ml/l/giờ trong 4 giờ. Sau đó, methanol được bổ sung với tốc độ 3,6 ml/l/giờ trong 5 giờ đầu đến 7,2 ml/l/giờ trong 3 giờ tiếp theo và chuyển sang 10,9 ml/l/giờ cho đến hết quá trình lên men nhằm cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu. Tiến hành khảo sát điều kiện cảm ứng biểu hiện hPDGF-BB lần lượt ở nhiệt độ 25oC, 30oC kết hợp với các giá trị pH 3,5, 5,0, 6,5. Dịch lên men được thu nhận sau mỗi 4 giờ, ly tâm thu dịch nổi để tiến hành phân tích. Phân tích sự biểu hiện protein hPDGF-BB bằng SDS-PAGE và Western blot: dịch nổi được tiến hành điện di trên gel tricine SDS-PAGE 10% và chuyển thẩm protein lên màng lai HybondTM (Amersham, Anh) để thực hiện lai western với kháng thể đa dòng kháng hPDGF-BB (R&D Systems, Hoa Kỳ) và kháng thể kháng IgG của thỏ cộng hợp với horseradish peroxidase HRP (Abcam, Anh). Hiện phim bằng bộ Kit ECL (Amersham, Anh). Định lượng protein hPDGF-BB: nồng độ protein tổng có trong dịch lên men được xác định bằng phương pháp Bradford [6]. Phân tích kết quả điện di trên gel SDS-PAGE bằng phần mềm ImageJ để xác định lượng hPDGF-BB. So sánh lượng hPDGF-BB thu được giữa các mẻ và chọn ra điều kiện lên men tốt nhất. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng tăng trưởng của chủng P. pastoris X33::pdgf-b khi lên men ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau Nhiệt độ và pH của môi trường là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên năng suất tiết protein của P. pastoris. Việc giảm nhiệt độ xuống dưới 30oC đã được nhiều báo cáo chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến việc sản xuất protein ở P. pastoris, trong đó dãy nhiệt độ khảo sát thường từ 20oC đến 30oC [1]. P. pastoris có khả năng tăng trưởng ở dãy pH rộng từ 3,0 đến 7,0 và việc thay đổi pH không ảnh hưởng nhiều đến tốc độ tăng trưởng của chúng, tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy việc thay đổi pH môi trường ảnh hưởng lớn đến mức độ sản xuất protein và giảm thiểu tác động của các enzyme protease [8]. Trong nghiên cứu này, quá trình cảm ứng biểu hiện rhPDGF-BB đã được khảo sát tại 2 điểm nhiệt độ là 25oC và 30oC đồng thời kết hợp 3 giá trị pH môi trường 3,5; 5,0 và 6,5. Đây là các giá trị đã được đề nghị bởi nhà sản xuất Invitrogen (Mỹ) và được xây dựng dựa trên các khảo sát về dãy nhiệt độ và pH cho quá trình sinh trưởng của chủng P. pastoris [7]. Dịch lên men được thu nhận sau mỗi 4 giờ sau đó ly tâm để xác định sinh khối tươi (WCW). Dựa vào đồ thị (hình 1) ta thấy quá trình sinh trưởng của nấm men ở các nghiệm thức khác nhau là ổn định và có độ đồng đều. Kết thúc giai đoạn tăng trưởng trên nguồn carbon chủ yếu là glycerol thể hiện ở khoảng 20-24 giờ đầu, lượng sinh khối tươi ở các mẻ đạt tương đương với khoảng 180-210g/l của nhà sản xuất Invitrogen đưa ra. Điều này chứng tỏ việc nhân nhanh lượng sinh khối P. pastoris X33::pdgf-b để sử dụng cho bước cảm ứng biểu hiện tiếp theo đã diễn ra thành công. Giai đoạn thứ hai, chủng cần thời gian để tổng hợp các thành phần cần thiết cho việc sử dụng methanol như nguồn carbon duy nhất, do đó hầu như chủng không tăng trưởng thêm. Thời gian đáp ứng đối với methanol còn tùy thuộc vào điều kiện sinh lý của chủng. Sau đó, khi chủng sử dụng methanol là nguồn carbon duy nhất, đồng thời promoter AOX1 được kích hoạt, gen mục tiêu được biểu hiện và tiết protein mục tiêu ra ngoài. Kết thúc 72 giờ cảm ứng biểu hiện bằng methanol, lượng sinh khối tươi của các mẻ thu được nằm trong khoảng 414-470g/l. Giá trị này tương đương với khoảng đề nghị do nhà sản xuất Invitrogen đề ra (350-450 g/l) chứng tỏ quá trình sinh trưởng và trạng thái sinh lý của chủng Pichia pastoris X33::pdgf-b trong các thí nghiệm của chúng tôi đã diễn ra bình thường và tương đồng với chuẩn của nhà sản xuất cũng như tương tự một số nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp khác trên hệ thống P. pastoris [7 , 10]. Hình 1. Đồ thị lượng sinh khối tươi theo giờ ở các điều kiện lên men khác nhau. Hình 2. Kiểm tra sự biểu hiện rhPDGF-BB ở các điều kiện lên men khác nhau (chú thích bên trên hình) bằng (a) điện di gel tricine SDS-PAGE 10%; và (b) lai Western với kháng thể đặc hiệu cho hPDGF-BB. (LMW: Low Molecular Weight, thang trọng lượng phân tử thấp). Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành quan sát dịch lên men dưới kính hiển vi quang học để xem xét khả năng tạp nhiễm trong quá trình lên men. Kết quả cho thấy dịch lên men không bị tạp nhiễm mặc dù quá trình lên men dài ngày và môi trường nuôi cấy không hề bổ sung kháng sinh hay các chất kháng nấm. Có thể là do môi trường BSM chỉ gồm khoáng, glycerol và nguồn nitrogen cung cấp cho chủng tăng trưởng được lấy từ NH4OH dùng để điều chỉnh pH trong quá trình nuôi cấy. Mặt khác, ở giai đoạn cảm ứng biểu hiện, methanol là chất độc đối với phần lớn các vi sinh vật khác, chính vì vậy đã giúp hạn chế được sự tạp nhiễm. Kiểm tra sự biểu hiện rhPDGF-BB Kết quả điện di gel tricine SDS-PAGE 10% các mẫu dịch nổi mỗi 12 giờ sau khi cảm ứng ở (hình 2a) cho thấy tại vị trí tương ứng với vạch 30kDa của thang chuẩn có xuất hiện một vạch protein to và đậm tương ứng với trọng lượng biểu kiến của protein hPDGF-BB vào khoảng 25kDa và có sự biểu hiện các protein tạp khác nhau khi thay đổi điều kiện pH cảm ứng. Kích thước vạch protein to đậm này tuy lớn hơn kích thước biểu kiến của hPDGF-BB nhưng lại phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu sản xuất rhPDGF-BB trên các hệ thống biểu hiện nhân thực khác như nấm men S. cerevisiae hay nấm ăn Pleurotus eryngii [11, 2]. Trong khi đó, điều kiện nhiệt độ dường như không ảnh hưởng nhiều tới thành phần tạp. Cụ thể, ở điều kiện pH 3,5 và 5,0 đều cho những vạch protein tạp phần lớn có kích thước trên 30kDa. Kích thước này gần tương đương trọng lượng protein biểu kiến tính toán dựa trên tình tự amino acid (khoảng 24,5kDa), và tương đương với trọng lượng các protein rhPDGF-BB thu được từ các hệ thống biểu hiện khác [3, 5, 11]. Ở điều kiện pH 6,5, các protein tạp kích thước khoảng 43kDa đến 94kDa giảm đáng kể, tuy nhiên lên men ở 25oC lại cho nhiều protein tạp dưới 30kDa hơn. Một điểm thú vị đó là vạch protein rhPDGF-BB ở pH 3,5 có kích thước lớn hơn có thể do protein mục tiêu bị glycosyl hóa mức độ cao hơn khi lên men ở pH thấp, làm tăng trọng lượng phân tử. Quá trình glycosyl hóa này cũng góp phần làm thay đổi kích thước phân tủ hPDGF-BB sản xuất bằng hệ thống P. pastoris so với hPDGF-BB sản xuất từ vi khuẩn như E. coli thường có kích thước nhỏ hơn 30kDa [5]. Tuy nhiên cần tiến hành thêm các bước phân tích khác để xác định mức độ glycosyl hóa và sự ảnh hưởng lên hoạt tính của protein mục tiêu. Để khẳng định các vạch protein trên là rhPDGF-BB, chúng tôi tiến hành lai Western với kháng thể đặc hiệu cho hPDGF-BB. Kết quả lai Western (hình 2b) cho thấy, trên bảng phim xuất hiện tín hiệu dương tính chứng tỏ chúng tôi đã cảm ứng biểu hiện thành công hPDGF-BB bằng phương pháp lên men mật độ cao dưới sự cảm ứng của methanol. Hình 3. Đồ thị lượng protein tiết tổng số theo giờ của các mẻ lên men trong quá trình cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu Bảng 1. Nồng độ protein tổng số và lượng protein rhPDGF-BB có trong dịch lên men sau 72 giờ cảm ứng giữa các mẻ Điều kiện lên men 30oC 25oC pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5 pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5 Lượng protein tổng số (mg/l) 1104,4 1174,7 1204,3 583,3 997,3 1319,9 Tỷ lệ hPDGF-BB(%) 54,83 48,35 57,02 44,03 44,63 34,12 Lượng hPDGF-BB (mg/l) 605,54 567,97 686,69 256,83 446,18 450,35 Xác định lượng protein hPDGF-BB được tiết ra Lượng protein tiết tổng số của các mẻ lên men tại các thời điểm mỗi 12 giờ sau khi cảm ứng (hình 3) ở các điều kiện lên men nhiệt độ 30oC, dường như không có sự khác biệt lớn giữa các pH cảm ứng khác nhau và nằm trong khoảng 1100 - 1200 mg/l (bảng 1). Trong khi đó, ở điều kiện 25oC, có sự khác biệt lớn về lượng protein tiết ra, thấp nhất là ở pH 3,5 với 583,3 mg/l, tiếp theo là pH 5,0 với 997,3 mg/l và cao nhất là ở pH 6,5 1319,9 mg/l. Lượng tiết ở điều kiện 25oC pH 6,5 lại không chênh lệch nhiều so với ở 30oC pH 6,5 và đều cao hơn so với nuôi cấy ở những pH thấp hơn. Điều đó chứng tỏ, khi hạ nhiệt độ lên men kết hợp với hạ thấp pH của môi trường đã làm giảm lượng protein tiết ra bên ngoài mặc dù không làm ảnh hưởng nhiều đến khả năng sinh trưởng của chủng. Ghi nhận hình ảnh và phân tích lượng rhPDGF-BB có trong mẫu 72 giờ của tất cả 6 mẻ lên men được điện di trên cùng một miếng gel SDS-PAGE bằng phần mềm ImageJ (Viện nghiên cứu Sức khỏe Quốc gia, Hoa Kỳ). Kết quả cho thấy, ở điều kiện nhiệt độ 30oC, độ tinh sạch cao hơn hẳn so với ở điều kiện 25oC và điều kiện lên men 30oC và pH 6,5 cho độ tinh sạch cao nhất với 57,02% tương ứng với lượng hPDGF-BB cao nhất 686,69 mg/l, cao gấp 7,63 lần so với nuôi cấy lắc (bảng 1). Trong khi đó, cùng điều kiện pH 6,5 nhưng khi hạ nhiệt độ từ 30oC xuống 25oC thì lượng rhPDGF-BB lại giảm xuống còn 450,35 mg/l. Lên men ở điều kiện pH 3,5 và nhiệt độ 25oC cho lượng hPDGF-BB thấp nhất 256,83 mg/l. Theo một số nghiên cứu, việc nuôi cấy P. pastoris ở pH thấp và nhiệt độ thấp sẽ hạn chế sự tiết protease ra môi trường, làm tăng sản lượng protein mục tiêu [1, 7, 8]. Tuy nhiên trong trường hợp này, khi lên men ở nhiệt độ thấp và pH thấp, lượng protein mục tiêu lại giảm hẳn so với điều kiện nhiệt độ cao hơn và pH cao hơn. KẾT LUẬN Khả năng tăng trưởng của chủng Pichia pastoris X33::pdgf-b không bị ảnh hưởng nhiều khi lên men ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau. Chủng nấm men tái tổ hợp đã biểu hiện thành công rhPDGF-BB tái tổ hợp dưới dạng tiết ra môi trường nuôi cấy khi lên men mật độ cao ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau dưới sự cảm ứng bởi methanol. Việc cảm ứng biểu hiện ở pH 3,5 có thể làm tăng mức độ glycosyl hóa đối với protein hPDGF-BB. Lên men ở điểu kiện nhiệt độ 30oC và pH 6,5 cho lượng hPDGF-BB cao nhất 686,69 mg/ml với độ tinh sạch cao nhất 57,02%. Độ tinh sạch cao giúp cho việc tinh chế thu nhận hPDGF-BB được dễ dàng hơn. Mặt khác khi lên men ở 30oC sẽ giúp giảm bớt chi phí cho việc làm mát so với lên men ở 25oC. Lời cảm ơn: nghiên cứu được thực hiện từ nguồn kinh phí của đề tài nghiên cứu khoa học cấp Sở KH&CN Tp. HCM “Nghiên cứu tạo yếu tố tăng trưởng tái tổ hợp từ tiểu cầu (Platelet-derived growth factor-PDGF) nhằm điều trị loét bàn chân đái tháo đường” (số hợp đồng: 219/2013/HĐĐH-SKHCN). TÀI LIỆU THAM KHẢO Anasontzis G. E. et al., 2014. Effects of temperature and glycerol and methanol-feeding profiles on the production of recombinant galactose oxidase in Pichia pastoris. Biotechnol Prog., 30(3): 728-735. Heldin C. H., Westermark B., 1999. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiological Reviews, 79(4): 1283-1316. Choi Jun-Hui et al., 2011, Expression and production of therapeutic recombinant human platelet-derived growth factor-BB in Pleurotus eryngii. Applied Biochemistry and Biotechnology, 165(2): 611-623. Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh, Đặng Thị Phương Thảo, Trần Linh Thước, 2014. Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB mức độ cao. Tạp chí Sinh học, 36(1se): 77-83. Nagaraju K. et al., 2007. Simple, Rapid, High-Purity Preparation of Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor-BB. Biotechnology Letters, 29(9): 1333-1339. Noble J. E., Bailey M. J. A., 2009. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology, 463(8): 73-95. James M. C., 2007. Pichia protocols. Humana Press, USA, 5-6. Pınar Ç. et al., 2010. Influence of pH on recombinant human growth hormone production by Pichia pastoris. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 85(12): 1628-1635. Rožman P., Bolta Z., 2007. Use of platelet growth factors in treating wounds and soft-tissue injuries. Acta Dermatovenerologica Alpina, Panonica Et Adriatica, 16(4): 156-165. Thomas I. P. et al., 2010. Antibody Expression Kinetics in Glycoengineered Pichia pastoris. Biotechnology and Bioengineering, 106(6): 918-927. Wang Y. et al., 2009. High-level Secretory Production of Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor-Bb by Saccharomyces Cerevisiae Under the Non-Selective Conditions. Applied Biochemistry and Microbiology, 45(2): 156-161. OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT hPDGF-BB IN Pichia pastoris Duong Long Duy, Pham Minh Vu, Nguyen Tri Nhan, Tran Linh Thuoc, Dang Thi Phuong Thao University of Science, VNU - HCM city SUMMARY hPDGF-BB (human Platelet-derived Growth Factor BB) is a growth factor that plays an important role in wound healing. It is indicated for treatment of foot ulcers in diabetic patients by FDA. Besides that, hPDGF-BB also stimulates the recruitment and proliferation of a variety of cell types, including bone cells and mesenchymal stem cells, and used to enhance bone graft. In order to produce rhPDGF-BB for therapeutic purposes, we conducted the research on production of rhPDGF-BB in Pichia pastoris. In this study, we applied the fed-batch fermentation in 1-liter scale including glycerol batch, glycerol fed-batch and induction the expression of rhPDGF-BB by feeding methanol. The induction stage was carried out at different temperature (25oC, 30oC) and different pH (3.5; 5.0; 6.5). The result showed that fermentation at different temperature and different pH did not affect the growth of the recombinant Pichia pastoris X33::pdgf-b clone. Induction at low temperature and low pH will decrease the amount of secreted protein. Fermentation at 30oC and pH 6.5 produced the highest amount of rhPDGF-BB with 686.69 mg/l which was 7.63-fold higher than that of shake flask batch culture. Keywords: Pichia pastoris, fed-batch, one-liter fermenter, rhPDGF-BB. Ngày nhận bài: 22-10-2014